植酸酶phyA基因的密碼子優(yōu)化及其在大豆中的表達(dá)

寇瑩瑩 宋英今 楊少輝王潔華

天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 天津 300072

植酸酶phyA基因的密碼子優(yōu)化及其在大豆中的表達(dá)

寇瑩瑩 宋英今 楊少輝*王潔華

天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 天津 300072

植酸是植物源食品中的主要抗?fàn)I養(yǎng)成分, 降低植酸含量可有效提高大豆的營養(yǎng)利用率。本文根據(jù)大豆密碼子使用偏好性, 對無花果曲霉植酸酶 phyA基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化, 人工合成了適合在大豆中表達(dá)的 phyA(b)基因。以pCAMBIA3301為骨架, 構(gòu)建由大豆凝集素基因啟動子和信號肽序列調(diào)控的植物表達(dá)載體pCBPS-phyA(b)。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化吉林35大豆子葉節(jié)。PCR檢測表明目的基因已初步整合至大豆基因組中; bar試紙條表明所有陽性植株中均能檢測到 bar基因的蛋白產(chǎn)物; 除草劑葉片涂抹顯示野生型的葉片出現(xiàn)黃化或枯萎現(xiàn)象, 而轉(zhuǎn)基因植株葉片表現(xiàn)正常, 具除草劑抗性; 以半定量RT-PCR共篩選到13株轉(zhuǎn)phyA和19株轉(zhuǎn)phyA(b)陽性轉(zhuǎn)基因大豆植株。通過對轉(zhuǎn)基因大豆T3種子中植酸酶活性、無機(jī)磷和植酸磷含量等檢測, 證明人工基因phyA(b)比phyA在大豆種子中所表達(dá)的植酸酶具有更高的活性, 說明密碼子優(yōu)化有利于提高外源基因的表達(dá)。

大豆; phyA基因; 密碼子優(yōu)化; 遺傳轉(zhuǎn)化

植酸(phytic acid, PA), 又稱肌醇六磷酸, 是植物種子中磷的主要儲存形式[1]。植酸有12個(gè)可解離的氫原子, 極易與礦質(zhì)元素(如磷、鈣、鐵、鋅、鎂等)和蛋白質(zhì)(如淀粉酶、脂肪酶等)螯合形成難溶性物質(zhì), 是影響植物源食品中礦質(zhì)元素和蛋白質(zhì)吸收的主要抗?fàn)I養(yǎng)成分[2]。植酸酶(phytase)是催化植酸及其鹽類分解成肌醇和無機(jī)磷酸鹽的一類磷酸酶, 可以將磷、鈣、鎂等礦物元素和肌醇從植酸鹽中釋放出來, 可解除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用[3]。

20世紀(jì)90年代開始, 有關(guān)植酸酶植物基因工程的研究已有很多報(bào)道, 如大豆、油菜、木豆、玉米等[4-10]很多植物中都表達(dá)了重組的真菌植酸酶。2008年, Chen等[8]利用玉米種子特異性globulin-1啟動子,將黑曲霉phyA基因轉(zhuǎn)化玉米, 轉(zhuǎn)基因玉米種子中植酸酶的表達(dá)為2200 U kg-1, 比對照增加了近50倍。2009年和2011年, Li等[4]和Yang等[5]分別將根特異啟動子pyk10和組成型啟動子35S-35S調(diào)控下的無花果曲霉植酸酶(Aspergillus ficuum 3.4322) phyA基因轉(zhuǎn)化大豆, 結(jié)果表明phyA可以在大豆中表達(dá), 表現(xiàn)出較高的植酸酶活性[4-5]。

植酸的生物合成可能發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,然后轉(zhuǎn)運(yùn)至蛋白體, 最后在液泡中積累[11]。高等植物細(xì)胞中, 細(xì)胞質(zhì)的pH值(一般為7.0～7.5)高于液泡內(nèi)的 pH值(一般為 5.5), 目前鑒定的各種來源的植酸酶中, 除百合花粉植酸酶外, 均為酸性植酸酶,最適pH值在2～6之間, 如大腸桿菌appA植酸酶最適pH值為4.5, 無花果曲霉植酸酶phyA最適pH為5.5[12]。所以, 利用液泡定位表達(dá)信號肽, 如大豆凝集素基因信號肽, 將外源植酸酶定位至液泡中, 可能會更好地提高植酸酶活性, 降低種子內(nèi)的植酸水平。Coello等[11]將大腸桿菌的植酸酶appA基因連同一段液泡定位表達(dá)信號肽序列, 在胚特異性啟動子的控制下轉(zhuǎn)化擬南芥, 在轉(zhuǎn)基因植株干種子中檢測到植酸酶的活性, 且內(nèi)部植酸的水平有所降低, 無機(jī)磷酸鹽的含量相對提高。

