染色體微陣列分析在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

劉翠嫻 熊符

一、引言

出生缺陷可造成胎兒、嬰兒的死亡，人類(lèi)壽命的縮短，并可導(dǎo)致許多兒童患病和殘疾，因此成為當(dāng)今各國(guó)重視的衛(wèi)生問(wèn)題。相當(dāng)一部分出生缺陷是基因及染色體變異導(dǎo)致，而基因組拷貝數(shù)變異就是其中之一［1－2］?；蚪M拷貝數(shù)變異 (copy number variations，CNVs)即染色體片段的重復(fù)或缺失，指與已報(bào)道的正?；蚪M相比，拷貝數(shù)存在差異且增加或減少的堿基數(shù)目＞1kb，這是一種十分普遍的染色體變異，并且很多染色體數(shù)目的變異都與疾病直接相關(guān)［3］。為減少及預(yù)防缺陷嬰兒的出生，精準(zhǔn)的產(chǎn)前診斷技術(shù)及專(zhuān)業(yè)的遺傳咨詢(xún)必不可少。目前，主要的產(chǎn)前診斷技術(shù)包括核型分析、染色體微陣列分析、熒光原位雜交技術(shù) (fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)、熒光定量PCR、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及Sanger測(cè)序、高通量測(cè)序等。其中，染色體微陣列分析是2001年人類(lèi)基因組計(jì)劃完成后衍生的一種新的分子水平染色體分析技術(shù)，在進(jìn)行全基因組掃描時(shí)，其高分辨率能夠檢出＜50kb的基因拷貝數(shù)變異。CMA技術(shù)主要結(jié)合了傳統(tǒng)的比較基因組雜交與基因探針兩種方法，其基本原理是將待測(cè)基因組DNA用特定的熒光或生物素進(jìn)行標(biāo)記，然后結(jié)合到已包埋在固相載體上的探針陣列中，再通過(guò)檢測(cè)待測(cè)基因與探針的雜交信號(hào)以實(shí)現(xiàn)對(duì)海量的基因信息的定量分析，該技術(shù)以PCR和分子雜交為基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的快速、有效地檢測(cè)，這樣不僅顯著提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，還大大提高了檢測(cè)效率［4］。目前，CMA根據(jù)芯片所使用探針類(lèi)型的不同分為兩大類(lèi)，分別是微陣列比較基因組雜交 (array-based comparative genomic hybridization，aCGH)及單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide ploymophism array，SNP array)技術(shù)［5－7］。前者探針來(lái)源于基因組寡核苷酸序列，其優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)拷貝數(shù)變異方面，該技術(shù)的探針能覆蓋全基因組位點(diǎn)，分辨率可精確到50 bp或以下;而后者是根據(jù)人類(lèi)基因組單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針位點(diǎn)，優(yōu)勢(shì)在于除了能夠檢出CNV以外，還能夠檢測(cè)出大多數(shù)的單親二倍體以及檢測(cè)到低水平的嵌合體［8－10］及單基因疾病等，有利于大量樣本關(guān)聯(lián)連鎖研究，但不能識(shí)別基因組拷貝數(shù)變異［11］。

二、CMA技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

在產(chǎn)前診斷的過(guò)程中，對(duì)于常規(guī)產(chǎn)前檢查、唐氏篩查、超聲檢查等發(fā)現(xiàn)的可疑征象，往往需要進(jìn)行細(xì)胞和分子層面的更為準(zhǔn)確精細(xì)的檢測(cè)。臨床上常用的手段有細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析、FISH、比較基因組雜交 (comparative genomic hybridization，CGH)等。通過(guò)G顯帶染色體核型分析技術(shù)可以檢出的基因組拷貝數(shù)變化主要表現(xiàn)形式為較大片段的染色體結(jié)構(gòu)變異如缺失或重復(fù)或易位或倒位，對(duì)片段較小的拷貝數(shù)變異則存在漏檢。針對(duì)染色體的拷貝數(shù)變異，近年來(lái)多項(xiàng)研究表明CMA技術(shù)能對(duì)其進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)。CMA技術(shù)分辨率高，可檢測(cè)出低于50kb的微缺失及微重復(fù)，且有效地克服或彌補(bǔ)了現(xiàn)有的染色體檢測(cè)技術(shù)的局限性，將染色體的診斷提高到了亞顯微甚至是基因的水平上，極大地提高了染色體異常的檢出率，而且其具有特異性高、靈敏度強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單快速等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于微生物、腫瘤、遺傳性疾病及產(chǎn)前診斷等多個(gè)領(lǐng)域［12－13］。

