CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)及應(yīng)用研究進(jìn)展

孫玉章，孫明軍，代永聯(lián)，尹仁福，丁　壯（. 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島　660；. 青島市畜牧獸醫(yī)研究所，山東青島　6600；. 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春　006）

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)及應(yīng)用研究進(jìn)展

孫玉章1，孫明軍1，代永聯(lián)2，尹仁福3，丁壯3
（1. 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032；2. 青島市畜牧獸醫(yī)研究所，山東青島266100；3. 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春130062）

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白系統(tǒng)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR / CRISPR-associated nuclease system，CRISPR/Cas）是廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其中由Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)改造而來的第三代基因組編輯技術(shù)——CRISPR/Cas9系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的多個(gè)領(lǐng)域。本文主要從CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)、作用原理、應(yīng)用進(jìn)展及與其他新興的基因組編輯技術(shù)的對(duì)比等四個(gè)方面進(jìn)行闡述，重點(diǎn)介紹其最新研究進(jìn)展，并展望了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用前景。

CRISPR/Cas9；基因組編輯；應(yīng)用進(jìn)展

基因組編輯技術(shù)（Genome Editing）是通過人為改變基因特定位點(diǎn)的核苷酸序列，實(shí)現(xiàn)針對(duì)基因組中特定目的基因片段的插入、刪除、替換或修飾的新興分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)是通過在目的基因特定位點(diǎn)切割產(chǎn)生DNA的雙鏈斷裂（DNA double strand breaks，DSBs），進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體固有的同源重組（Homology directed recombination repair，HR）和非同源末端連接（Non-homologous endingjoining，NHEJ）兩種自我修復(fù)機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的定點(diǎn)編輯[1]。

傳統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)主要依賴機(jī)體自發(fā)的同源重組修復(fù)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的定點(diǎn)敲除、替換或修飾，效率極低（10-6～10-9），應(yīng)用受限。近二十年來興起的人工核酸內(nèi)切酶（Engineered endonuclease，EEN）極大地改變了這一現(xiàn)狀。目前常用的EEN有四類：歸巢核酸內(nèi)切酶（Meganucleases/LAGLIDADG homing endonucleases，LHE）， 鋅 指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs），類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator like effector nucleases，TALENs）和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白系統(tǒng)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR / CRISPR-associated nuclease system，CRISPR/Cas）。其中CRISPR/Cas系統(tǒng)是2013年以來發(fā)展起來的第三代基因編輯技術(shù)，融合了經(jīng)典遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)（Reverse Genetics）的研究方法，以其設(shè)計(jì)簡單、效率高、重復(fù)性好和周期短等特點(diǎn)迅速成為一種應(yīng)用前景廣闊的基因組編輯工具。本文僅對(duì)這一技術(shù)的發(fā)展、作用機(jī)理及其應(yīng)用進(jìn)展等方面的內(nèi)容進(jìn)行簡述。

1　CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)和分類

CRISPR/Cas是一種廣泛存在于古細(xì)菌和細(xì)菌基因組中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其序列特征最先由日本學(xué)者于1987年發(fā)現(xiàn)。但直到2008年，該系統(tǒng)才被證明可以類似于真核細(xì)胞中RNA干擾（RNA interference，RNAi）的方式抵御外源微生物或質(zhì)粒的入侵。

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育及作用的分子機(jī)制，CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為3個(gè)類型（Ⅰ型、Ⅱ型與Ⅲ型）[2]：Ⅰ型系統(tǒng)在細(xì)菌和古細(xì)菌中都有發(fā)現(xiàn)，其核心蛋白為具有DNA核酸酶和解旋酶功能的Cas3蛋白，同時(shí)需要Cas5、Cas7等多種Cas蛋白輔助發(fā)揮作用；Ⅱ型系統(tǒng)目前發(fā)現(xiàn)僅存在于細(xì)菌中，其核心蛋白為具有RuvC核酸酶和HNH核酸酶活性的Cas9蛋白；Ⅲ型系統(tǒng)多存在于古細(xì)菌中，其核心蛋白為具有RNA酶活性的Cas10蛋白，同時(shí)需要Cas6等多種蛋白。三種類型的CRISPR系統(tǒng)發(fā)揮作用都需要有Cas1和Cas2等核心Cas蛋白的存在，這是因?yàn)镃as1和Cas2蛋白在獲得新的間隔序列中具有重要作用。