生物體內(nèi)普遍存在同義密碼子非均衡使用的現(xiàn)象, 這種現(xiàn)象會導(dǎo)致外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)量降低。使用轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)偏愛密碼子是提高外源基因表達(dá)水平的一種有效手段[11]。陳惠等[13]根據(jù)畢赤酵母偏愛密碼子, 將來源于黑曲霉 N25的植酸酶基因phyA改造, 結(jié)果表明密碼子優(yōu)化的酵母轉(zhuǎn)化子中植酸酶活性為對照的 2倍。目前, 有些植物中利用密碼子優(yōu)化的外源基因已獲得了重組蛋白高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株[14-17], 但還未見有通過人工優(yōu)化真菌植酸酶基因, 提高受體植物植酸酶表達(dá)水平的報(bào)道。

本研究根據(jù)大豆密碼子偏好性, 對無花果曲霉phyA基因優(yōu)化改造, 以原始 phyA基因和人工phyA(b)基因分別轉(zhuǎn)化大豆, 通過轉(zhuǎn)基因植株后代種子植酸酶活性、無機(jī)磷和植酸磷含量等檢測, 以驗(yàn)證密碼子優(yōu)化合成的植酸酶基因的正確性及在大豆中的表達(dá)效率, 并為種子特異性表達(dá)植酸酶獲得低植酸大豆奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α、根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404、 載 體pCAMBIA3301由本實(shí)驗(yàn)室保存。無花果曲霉(Aspergillus ficuum 3.4322) phyA基因由南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李明剛教授提供。大豆品種吉林35由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。各種限制性內(nèi)切酶、連接酶等分子生物學(xué)操作試劑購自TaKaRa公司。激素、抗生素等生化試劑購自Sigma公司。所用培養(yǎng)基及其成分參見文獻(xiàn)[4-5]。

1.2 無花果曲霉phyA基因的密碼子優(yōu)化

利用CUTG網(wǎng)站http：//www.kazusa.or.jp/codon/,查找大豆密碼子頻率的相關(guān)數(shù)據(jù), 選用1207個(gè)基因CDS (495 060 codons)分析大豆中每個(gè)氨基酸的密碼子頻率, 獲得大豆密碼子使用情況表。通過在線密碼子分析軟件 Graphical Codon Usage Analyser (http：//gcua.schoedl.de/), 分析無花果曲霉(Aspergillus ficuum 3.4322)植酸酶phyA基因(登錄號為AF537344)在大豆中表達(dá)時(shí)每一密碼子的使用頻率, 在保證氨基酸序列完整性的前提下, 按照大豆對密碼子的偏好性特點(diǎn), 優(yōu)化設(shè)計(jì)phyA序列, 交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成全序列。

1.3 植物特異性表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI公布的大豆凝集素(Le3)基因啟動子和信號肽序列(登錄號為 EU070415), 設(shè)計(jì)特異性引物, 以大豆基因組DNA為模板, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收, 與T-Vector pMD19連接, 獲得克隆載體pMD19-Le3PS, 測序驗(yàn)證。以pCAMBIA3301為骨架, 利用In-Fusion HD EcoDry Cloning Plus kits (TaKaRa), 將大豆凝集素基因啟動子和信號肽序列(Le3PS)和植酸酶基因串聯(lián)在一起, 構(gòu)建植物胚特異性表達(dá)載體pCBPS-phyA和pCBPS-phyA(b), 篩選標(biāo)記為草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(phosphinothricin acetyltransferase, bar)(圖1)。

圖1 植物表達(dá)載體pCBPS-phyA和pCBPS-phA(b)Fig. 1 Structure of the plant expression vectors pCBPS-phyA and pCBPS-phyA(b)

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)法進(jìn)行大豆遺傳轉(zhuǎn)化[4-5]。將已構(gòu)建好的植物表達(dá)載體 pCBPS-phyA和pCBPS-phyA(b), 通過電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。大豆干種子經(jīng)氯氣滅菌后, 無菌水浸泡8～10 h, 切取子葉節(jié)并在農(nóng)桿菌菌液中浸泡15 min;取出外植體并轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基; 28℃暗培養(yǎng)2～3 d后, 將外植體轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含 50 mg L-1Basta); 培養(yǎng) 2周后, 轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基; 繼代 2～3次, 待抗性芽長至約3 cm左右時(shí), 將其剪下插入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根, 根長2 cm左右時(shí)馴化移栽。

