化瘀消癥復方對PI3K/Akt/mTOR信號通路及輸卵管妊娠滋養(yǎng)細胞的作用機制研究

袁爍 陳敏紅 鄧高丕

中醫(yī)認為輸卵管妊娠的發(fā)病機理與少腹素有瘀滯、沖任不暢、胞絡受阻、孕卵移行受到阻滯、不能順利進入胞宮有關(guān)，故中醫(yī)對輸卵管妊娠的治療是以化瘀消癥殺胚為大法。宮外孕I號方(丹參、赤芍、桃仁)作為治療異位妊娠的方劑，從1956年開始應用于臨床[1]。研究團隊在宮外孕I號方的基礎(chǔ)上，加上了從現(xiàn)代藥理研究角度對滋養(yǎng)細胞具有抑制作用的紫草[2]、天花粉[3]組成化瘀消癥復方。在前期開展了一系列復方治療輸卵管妊娠的機制探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化瘀消癥復方可通過誘導FAS/FASL、Bcl-2/Bax凋亡通路[4-5]，促進相關(guān)蛋白的表達增加，而影響滋養(yǎng)細胞的凋亡程序；或通過對雌孕激素發(fā)揮拮抗作用[6]，對溶解輸卵管蛻膜、引起絨毛及蛻膜組織的性質(zhì)改變產(chǎn)生干擾；或通過干預細胞周期進程，上調(diào)增殖抑制率[7]；或呈濃度、時間依賴性地影響FAK信號通路表達，抑制滋養(yǎng)細胞遷移力[8]，進而起到抑制滋養(yǎng)細胞活性，阻滯輸卵管妊娠進展的目的。本實驗基于前期研究基礎(chǔ)，著眼于PI3K/Akt/mTOR 信號通路，旨在探索化瘀消癥復方對輸卵管妊娠滋養(yǎng)細胞凋亡、侵襲影響的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

化瘀消癥復方由紫草、天花粉、赤芍、丹參、桃仁各15 g組成，藥物購自廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部；甲氨蝶呤(廣東嶺南制藥有限公司；批號：472004)；LY294002(RE-Vectec；批號：WXBC0225V)；雷帕霉素(rapamycin,Rapa)(RB-sigma；批號：92M4616V)；胎牛血清(Biological Industries；批號：1435272)；DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibico；批號：8114362)；0.25%胰蛋白酶(Gibico；批號：1616025)；HBSS(1×)(Gibico；批號：C-0130)；Hanks(10×)(Sigma；批號：RNBC1413)；一抗p-AKT(R&D；批號：AF887)；一抗p-雷帕霉素靶蛋白(mammalian taget of rapamycin,mTOR)(Cell Signaling；批號：2983S)；Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒(上海貝博生物公司；批號：BB130031)；Transwell板(Corning；批號：3422)；Matrigel膠(Corning；批號：354277)。

主要儀器：CO2培養(yǎng)箱：英國 NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC 公司；低/高速離心機：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；細胞自動計數(shù)儀：美國 CELLOMETER 公司；全自動化學發(fā)光免疫分析儀：美國 Beckman 公司；脫色搖床：海門市其林貝爾公司；倒置熒光顯微鏡：日本 Nikon EclipseTi-s；流式細胞儀：美國 Beckman 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

手術(shù)中取輸卵管妊娠部位典型的絨毛組織，剪碎后進行體外培養(yǎng)，差異貼壁法分離純化，傳代至第四代，進行細胞鑒定，細胞抗波形蛋白(Vimentin)陰性，抗角蛋白(Cytokeratin 18，CK18)陽性者為符合實驗要求的滋養(yǎng)細胞[9]。當細胞長滿25 cm2培養(yǎng)瓶底90%時傳代，用PBS清洗2次，加入1 mL 0.25%胰酶的消化液進行消化，37℃孵育3～5分鐘，鏡下觀察90%以上細胞懸浮，吸出細胞懸浮液置于15 mL離心管中800 r/min離心5分鐘，棄上清。用含10%胎牛血清的DMEM/F12重懸，按1∶2比例接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 化瘀消癥復方及各組培養(yǎng)液制備