相對(duì)于Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)，Ⅱ型系統(tǒng)組分簡單，僅需Cas9蛋白、CRISPR RNA（crRNA）與反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）相互作用就能起到靶向切割目的基因DNA的功能，因此在2012年Jinek等[3]率先證明了CRISPR/ Cas9系統(tǒng)對(duì)DNA的體外切割作用之后，短短幾年間，基于Ⅱ型系統(tǒng)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)被迅速改進(jìn)為應(yīng)用廣泛的基因組編輯工具。

2　CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)理

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的主體結(jié)構(gòu)為前導(dǎo)序列（Leader）、CRISPR基因座和相鄰的多個(gè)Cas基因組成（圖1）。前導(dǎo)序列具有種屬特異性，是一段進(jìn)化保守的非編碼序列。前導(dǎo)序列緊鄰CRISPR基因座的5′端且富含AT堿基，參與crRNA的轉(zhuǎn)錄并決定新的間隔序列插入基因組中的方向。CRISPR基因座位點(diǎn)由高度保守的重復(fù)序列（Repeats）與長度不等的間隔序列（Spacers）相間串聯(lián)而成。

圖1　CRISPR/Cas9系統(tǒng)的位點(diǎn)結(jié)構(gòu)

細(xì)菌抵抗外源微生物感染的CRISPR/Cas9免疫機(jī)制主要分為適應(yīng)、表達(dá)和干擾3個(gè)階段[4]。（1）適應(yīng)：CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的Cas1、Cas2協(xié)同其他相關(guān)Cas蛋白將外源微生物基因組的某個(gè)特定片段整合到CRISPR位點(diǎn)的前導(dǎo)區(qū)之后，第一個(gè)重復(fù)序列之前，在此后的復(fù)制中作為一個(gè)新的間隔序列存在。（2）表達(dá)：前導(dǎo)序列指導(dǎo)CRISPR轉(zhuǎn)錄為pre-crRNA時(shí)，其5'端的tracrRNA同時(shí)轉(zhuǎn)錄并通過堿基互補(bǔ)與pre-crRNA形成RNA二聚體，在Cas9與RNAase Ⅲ的聯(lián)合作用下剪切為成熟的crRNA/tracrRNA二聚體。（3）干擾：成熟的crRNA/tracrRNA二聚體通過堿基互補(bǔ)作用識(shí)別外源微生物基因組中的靶位點(diǎn)，在Cas9蛋白核酸酶的作用下切割該靶位點(diǎn)的DNA雙鏈，進(jìn)而使外源微生物失活。

通過人工改造的CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割目的基因片段的作用機(jī)理與細(xì)菌抵抗外源微生物感染的CRISPR/Cas9機(jī)制類似，主要是在形成crRNA/ tracrRNA二聚體的crRNA編碼序列中人為替換為目的基因特定位點(diǎn)的序列，從而構(gòu)建成為能夠指導(dǎo)Cas9蛋白特異切割目的基因DNA特定位點(diǎn)的單鏈向?qū)NA（Single-guide RNA，sgRNA）。在Cas9蛋白切割目的基因的DNA雙鏈后形成DSBs，并激活細(xì)胞的HR和NHEJ兩種自我修復(fù)機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因組的插入、敲除或修飾等編輯方式（圖2）。

圖2　CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組定點(diǎn)編輯方式

3　CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

3.1CRISPR/Cas9應(yīng)用于植物遺傳育種研究

傳統(tǒng)植物育種的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞后通過激活植物細(xì)胞的自發(fā)同源重組機(jī)制隨機(jī)整合到植物基因組中，進(jìn)而通過篩選表型獲得目標(biāo)性狀的突變株。由于植物中自發(fā)同源重組的低效率和整合位點(diǎn)的隨機(jī)性，長期以來要實(shí)現(xiàn)植物基因組的精確編輯比較困難。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)和應(yīng)用使得對(duì)植物基因組進(jìn)行高效精確的編輯成為可能。

2013年Mao等[5]率先利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了模式植物擬南芥基因組中特定目的基因片段的定點(diǎn)突變。2014年Zhang等通過測試CRISPR/ Cas9系統(tǒng)對(duì)2個(gè)水稻亞種的11個(gè)靶基因的編輯特點(diǎn)，證實(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻中具有很高的特異性和編輯效率（66.7%）。同年，Wang等[6]利用TALEN和CRISPR-Cas9技術(shù)在六倍體面包小麥中成功實(shí)現(xiàn)了同時(shí)編輯3個(gè)同源等位基因，獲得了具有白粉病抗性的新品種小麥。CRISPR/Cas9系統(tǒng)為實(shí)現(xiàn)作物穩(wěn)定高效的定向育種（產(chǎn)量、抗性或品質(zhì)等）提供了有力的遺傳學(xué)工具。