1.5 轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定

1.5.1 PCR檢測 采用Plant DNA Isolation Reagent (TaKaRa)提取大豆苗基因組DNA, phyA基因引物為phyA-F： 5′-ATGCTGGCAGTCCCCGCCTCG-3′和phyA-R： 5′-CTAAGCAAAACACTCCGC-3; phyA(b)基因引物為 phyA(b)-F： 5′-ATGCTTGCAGTTCCTG CTTC-3′和 phyA(b)-R： 5′-CTAAGCAAAACACTCC GCCCA-3′。PCR反應(yīng)條件為95℃ 5 min; 95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 80 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃ 5 min。

1.5.2 轉(zhuǎn)基因檢測試紙條法 取少量葉片放入1.5 mL EP管中, 研碎后加入0.1 mL抽提液并攪拌均勻, 將LibertyLink (bar)試紙條插入混合液, 5 min后觀察結(jié)果。

1.5.3 除草劑葉片涂抹法 100 mg L-1Basta中加入0.1%的Tween-20, 用毛筆涂抹植株的半片葉子,另半片葉子用記號筆標(biāo)記作為對照, 3～5 d后觀察葉片反應(yīng)。

1.5.4 半定量 RT-PCR檢測 采用 MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa)提取葉片總RNA, PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用半定量RT-PCR分析外源基因的表達(dá)情況。phyA基因引物為 phyA-F： 5′-ATGCTGGCAGTCCCCG CCTCGAG-3′和 phyA-R： 5′-GGCTGAGCACGAGG ATCC-3′。phyA(b)基因引物為phyA(b)-F： 5′-ATGCT TGCAGTTCCTGCTTCTAG-3′和phyA(b)-R： 5′-GGC TGAGCTCTAGGATCT-3′。內(nèi)參基因 Actin (登錄號為V00450.1)引物為Actin-F： 5′-CTCAACCCAAAG GTCAACAG-3′和Actin-R： 5′-TCTAGGGCAACATA TGCAAG-3′。

1.6 轉(zhuǎn)基因大豆種子中植酸酶活性、PA和Pi含量的測定

參照 Bilyeu等[10]方法分析植酸酶活性, 一個(gè)植酸酶活性單位被定義為每分鐘每毫克蛋白釋放無機(jī)磷的μmol數(shù)。參照Chen等[8]的三氯化鐵比色法測定植酸(PA)含量; 參照Dorsch等[18]的鉬藍(lán)比色法測定無機(jī)磷(Pi)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 phyA基因的密碼子優(yōu)化

利用CUTG和Graphical Codon Usage Analyser對大豆密碼子使用頻率和無花果曲霉 phyA密碼子使用情況分析比較(圖2)。

由圖2可以看出, 有6個(gè)密碼子在大豆中表達(dá)時(shí)偏好性較強(qiáng), 表達(dá)效率小于 50%, 很可能影響產(chǎn)物表達(dá)。如編碼精氨酸Arg的CGG (29%)、CGC (45%)和CGT (45%), 編碼脯氨酸Pro的CCG (27%), 編碼絲氨酸Ser的TCG (36%)和編碼纈氨酸Val的GTC (46%)。為實(shí)現(xiàn)無花果曲霉植酸酶基因phyA在大豆中的高效穩(wěn)定表達(dá), 在氨基酸序列保持不變的前提下, 替換上述6個(gè)密碼子, 將CGC、CGG和CGT替換為AGA, CCG替換為CCT, TCG替換為TCT, GTC替換為GTT, 共改變85個(gè)堿基, 涉及76個(gè)密碼子,改變率為 16.93%。新基因 G+C含量更靠近大豆內(nèi)源基因G+C含量, 由55.7%下降至49.8%, 比原始含量降低了 5.9%。改造后的 phyA(b)基因具有大豆基因的密碼子特征。