紫草、天花粉、赤芍、丹參、桃仁各15 g，取2 劑共150 g，加入8倍藥物體積純水，2次煮沸，過濾，將所得濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮。將復方水煎劑溶于無血清的 DMEM/F12，過 0.22 μm 濾膜。配成低劑量組2.5 mg/mL、中劑量組5 mg/mL、中藥高劑量組10 mg/mL的無血清DMEM 培養(yǎng)液。將甲氨蝶呤溶于無血清的DMEM/F12，過0.22 μm濾膜，配制成濃度為1 mg/mL的無血清DMEM培養(yǎng)液。將LY294002[胞磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidy linositol 3-kinase,PI3K)抑制劑]溶于無血清的 DMEM/F12，過0.22 μm濾膜，配制成濃度100 μmol/mL的無血清 DMEM 培養(yǎng)液。 將LY294002(PI3K抑制劑)溶于無血清的 DMEM/F12，過0.22 μm 濾膜，配制成濃度100 μmol/mL的無血清DMEM培養(yǎng)液。將Rapa(mTOR抑制劑)溶于無血清的DMEM/F12，過0.22 μm濾膜，配制成濃度300 μmol/mL的無血清 DMEM 培養(yǎng)液。以上培養(yǎng)液配置后置于-20℃保存。

1.4 分組與藥物干預方法

將滋養(yǎng)細胞分為空白組、中藥低、中、高劑量組、LY294002組和Rapa組?？瞻捉M：繼續(xù)予DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；中藥低、中、高劑量組：分別以2.5 mg/mL、 5 mg/mL、10 mg/mL的無血清 DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)；西藥組：以甲氨蝶呤濃度為 1 mg/mL的無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；LY294002組：以LY294002(PI3K抑制劑)濃度為100 μmol/mL的無血清 DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)；Rapa組：以Rapa(mTOR抑制劑)濃度為300 μmol/mL的無血清 DMEM 培養(yǎng)液。

1.5 流式細胞術(shù)檢測藥物對細胞凋亡率的影響

6孔板細胞種植密度為 1×105細胞/孔，待細胞長滿80%時, 加入空白組、中藥低、中、高劑量組、西藥組、LY294002組、Rapa組的培養(yǎng)液各2.5 mL，培養(yǎng) 72小時。用 PBS 洗滌 2 次，加入適量胰蛋白酶消化，收集細胞懸液，1000 r/min 4℃低溫離心 5分鐘，棄上清；加入預冷的 PBS 洗滌 2 次后每管加入 400 μL Binding Buffer 重懸后，加入 5 μL錨定蛋白 V-異硫氰酸熒光素(AnnexinV-FITC)，4℃避光孵育 15分鐘后加10 μL 碘化丙啶(PI) 4℃避光孵育15分鐘，混勻上流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.6 Transwell 體外細胞侵襲實驗

Matrigel基質(zhì)膠準備，冰上操作鋪膠，將生長為對數(shù)期的輸卵管妊娠滋養(yǎng)細胞用胰酶消化，PBS稀釋成 5×105細胞/mL 的濃度，待用；于Transwell 板中的每個下室添加 DMEM/F12 培養(yǎng)液(含 10%胎牛血清)，加入空白組、中藥低、中、高劑量組、西藥組、LY294002組、Rapa組的培養(yǎng)液各2 mL，混合均勻，上室內(nèi)進行接種，培養(yǎng)72小時后進行固定、臺盼藍染色、細胞計數(shù)。