3.2CRISPR/Cas9應(yīng)用于動(dòng)物基因組遺傳修飾

2013年Cong等[7]和Mali等[8]幾乎同時(shí)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)分別在293T細(xì)胞、K562細(xì)胞和iPS細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了不同程度的基因敲除，從此開啟了真核細(xì)胞中基因組高效定點(diǎn)編輯的嶄新時(shí)代。同年，Wang等[9]通過CRISPR/Cas9技術(shù)僅耗時(shí)3～4周便一次性獲得了同時(shí)敲除5個(gè)基因的小鼠。

相對(duì)于傳統(tǒng)的顯微注射法和慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)的遺傳育種方法，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的高效率、多靶位、短周期和易篩選等特點(diǎn)迅速掀起了動(dòng)物基因組遺傳修飾的研究高峰，并衍生出了CRISPR干擾（CRISPR interference，CRISPRi）等一系列新興技術(shù)。

2015年Chen等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向沉默獼猴的肌營養(yǎng)不良蛋白基因，顯著降低了突變體的肌營養(yǎng)不良蛋白表達(dá)和肌肉退化現(xiàn)象。同年，Crispo等利用CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合顯微注射法制備出敲除肌肉生長抑制素基因的轉(zhuǎn)基因綿羊，轉(zhuǎn)基因效率高達(dá)45.5%，遠(yuǎn)高于常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)。

要結(jié)合系統(tǒng)內(nèi)近年來發(fā)生的腐敗問題典型案例，以案釋紀(jì)、以案促教，讓黨員干部知敬畏、存戒懼、守底線。抓住關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在干部提任時(shí)開展廉政談話，實(shí)施業(yè)務(wù)分管領(lǐng)導(dǎo)和分管人事工作的領(lǐng)導(dǎo)“雙談話”機(jī)制，切實(shí)提升教育效果。

3.3CRISPR/Cas9應(yīng)用于人類疾病模型構(gòu)建

人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中伴隨著許多原癌基因和腫瘤抑制基因發(fā)生遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的改變，通過培育遺傳基因缺陷的小鼠品系對(duì)于系統(tǒng)性模擬和研究癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程具有重要意義。相對(duì)于傳統(tǒng)的基于Cre-loxp基因打靶的模型構(gòu)建方法，CRISPR/Cas9系統(tǒng)成本更低、效率更高，目前已經(jīng)成功建立起了肝癌、肺癌等多種癌癥模型的小鼠品系。

2014年Hai等[10]首次利用CRISPR/Cas9技術(shù)高效地獲得了雙等位vWF基因突變的基因敲除豬，從而建立了血管性血友病的小型豬模型。2016年Yuan等[11]利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向修飾兔體基因組的CRYAA基因及GJA8基因，成功構(gòu)建了具有典型白內(nèi)障表型的模型兔。CRISPR–Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于高效地構(gòu)建疾病模型，對(duì)于深入研究疾病基礎(chǔ)病理學(xué)、揭示疾病發(fā)展機(jī)制和抗病藥物篩選等具有重要的意義。

3.4CRISPR/Cas9應(yīng)用于抗病毒策略研究

由于基因組編輯技術(shù)是在DNA水平上對(duì)基因組序列進(jìn)行定點(diǎn)改造和修飾，因此理論上所有DNA病毒和存在DNA狀態(tài)的病毒都可以通過基因組編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)病毒特定基因片段的靶向編輯和表達(dá)沉默。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)出現(xiàn)之前，ZFN和TALEN技術(shù)都曾用于病毒感染疾病的治療，但由于兩者構(gòu)建復(fù)雜、靶位受限，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)為病毒感染疾病的EEN療法開辟了新途徑。

2014年Hu等[12]通過構(gòu)建靶向編輯人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）LTR U3啟動(dòng)子的gRNA-Cas9質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cas9能夠?qū)崿F(xiàn)整合的HIV原病毒基因組的定點(diǎn)清除。Lin等[13]通過構(gòu)建靶向乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）基因組的gRNA-Cas9質(zhì)粒，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)可明顯降低HBV核心蛋白和表面蛋白的表達(dá)量。Wang等[14]針對(duì)Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus，EBV）基因組的6個(gè)不同的功能位點(diǎn)構(gòu)建了7個(gè)gRNA-Cas9質(zhì)粒，核轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入Cas9-gRNA的細(xì)胞恢復(fù)了正常的凋亡途徑，顯著增低了EBV致瘤效應(yīng)。