2.2 抗性植株的獲得及轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定

轉(zhuǎn)化的大豆品種吉林 35經(jīng)過抗性芽誘導(dǎo)、伸長、生根和移栽等一系列過程(圖3), 獲得T0代Basta大豆抗性苗 58株, 其中轉(zhuǎn) phyA基因抗性苗 25株,轉(zhuǎn)phyA(b)基因抗性苗33株。對抗性苗基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 13株轉(zhuǎn) phyA基因大豆和 19株轉(zhuǎn)phyA(b)基因大豆中能檢測到 1350 bp的目的片段,說明目的基因已初步整合至大豆基因組中(圖 4-A);使用PAT/bar轉(zhuǎn)基因試紙條對上述PCR陽性植株進(jìn)一步檢測表明所有植株中均能檢測到 bar基因的蛋白產(chǎn)物(圖 4-B); 除草劑葉片涂抹試驗(yàn)表明, 野生型對照的葉片出現(xiàn)黃化或枯萎現(xiàn)象, 而轉(zhuǎn)基因大豆植株葉片表現(xiàn)正常, 呈現(xiàn)除草劑抗性(圖4-C)。

2.3 轉(zhuǎn)基因大豆的半定量RT-PCR檢測

提取 T0轉(zhuǎn)基因大豆葉片的總 RNA, 反轉(zhuǎn)成cDNA進(jìn)行RT-PCR分析(圖5), 結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)基因植株能夠擴(kuò)增出大小一致但亮度不一的目的條帶, 野生型對照沒有出現(xiàn)相應(yīng)條帶, 表明外源基因在轉(zhuǎn)基因大豆體內(nèi)可以正常表達(dá), 不同植株體內(nèi)外源基因的表達(dá)水平不同。選取外源基因表達(dá)量高的植株,包括轉(zhuǎn)phyA基因的A2、A8、A9株系和轉(zhuǎn)phyA(b)基因的b2、b6和b8株系的T3代, 測定植酸酶活性、無機(jī)磷和植酸磷含量。

圖2 大豆密碼子使用頻率(黑色)和無花果曲霉phyA基因密碼子使用頻率(紅色)Fig. 2 Comparison of codon usage frequency of soybean (black) and that of phyA gene in Aspergillus ficuum (red)

2.4 轉(zhuǎn)基因大豆T3代種子植酸酶活性檢測

根據(jù)RT-PCR結(jié)果, 分別測定3個(gè)轉(zhuǎn)phyA基因和3個(gè)轉(zhuǎn)phyA(b)基因的T3代大豆種子中的植酸酶活性、無機(jī)磷和植酸磷含量(表1)。結(jié)果表明, 與野生型相比, 3個(gè)轉(zhuǎn)phyA基因株系和3個(gè)轉(zhuǎn)phyA(b)基因株系的T3種子中植酸酶活性均有顯著提高。而且,轉(zhuǎn) phyA(b)基因株系的植酸酶活性普遍高于轉(zhuǎn) phyA基因株系, 表明密碼子優(yōu)化有利于提高外源基因的表達(dá)。在轉(zhuǎn)phyA基因株系中, AL8-3的植酸酶活性最高, 為91 μmol mg-1min-1; 在轉(zhuǎn)phyA(b)基因株系中, bL6-1的植酸酶活性最高, 達(dá)到 116 μmol mg-1min-1, 比AL8-3提高了27.48%。

與野生型相比, 3個(gè)phyA(b)株系和3個(gè)phyA株系T3代種子中的植酸磷含量顯著降低, 無機(jī)磷含量顯著提高, 總磷含量變化不明顯。其中轉(zhuǎn)phyA(b)基因株系bL6-1的植酸磷含量為1.36 μg mg-1, 僅為野生型4.83 μg mg-1的28.16%, 比AL8-3的2.11 μg mg-1降低了 35.55%; bL6-1株系無機(jī)磷含量比野生型對照凈增6.9倍, 達(dá)4.11 μg mg-1, 是AL8-3株系的1.24倍。

此外, 試驗(yàn)表明各株系植酸酶的含量與各自的外源基因表達(dá)水平(半定量RT-PCR結(jié)果)相關(guān), 表達(dá)量越高的植株, 植酸酶活性也越高, 相應(yīng)其植酸含量降低的也越明顯。對照和 6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的植酸酶活性為 bL6-1＞bL8-2＞bL2-3＞AL8-3＞AL9-5＞AL2-2＞W(wǎng)T。推斷轉(zhuǎn)基因植株中植酸酶活性受到外源植酸酶基因表達(dá)水平的影響, 增加植株體內(nèi)的植酸酶活性, 降低種子中的植酸含量。本試驗(yàn)中, 人工基因phyA(b)比未改造的phyA基因在大豆種子中所表達(dá)的植酸酶具有更高的活性, 表明密碼子優(yōu)化有利于提高外源基因的表達(dá)。

圖3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化流程Fig. 3 Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node as explantsA： 共培養(yǎng)2 d的外植體; B： 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)2周; C： 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)4周; D： 芽伸長培養(yǎng); E： 抗性芽生根; F： 移栽后的轉(zhuǎn)基因植株。A： explants at two days after co-culture; B： adventitious bud at two weeks after selection on shoot induction (SI) medium; C： adventitious bud at four weeks after selection on SI medium; D： shoot elongation (SE) on medium; E： rooting of the resistant shoot; F： transgenic plants in pots.