1.7 蛋白免疫印跡法檢測藥物與通路抑制劑對通路蛋白的影響

6孔板細胞種植密度為 1×105細胞/孔，加入空白組、中藥低、中、高劑量組、西藥組、LY294002組、Rapa組的培養(yǎng)液各2.5 mL，每組設(shè)6個復孔，培養(yǎng)72小時細胞，采用蛋白免疫印跡法檢測每組細胞 p-Akt，p-mTOR蛋白的表達：上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜 (濕轉(zhuǎn)) 、封閉，加入一抗(1∶1000)，洗滌，加入二抗反應，洗滌，配制ECL化學發(fā)光底物與膜共孵育1分鐘, 放入化學發(fā)光成像分析儀內(nèi), 自動曝光, 洗片，灰度值分析，計算相對蛋白含量。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組細胞凋亡率比較

與空白組對比，各組細胞凋亡率均上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。中藥高劑量組較空白組、中藥低劑量組、中劑量組的細胞凋亡率上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且呈濃度依賴性。中藥高劑量組較西藥組的細胞凋亡率上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與LY294002組、Rapa組對比，中藥高劑量組的細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖1、表1。

表1 各組細胞凋亡率比較

2.2 各組細胞侵襲能力比較

與空白組對比，各組的過膜細胞數(shù)均減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。中藥高劑量組較中藥低劑量、中劑量組過膜細胞數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且呈濃度依賴性。與西藥組、Rapa組對比，中藥高劑量組的過膜細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與LY294002組對比，中藥高劑量組的過膜細胞數(shù)增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖2、表2。

注：A：空白組； B：中藥低劑量組；C：中藥中劑量組；D：中藥高劑量組；E：西藥組；F：LY294002組；G：Rapa組。

注：A：空白組； B：中藥低劑量組；C：中藥中劑量組；D：中藥高劑量組；E：西藥組；F：LY294002組；G：Rapa組。

表2 各組細胞侵襲力比較

2.3 各組細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達比較

與空白組對比，各組的p-Akt、p-mTOR蛋白表達均下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中藥高劑量組較中藥低、中劑量組，p-Akt、p-mTOR蛋白表達下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且呈濃度依賴性。與LY294002組對比，中藥高劑量組、西藥組細胞中 p-Akt 蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與Rapa組對比，中藥高劑量組、西藥組p-mTOR蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；詳見圖3、表3。

注：A：空白組； B：中藥低劑量組；C：中藥中劑量組；D：中藥高劑量組；E：西藥組；F：LY294002組；G：Rapa組。

表3 各組磷酸化 Akt、mTOR蛋白比較

3 討論

妊娠時，由凋亡引起的程序化細胞死亡，對母胎界面的種植與蛻膜化意義重大，適度的細胞凋亡促進了胚胎種植所需的血管形成，這種與凋亡相關(guān)的微妙變化，被認為對胚胎的正常發(fā)育起到正向的促進作用[10]。適度的調(diào)控是關(guān)鍵，若滋養(yǎng)細胞中關(guān)于凋亡與增殖的平衡遭到破壞，導致過度凋亡的發(fā)生，影響胚胎在著床部位的種植，可能是誘發(fā)流產(chǎn)增加的原因[11]。對輸卵管妊娠治療結(jié)局的期待，恰恰是與宮內(nèi)正常妊娠相反的。

輸卵管妊娠時，受精卵在非子宮體腔著床，絨毛滋養(yǎng)細胞發(fā)揮侵襲種植局部——輸卵管管壁的能力，種植場所同樣有細胞凋亡與增殖的發(fā)生。由于輸卵管的環(huán)境異于宮腔環(huán)境，凋亡調(diào)節(jié)的平衡狀態(tài)受到影響，比如抗凋亡蛋白的大量存在，導致不加控制的滋養(yǎng)細胞的存活、增殖[12]，加之輸卵管的管壁菲薄，對滋養(yǎng)細胞漸進性的侵襲耐受性差，最終出現(xiàn)輸卵管管壁破裂，腹腔內(nèi)出血的結(jié)局。研究團隊前期已對化瘀消癥復方的作用機制做出初步探索[4-9]，而PI3K/Akt/mT0R信號通路與細胞凋亡的相關(guān)性是本實驗的重點。