同ZFN和TALEN技術(shù)一樣，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)（Off-target effects）也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性，因此如何提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性而不降低打靶效率是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)療法的技術(shù)關(guān)鍵。

2014年Shalem等利用慢病毒載體介導(dǎo)64 751條sgRNA構(gòu)建了靶向沉默幾乎覆蓋人類基因組全部18 080個(gè)基因的全基因組CRISPR-Cas9敲除文庫（Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout Library，GeCKO），結(jié)合高通量測序技術(shù)快速篩選出了黑色素瘤抗藥性的相關(guān)基因。Zhou等[15]利用GeCKO文庫結(jié)合高通量測序技術(shù)，篩選并鑒定出了白喉毒素和炭疽毒素的細(xì)胞表面受體，為進(jìn)一步研究病原菌與宿主相互作用和信號(hào)通路奠定了基礎(chǔ)。由于高通量測序篩選數(shù)據(jù)的分析難度較大，Li等開發(fā)出了新的統(tǒng)計(jì)學(xué)算法——基于模型的全基因組CRISPR/Cas9敲除分析法（the Model-based Analysis of Genome-wide CRISPR/Cas9 Knockout method，MAGeCK），能夠同時(shí)進(jìn)行陽性和陰性選擇篩選，具有較高的靈敏度和篩選效率。

目前已有商品化的用于高通量敲除特定基因的CRISPR sgRNA文庫，基于基因敲除實(shí)現(xiàn)的功能缺失型篩選能夠用于深入研究特定基因功能、篩選信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因以及研制新型靶向藥物等方向。

4　CRISPR/Cas9與其他基因編輯技術(shù)的對(duì)比

同為RNA介導(dǎo)的基因篩選方法，CRISPR/ Cas9和RNAi有著諸多不同：RNAi屬于基因下調(diào)（Gene knockdown）方法，并不能完全抑制基因的表達(dá)，而CRISPR/Cas9屬于基因敲除（Gene knockout）方法，可使基因完全失活；RNAi屬于RNA水平的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，CRISPR系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)DNA水平和RNA水平的基因沉默；RNAi抗病毒策略以降解細(xì)胞漿內(nèi)增殖的RNA病毒為主，CRISPR/Cas9系統(tǒng)目前多用于細(xì)胞核內(nèi)增殖的DNA病毒或存在DNA階段的RNA病毒；RNAi一般特異性的降解與之序列相應(yīng)的單個(gè)內(nèi)源基因的mRNA，CRISPRi可同時(shí)用于研究多個(gè)基因的表達(dá)、激活或抑制；RNAi具有ATP依賴性，CRISPR/ Cas9對(duì)靶序列的識(shí)別具有PAM限制；RNAi作用有一定的時(shí)效性、一般不可遺傳，CRISPR/Cas9可以產(chǎn)生穩(wěn)定、高效的遺傳改變。作為重要的反向遺傳學(xué)研究工具，RNAi和CRISPR/Cas9都是通過功能缺失表型來進(jìn)行基因篩選，而且二者的脫靶效應(yīng)同樣不可忽視。

同為新興的基因組編輯技術(shù)，gDNA引導(dǎo)的NgAgo系統(tǒng)（NgAgo-gDNA）與RNA導(dǎo)向的CRISPR/Cas9系統(tǒng)亦有許多不同：NgAgo-gDNA系統(tǒng)以5'磷酸化的ssDNA為介導(dǎo)，無靶序列的PAM識(shí)別限制，特異性和編輯效率高，單堿基的錯(cuò)配就會(huì)導(dǎo)致基因編輯效率的明顯降低（CRISPR/ Cas9系統(tǒng)容許5個(gè)堿基的錯(cuò)配），因此基因編輯位點(diǎn)識(shí)別較為嚴(yán)謹(jǐn)，具有較低的脫靶效應(yīng)。但目前此項(xiàng)技術(shù)引起的爭議主要是重復(fù)性問題，能否改進(jìn)為新一代的基因組編輯工具還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證，應(yīng)用前景并不明朗。

同為gDNA引導(dǎo)的DNA編輯技術(shù)，SGN系統(tǒng)（Structure-guided endonuclease system）與NgAgo系統(tǒng)相比不再受到靶序列的限制，依賴識(shí)別3'flap結(jié)構(gòu)的內(nèi)切酶功能實(shí)現(xiàn)外源報(bào)告基因和內(nèi)源基因DNA特定位點(diǎn)的編輯，主要傾向于產(chǎn)生大片段的基因刪除。目前此項(xiàng)技術(shù)推廣應(yīng)用的主要障礙是相對(duì)較低的內(nèi)源基因編輯效率，這可能與其識(shí)別機(jī)制或位點(diǎn)特異性有關(guān)，因此仍然需要大量的后續(xù)研究工作進(jìn)行不斷優(yōu)化和探索。