圖4 T0代轉(zhuǎn)基因植株的鑒定Fig. 4 Identification of T0transgenic plantsA： PCR檢測; M： DNA marker; 1和11： 野生型對照; 2和12： 質(zhì)粒對照; 3～10,11～20： 轉(zhuǎn)基因植株; B： bar轉(zhuǎn)基因試紙條檢測。CK：野生型; 1～3： 轉(zhuǎn)基因植株; C： 除草劑涂抹鑒定. CK： 野生型; 1～3：轉(zhuǎn)基因植株。A： PCR detection. M： DNA marker; 1： wild type; 2： plasmid; 3-10：transgenic plants; B： LibertyLink strip test. CK： wild type plants; 1-3： transgenic plants; C： test of herbicide resistance on leaf.

圖5 T0代抗性植株phyA或phyA(b)基因的RT-PCR檢測結(jié)果Fig. 5 RT-PCR analysis of phyA or phyA(b) gene of T0transformed soybean plantsA： 轉(zhuǎn)pCBPS-phyA載體; B： 轉(zhuǎn)pCBPS-phyA(b)載體; 1： 野生型; 2～9： 部分轉(zhuǎn)化植株。A： transformation with pCBPS-phyA vector; B： transformation with pCBPS-phyA(b) vector; 1： wild type; 2-9： transgenic plants.

表1 轉(zhuǎn)基因大豆T3種子的植酸酶活性、植酸磷和無機(jī)磷含量性狀分析Table 1 Phytase activity, Pi, and phytate content of transgenic soybean T3seeds

3 討論

在長期的進(jìn)化過程中, 對于一個(gè)特定氨基酸的同義密碼子, 不同物種會形成不同的偏愛性。由于外源基因與轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)在密碼子偏愛上的不同,經(jīng)常造成外源基因難以有效翻譯。因此, 適當(dāng)?shù)貙⑼庠椿虻拿艽a子替換成為受體系統(tǒng)偏愛的密碼子,可以提高外源基因在該系統(tǒng)中的表達(dá)水平[14-17]。近幾年來, 雖然關(guān)于密碼子優(yōu)化的研究多為在大腸桿菌或酵母中的異源表達(dá), 但在玉米、水稻、番茄等植物中, 也有成功報(bào)道。Jabeen等[16]研究表明, 密碼子優(yōu)化的cry1Ab基因在植物原生質(zhì)體中的表達(dá)水平提高了4～6倍。Tang等[19]以密碼子優(yōu)化的Cry1A(c)基因轉(zhuǎn)化水稻, 轉(zhuǎn)基因水稻葉片中 Cry1A(c)蛋白含量達(dá)到 1.38 μg g-1, 田間和室內(nèi)抗蟲實(shí)驗(yàn)都顯示對鱗翅目害蟲有很好的毒殺效果。上述研究為我們探討優(yōu)化改造無花果曲霉植酸酶基因, 提高轉(zhuǎn)基因大豆中植酸酶的活性, 提供了參考依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)按照無花果曲霉 phyA蛋白的氨基酸序列和大豆偏愛密碼子, 優(yōu)化并人工合成了phyA(b)基因, 轉(zhuǎn) phyA(b)基因株系 bL6-1的植酸酶活性比轉(zhuǎn)phyA基因的AL8-3株系提高了27.48%, 植酸磷含量降低了 35.55%, 無機(jī)磷含量增加并達(dá)到 AL8-3的1.24倍。證明本試驗(yàn)采取的優(yōu)化并改造密碼子提高外源基因表達(dá)水平的策略有效, 為優(yōu)化改造微生物基因轉(zhuǎn)化植物的研究奠定了基礎(chǔ), 并豐富了植物轉(zhuǎn)基因分子育種的基因資源。