CMA作為一種新的檢測(cè)技術(shù)，相對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有不可比擬的優(yōu)點(diǎn)［14］。傳統(tǒng)的G顯帶染色體核型分析是產(chǎn)前細(xì)胞遺傳診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其優(yōu)點(diǎn)是可以檢測(cè)到染色體的平衡異位，該技術(shù)需要培養(yǎng)足夠量的細(xì)胞才能進(jìn)行人工鏡檢，而且只能分辨大于10Mb的染色體變異，存在較高的人為偏差。而FISH作為針對(duì)核型分析缺陷而發(fā)展的一項(xiàng)更為精細(xì)的技術(shù)，具有比核型分析更高的分辨率并且可以檢測(cè)到平衡及不平衡易位以及融合基因，但其一次只能檢測(cè)一到數(shù)個(gè)異常染色體片段，而且不能檢測(cè)雜合子缺失 (loss of heterozygosity，LOH)/單親二倍體 (uniparental disomy，UPD)。而且，F(xiàn)ISH的檢測(cè)依賴(lài)探針，目前所制備的探針類(lèi)型及數(shù)目比較單一，不能作為全基因篩查的一種方法。相較于G顯帶及FISH檢測(cè)方法，CMA分辨率高，能夠全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)到細(xì)微的缺失及重復(fù);同時(shí)，SNP array利用高密度的單核苷酸芯片檢測(cè)基因組基因的多態(tài)性，可以進(jìn)行 LOH、UPD 以及多倍體的檢測(cè)等［15－17］。而且，CMA的檢測(cè)無(wú)需進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期只需兩天，可縮短患者的心理焦慮時(shí)間，而且實(shí)驗(yàn)的流程經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理，其結(jié)果運(yùn)用軟件分析，代替了以往的主觀判斷，降低了人為偏差［18－19］。但是，CMA也存在一定的缺點(diǎn)，例如不能檢測(cè)平衡異位、倒位。更為重要的是，CMA目前最大問(wèn)題是對(duì)結(jié)果的正確解讀，其原因在于該技術(shù)能找出約1%的不確定性的拷貝數(shù)變異，這會(huì)給遺傳咨詢(xún)帶來(lái)一定的困擾［20－21］。即使CMA存在上述一些缺點(diǎn)，但其對(duì)拷貝數(shù)變異檢測(cè)具有顯著優(yōu)勢(shì)，其臨床應(yīng)用價(jià)值不可低估。

隨著科學(xué)的進(jìn)步，產(chǎn)前篩查技術(shù)也是日新月異。近幾年發(fā)展比較快的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷即孕婦外周血高通量測(cè)序就是其中之一，其特點(diǎn)是對(duì)胎兒沒(méi)有創(chuàng)傷，并且敏感性及特異性高，適合胎兒染色體非整倍體篩查［22－23］。高通量測(cè)序即深度測(cè)序，是在人類(lèi)基因組測(cè)序順利完成的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的第二代測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)能較好地檢測(cè)到13、18、21號(hào)染色體的整體變化情況，但對(duì)于更細(xì)微的基因組拷貝數(shù)變異，則需要提高測(cè)序的深度才能檢測(cè)成功，該技術(shù)對(duì)生物信息分析要求比較高，要處理大量的測(cè)序數(shù)據(jù)。而且，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前高通量測(cè)序在染色體非整倍體檢測(cè)中會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性及假陰性結(jié)果，可能原因包括母體細(xì)胞嵌合、母體的癌細(xì)胞、消失的雙胎以及母體的拷貝數(shù)變異、游離在母體外周血的胎兒遺傳片段少等。所以，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前高通量測(cè)序結(jié)果陽(yáng)性的孕婦都需要進(jìn)一步做有創(chuàng)的CMA或核型檢測(cè)，結(jié)合CMA或核型結(jié)果對(duì)孕婦胎兒情況進(jìn)行判斷。同時(shí)，CMA技術(shù)在嵌合體檢測(cè)方面亦優(yōu)于高通量測(cè)序技術(shù)，其能根據(jù)樣本DNA與探針雜交信號(hào)的比對(duì)，甚至可以精確地檢測(cè)到嵌合比例。并且，高通量測(cè)序也存在不能檢測(cè)染色體平衡異位、費(fèi)用高、檢測(cè)出的數(shù)據(jù)量大，難以分析等特點(diǎn)［24］。更重要的是，無(wú)創(chuàng)高通量測(cè)序的假陽(yáng)性結(jié)果風(fēng)險(xiǎn)將會(huì)在極大程度上導(dǎo)致孕婦做出終止妊娠的錯(cuò)誤決定。所以，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前高通量技術(shù)亦離不開(kāi)CMA技術(shù)，前者做篩查，后者做驗(yàn)證，才能得出一個(gè)準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷結(jié)果。