5　結(jié)語與展望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前為止靶向基因組編輯最高效的反向遺傳學(xué)工具，在植物遺傳育種研究、動(dòng)物基因組遺傳修飾、人類疾病模型構(gòu)建、抗病毒策略研究和功能基因組學(xué)研究等多個(gè)領(lǐng)域取得了重要進(jìn)展。但作為一項(xiàng)嶄新的基因組編輯技術(shù)，如何降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)成為亟須解決的問題。

目前已經(jīng)有多個(gè)研究小組就提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了有益的實(shí)踐，如雙切口酶系統(tǒng)、dCas9-FokI系統(tǒng)等，都能不同程度的降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)。隨著對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能研究的不斷深入，我們有理由相信CRISPR/ Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)具有極大的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景。

[1] Rodolphe B，John van der O. CRISPR-Cas Systems：RNA-mediated adaptive immunity in bacteria and archaea[M]. Berlin：Springer Press，2013：1-32.

[2]Makarova K S，Haft D H，Barrangou R，et al. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems[J]. Nat Rev Microbiol，2011，9（6）：467-477.

[3] Jinek M，Chylinski K，F(xiàn)onfara I，et al. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity[J]. Science，2012，337（6096）：816-821.

[4] Wiedenheft B，Sternberg S H，Doudna J A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea[J]. Nature，2012，482（7385）：331-338.

[5] Mao Y，Zhang H，Xu N，et al. Application of the CRISPRCas system for efficient genome engineering in plants[J]. Molecular Plant，2013，6：2008-2011.

[6] Wang Y P，Cheng X，Shan Q W，et al. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew[J]. Nature Biotechnology，2014，32：947-951.

[7] Cong L，Ran F A，Cox D，et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science，2013，339（6121）：819-823.

[8] Mali P，Yang L H，Esvelt K M，et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9[J]. Science， 2013，339（6121）：823-826.

[9] Wang H Y，Yang H，Shivalila C S，et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J]. Cell，2013，153（4）：910-918.

[10] Hai T，Teng F，Guo R，et al. One-step generation of knockout pigs by zygote injection of CRISPR/Cas system[J]. Cell Res，2014，24（3）：372-375.

[11] Yuan L，Sui T T，Chen M，et al. CRISPR/Cas9-mediated GJA8 knockout in rabbits recapitulates human congenital cataracts[J]. Scientific Reports，2016，6：22024

[12] Hu W H，Kaminski R，et al. RNA-directed gene editing specifically eradicates latent and prevents new HIV-1 infection[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（31）：11461-11466.

[13] Lin S R，Yang H C，Kuo Y T，et al. The CRISPR/Cas9 system facilitates clearance of the intrahepatic HBV templates in vivo[J]. Mol Ther Nucleic Acids，2014，3（8）：e186.

[14] Wang J B，Quake S R. RNA-guided endonuclease provides a therapeutic strategy to cure latent herpesviridae infection[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（36）：13157-13162.

[15] Zhou Y X，Zhu S Y，Cai C Z，et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells[J]. Nature，2014，509（7501）：487-491.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Research Advances in CRISPR/Cas9-mediated Genome Editing and Its Application

Sun Yuzhang1，Sun Mingjun1，Dai Yonglian2，Yin Renfu3，Ding Zhuang3
（1. China Animal Health & Epidemiology Center，Qingdao，Shandong266032；2. Qingdao Institute of Husbandry & Veterinary Science，Qingdao，Shandong266100；3. College of Veterinary Medicine， Jilin University，Changchun，Jilin130062）

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR），together with the associated sequences（Cas genes and Cas proteins）widely exist in adaptive immune system of bacteria and archaea. CRISPR/ Cas9 system，the third generation genome editing technology，which was established on the basis of the type II CRISPR/Cas system，has been widely applied in many fields of life science research. In this review，CRISPR/Cas9's discovery，function mechanism，application progress，and comparison analysis on other emerging genome editing technologies were introduced. Furthermore，the application prospect of the CRISPR/Cas9 system was described.

CRISPR/Cas9 system；genome editing；application progress

S851.3

A

1005-944X（2016）12-0064-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.12.019

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303033）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31402195）；教育部高校博士點(diǎn)基金博導(dǎo)類項(xiàng)目（20110061110005）

丁 壯