基因工程育種的目的是不改變植物原有優(yōu)良性狀, 并獲得相應(yīng)的目的性狀。植酸在種子發(fā)育和萌發(fā)過程中具有非常重要的生理作用。2006年, Nunes等[20]利用RNAi技術(shù)敲除GmMIPS1表明, 阻斷植酸的生物合成會對種子萌發(fā)產(chǎn)生顯著的副作用。種子貯藏蛋白基因啟動子(如大豆凝集素基因啟動子)的轉(zhuǎn)錄功能具有顯著的組織和發(fā)育時(shí)期特異性, 僅在種子成熟過程的中期至后期指導(dǎo)其下游基因的表達(dá)[11]。Bilyeu等[10]將大腸桿菌植酸酶 appA基因置于大豆凝集素基因啟動子的調(diào)控下轉(zhuǎn)化大豆, appA基因在發(fā)育中的子葉細(xì)胞質(zhì)中高水平表達(dá)。因此, 本試驗(yàn)將phyA和phyA(b)基因連同一段液泡定位表達(dá)信號肽序列(大豆凝集素基因信號肽), 在胚特異性啟動子(大豆凝集素基因啟動子)的控制下轉(zhuǎn)化大豆。結(jié)果卻在獲得的轉(zhuǎn)基因材料后代中,植酸酶活性雖有不同程度提高, 但不同株系植酸酶活性、植酸磷含量及無機(jī)磷含量卻不同。今后需進(jìn)一步研究這些轉(zhuǎn)基因材料的其他農(nóng)藝性狀, 如種子萌發(fā)率和種子干重等, 以篩選獲得植酸含量顯著降低、種子萌發(fā)率和種子干重不受顯著影響的轉(zhuǎn)基因大豆材料, 從而為低植酸轉(zhuǎn)基因大豆育種奠定基礎(chǔ), 以實(shí)現(xiàn)從源頭避免植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用, 提高大豆源食物或飼料營養(yǎng)成分的有效利用率。

4 結(jié)論

通過對無花果曲霉植酸酶 phyA基因的密碼子優(yōu)化, 人工合成了適合在大豆中表達(dá)的 phyA(b)基因。以 phyA和 phyA(b)基因分別轉(zhuǎn)化大豆證明, phyA(b)比 phyA在大豆種子中所表達(dá)的植酸酶活性更高, 密碼子優(yōu)化有利于提高外源基因的表達(dá)。

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Codon Optimization and Expression of phyA Gene in Soybean (Glycine max Merr.)

KOU Ying-Ying, SONG Ying-Jin, YANG Shao-Hui*, and WANG Jie-Hua

School of Environment Science and Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China

Phytic acid is the main anti-nutritional components in the plant origin food. Reducing the phytic acid content of transgenic plants is an effective way to improve the nutrient utilization rate of soybean. In this research, the codons of Aspergillus ficuum phyA were optimized according to the codon usage bias in soybean. The phyA(b) gene with scheming DNA sequence was synthesized chemically, which was suitable for expression in soybean. The plant expression vector pCBPS-phyA(b) was constructed. In the vector, phyA(b) gene was driven by promoter of soybean lectin gene and signal peptide sequence, and transformed into Jilin 35 via Agrobacterium-mediated method. PCR detection indicated that the target gene was successfully integrated into soybean genome. The protein product of bar gene could be detected in all positive plants by LibertyLink strip analysis. Herbicide leaf painting showed that leaves of wild-type plants were lesioned, while there of transgenic plants remained green. In total, 13 phyA transgenic plants and 19 phyA(b) transgenic plants were verified by semi quantitative RT-PCR. The detection results of phytase activity, inorganic phosphorus content and phytic acid content in T3transgenic soybean seeds, showed that the artificial phyA(b) gene was successfully expressed in soybean, and the phytase activity in phyA(b) gene transforming plants was significantly higher than that in phyA gene transforming plants. It is suggested that codon optimization can significantly improve the expression of foreign genes.

Soybean; phyA gene; Codon optimization; Genetic transformation

10.3724/SP.J.1006.2016.01798

本研究由國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX0800404B)資助。

This work was supported by the National Transgenic Major Project of China (2014ZX0800404B).

*通訊作者(Corresponding author)： 楊少輝, E-mail： shaohuiyang77@tju.edu.cn

聯(lián)系方式： E-mail： 15620071109@163.com

稿日期)： 2016-02-28; Accepted(接受日期)： 2016-06-20; Published online(

日期)： 2016-06-27.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160627.0837.016.html