三、CMA技術(shù)在產(chǎn)前診斷的臨床應(yīng)用

CMA作為一線技術(shù)早已應(yīng)用于臨床，2010年國(guó)際細(xì)胞遺傳學(xué)協(xié)會(huì)認(rèn)定CMA為發(fā)育障礙或先天畸形患者的染色體突變檢測(cè)的首選臨床診斷檢測(cè)技術(shù)［25］。此外，2009年美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會(huì)亦推薦aCGH作為一線技術(shù)應(yīng)用于智力障礙、自閉癥和先天性異?；颊叩娜旧w檢測(cè)［26］。美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)大會(huì)則認(rèn)為對(duì)全部妊娠婦女提供有創(chuàng)取樣微芯片檢測(cè)是合適的，推薦無(wú)論風(fēng)險(xiǎn)如何，所有的孕婦都應(yīng)有機(jī)會(huì)選擇有創(chuàng)的產(chǎn)前診斷芯片技術(shù)檢測(cè)技術(shù)［27］。2009年美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)醫(yī)師協(xié)會(huì)提出建議對(duì)于超聲檢查證實(shí)胎兒攜帶一個(gè)或者多個(gè)結(jié)構(gòu)異常并正在接受侵入性產(chǎn)前診斷的患者，建議進(jìn)行CMA代替?zhèn)鹘y(tǒng)的胎兒核型分析檢測(cè)，而且若胎兒出現(xiàn)宮內(nèi)死亡或死產(chǎn)的情況，需要進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析時(shí)，建議對(duì)胎兒組織 (即羊水，胎盤(pán)或妊娠物)進(jìn)行染色體微陣列分析，因?yàn)樵摷夹g(shù)可以增加獲得結(jié)果的可能性，提高致病畸形的檢測(cè)率［28］。此外，2010年加拿大醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會(huì)同樣推薦CMA作為研究發(fā)育遲緩/精神發(fā)育遲滯、自閉癥、多種先天性異?；蚧蔚然颊叩牡谝痪€實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù);當(dāng)超聲或胎兒磁共振成像技術(shù)檢測(cè)胎兒存在結(jié)構(gòu)異常，或當(dāng)進(jìn)行非整倍體快速掃描的結(jié)果是陰性時(shí)，建議aCGH可以代替染色體核型分析，作為一個(gè)適當(dāng)?shù)脑\斷檢查［29］。鑒于CMA技術(shù)在醫(yī)療領(lǐng)域得到的高度評(píng)價(jià)，接下來(lái)簡(jiǎn)要地介紹CMA技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的臨床應(yīng)用。

1．多發(fā)性自然流產(chǎn)的原因排查:2012年，Wapner等［27］人曾對(duì)3 822例核型正常的樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)96例 (2.5%)存在或可能存在致病的染色體拷貝數(shù)變化。而有研究顯示，核型分析正常的群體中依然能檢測(cè)出6%的染色體異常，而這部分人發(fā)生流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)更高。而5%的流產(chǎn)原因已經(jīng)明確是由于染色體的微缺失、微重復(fù)導(dǎo)致，而這種畸變無(wú)法被傳統(tǒng)檢測(cè)方法所識(shí)別。2013年有研究對(duì)一例多發(fā)性流產(chǎn)患者進(jìn)行染色體核型分析，利用SNP array確定了該患者外周血所有有核細(xì)胞的染色體核型均為47，XX，+8，找到造成患者習(xí)慣性流產(chǎn)的原因［30］。