PI3K/Akt/mTOR信號通路是一條可調(diào)控眾多信號因子，與細胞增殖、分化、血管生成、胚胎發(fā)育和腫瘤侵襲的精細調(diào)節(jié)相關(guān)的通路，其介導絨毛滋養(yǎng)層細胞生長與侵襲借助的是生長因子的效能[13]。在這條信號通路中，Akt是最關(guān)鍵的因子[14]，尤其表現(xiàn)在對細胞凋亡的抑制與對細胞增殖的促進方面。當PI3K受到上游信號刺激后，激活下游的Akt，引起Akt磷酸化，激活下游的mTOR[15]，進而影響各種細胞行為。目前的研究發(fā)現(xiàn)該信號通路在滋養(yǎng)細胞種植過程中有舉足輕重的作用：PI3K /Akt信號通路作為介導滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲與凋亡發(fā)生的靶通路而廣泛地應用于與妊娠相關(guān)的疾病研究[16]。研究表明，增強滋養(yǎng)細胞中PI3K/Akt信號通路的表達，可以提高Bcl-2的相對表達水平；降低Bax和Bim的表達水平，由此推斷PI3K/Akt信號通路與細胞凋亡的發(fā)生呈負相關(guān)[17]。促進PI3K/AKT/mTOR通路的激活，正向促進了滋養(yǎng)細胞的入侵以及對氧化應激的抑制；抑制其表達可逆轉(zhuǎn)上述影響[18]。在滋養(yǎng)細胞中，誘導基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白水解活性，影響基質(zhì)金屬蛋白酶9和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1的比值變化，可能通過AKT通路[19]和mTOR信號通路[20]，刺激細胞粘附和增殖，并增加侵襲性。mTOR作為自噬相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，若其蛋白及磷酸化的表達被靶向抑制，可誘導細胞自噬發(fā)生和受損細胞遷移，因而影響胎盤功能障礙的發(fā)生[21]。以上研究結(jié)果表明，PI3K/Akt/mTOR信號通路及其相關(guān)蛋白的表達活性，與滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲呈正相關(guān)，與滋養(yǎng)細胞凋亡呈負相關(guān)。該通路活性的增強，對正常宮內(nèi)妊娠種植，是正向促進作用；而輸卵管妊娠則反之。

化瘀消癥復方由天花粉、紫草、赤芍、桃仁、丹參組成，臨床與基礎(chǔ)研究均表明其乃治療輸卵管妊娠的有效方劑[8,22]。本實驗發(fā)現(xiàn)化瘀消癥復方促進輸卵管妊娠滋養(yǎng)細胞凋亡率的增加，并抑制輸卵管妊娠滋養(yǎng)細胞的侵襲，均與藥物濃度呈量-效關(guān)系；化瘀消癥復方抑制p-Akt與p-mTOR的表達，與通路抑制劑的作用結(jié)果相似。檢測磷酸化的蛋白即檢測處于活性狀態(tài)的蛋白，與分子功能更直接相關(guān)，可直接反映PI3K/Akt/mTOR信號通路活性程度。以上結(jié)果與文獻中報道的PI3K/Akt/mTOR信號通路調(diào)控滋養(yǎng)細胞凋亡、侵襲的趨勢相一致[23-24]。

由本實驗的結(jié)果推論，化瘀消癥復方治療輸卵管妊娠的可能機制是：干預上游的PI3K，使Akt磷酸化水平的表達下調(diào)，阻斷下游多種抗凋亡效應分子的活化，調(diào)控 mTOR蛋白磷酸化水平的低表達，導致細胞蛋白質(zhì)翻譯得不到有效啟動，減弱了維持細胞生長與存活的信號，從而實現(xiàn)對微環(huán)境中細胞凋亡狀態(tài)的平衡。輸卵管局部細胞凋亡的增加，使滋養(yǎng)細胞侵襲活性受到抑制，改善對輸卵管的無限制侵襲，從而起到“殺胚”的作用。