2．產(chǎn)前胎兒染色體檢測(cè):由于染色體變異能導(dǎo)致多種遺傳性疾病的發(fā)生，所以，應(yīng)用CMA技術(shù)進(jìn)行胎兒產(chǎn)前診斷尤為必要。該技術(shù)的產(chǎn)前診斷適應(yīng)證包括:分娩時(shí)年齡達(dá)到或超過(guò)35歲的孕婦;孕期超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常或軟骨指標(biāo)陽(yáng)性的孕婦;曾生育過(guò)染色體異?；純旱脑袐D;夫婦之一是染色體平衡異位、羅氏異位、倒位攜帶者的夫婦;可能攜帶某種X連鎖遺傳病基因的孕婦;曾有不明原因的自然流產(chǎn)史、不明原因胎兒停止發(fā)育、死產(chǎn)的孕婦;或新生兒死亡的孕婦等;妊娠期接觸了致癌物質(zhì)的孕婦;宮內(nèi)發(fā)育遲緩的胎兒及其父母。其中，對(duì)超聲結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)異常而傳統(tǒng)核型分析結(jié)果正常的胎兒，進(jìn)行CMA技術(shù)檢測(cè)尤為必要。利用CMA技術(shù)進(jìn)行以上適應(yīng)證的產(chǎn)前診斷，可以為患者提供有效的遺傳咨詢(xún)所需要的信息，更好地控制出生人口的身體素質(zhì)。

3．胚胎植入前遺傳學(xué)診斷:2006年，Le Caignec等［31］證實(shí)了aCGH應(yīng)用于染色體平衡易位攜帶者進(jìn)行第三代試管嬰兒即植入前遺傳學(xué)診斷 (preimplantation genetic diagnosis，PGD) 的 可 行 性。Fiorentino等［32－33］也進(jìn)一步地利用aCGH技術(shù)檢測(cè)了18種不同易位產(chǎn)生的68類(lèi)非平衡，并檢測(cè)到了最小為2.5 Mb的非平衡片段及可以檢測(cè)出低至10%水平的嵌合體。上述研究結(jié)果表明，aCGH技術(shù)應(yīng)用于胚胎植入前染色體易位遺傳學(xué)診斷具有令人滿(mǎn)意的效果。aCGH用于IVF可以獲得較高的臨床妊娠率［34］，且可以應(yīng)用于復(fù)雜易位和全基因組異倍體篩查［35］。隨著科技的發(fā)展，aCGH有望成為輔助生殖領(lǐng)域中經(jīng)濟(jì)而可靠的胚胎全基因組診斷技術(shù)。

4．“二孩”的孕前遺傳咨詢(xún)及產(chǎn)前診斷:“二孩”政策開(kāi)放使許多家庭再生育的愿望得以實(shí)現(xiàn)，但已生育過(guò)一個(gè)表型異?；蛘J(rèn)知障礙孩子的家庭對(duì)此望而卻步。而染色體微陣列分析能幫這些患者家庭找出病因，是產(chǎn)后及新生兒表型異常以及認(rèn)知功能障礙等的一個(gè)主要的遺傳評(píng)估手段。已有許多研究表明CMA技術(shù)能對(duì)不明原因的智力障礙、多發(fā)先天畸形及自閉癥等進(jìn)行分子診斷［36－38］。大約有12%～19%的此類(lèi)患者能被CMA檢測(cè)出攜帶染色體異常，而傳統(tǒng)的G顯帶核型分析的檢出率只有2%～3%，脆性X試驗(yàn)的檢出率則是0.46%［39］。由此，美國(guó)兒科學(xué)會(huì)推薦CMA成為這些疾病的分子檢測(cè)技術(shù)的第一道防線［6］。所以，可以通過(guò)CMA找出導(dǎo)致患者表型或認(rèn)知異常的分子機(jī)制，然后給患者家庭提供相應(yīng)的遺傳咨詢(xún)及下一胎的產(chǎn)前診斷，減少患兒出生的可能性。國(guó)內(nèi)外的研究表明，應(yīng)用CMA技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前、產(chǎn)后遺傳病診斷是提高染色體患兒檢出率、查明病因并指導(dǎo)家庭二次生育的有效措施。

綜上所述，CMA是當(dāng)前針對(duì)基因拷貝數(shù)變異及致病基因多態(tài)性的最好的一種高通量掃描及基因分型技術(shù)，可以用于多種疾病的產(chǎn)前診斷，提高出生人口的身體素質(zhì)。隨著基因致病數(shù)據(jù)庫(kù)的完善及芯片技術(shù)的改進(jìn)，CMA這項(xiàng)技術(shù)還將繼續(xù)迅速發(fā)展，并在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更多重要的作用。

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