大孔樹脂純化辣根中烯丙基硫代葡萄糖苷的研究

謝 賽,丁 軻,陳湘寧,*

(1.北京農學院食品科學與工程學院,北京 102206;2.食品質量與安全北京實驗室,北京 102206；3.農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,北京 102206)

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大孔樹脂純化辣根中烯丙基硫代葡萄糖苷的研究

謝 賽1,2,3,丁 軻1,2,3,陳湘寧1,2,3,*

(1.北京農學院食品科學與工程學院,北京 102206;2.食品質量與安全北京實驗室,北京 102206；3.農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,北京 102206)

本文針對大孔樹脂純化烯丙基硫代葡萄糖苷的方法進行了研究,首先在靜態(tài)條件下篩選出了最佳樹脂ZGD630,并應用其研究了提取液pH和洗脫劑對純化效果的影響,確定了最佳吸附pH是6,最佳洗脫劑為0.5 mol/L NaCl溶液;在動態(tài)條件下,考察了柱平衡試劑和柱尺寸對動態(tài)吸附量與動態(tài)解吸得率的影響,確定了純水為平衡液,動態(tài)吸附量為2.057 mg·g-1,同時樹脂柱尺寸變大時,動態(tài)吸附量會減小。建立了一種操作簡便、有效純化辣根中烯丙基硫代葡萄糖苷的方法,為其日后工業(yè)生產及降解產物異硫氰酸烯丙酯的研究奠定了基礎。

烯丙基硫代葡萄糖苷,大孔樹脂,純化,辣根

辣根(horseradish,Armoraciarusticana)是十字花科辣根屬多年生作物,源自歐洲,我國各地多有種植,用作飼料,根部可作調味料,有藥用價值[1-2]。硫代葡萄糖苷(glucosinolate,GS,簡稱硫苷)多存在于辣根、芥末、西蘭花等十字花科類植物中[3]。植物利用硫苷衍生物作為天然殺蟲劑,并抵御食草動物的獵食[4]。硫苷是陰離子含硫親水性次生代謝產物,屬葡萄糖衍生物,目前已知植物中天然存在的硫苷大約120種[4-5]。硫苷沒有生物活性,植物中黑芥子酶(β-thioglucoside glucohydrolase;EC 3.2.3.147)會將其水解成不同產物,包括異硫氰酸酯,硫氰酸酯,硫酸鹽和腈類等[6-7]。烯丙基硫代葡萄糖苷(allyl glucosinolate)(化學結構見圖1)在黑芥子酶水解下生成的異硫氰酸烯丙酯(allyl isothiocyanate,AITC)有抗炎[8],抗癌[9],抑菌[10-13],保鮮[14]等作用。但因硫苷的高極性和易酶解性,提取、純化難度較大[15]。目前國內關于硫苷的純化研究多針對蘿卜硫苷[16-19],對辣根中烯丙基硫苷的研究較少。所以烯丙基硫苷的純化方法研究有待進一步深入。

圖1 烯丙基硫代葡萄糖苷的化學結構Fig.1 Structure of allyl glucosinolate

大孔樹脂吸附作為常用的純化技術,在提取純化植物活性成分中應用廣泛,不僅具有穩(wěn)定性好,選擇吸附性強,不受共存物干擾,可再生等優(yōu)點,而且技術設備簡單,操作方便,生產連續(xù)化程度高,得到的產品往往純度高,成本低[20]。

本實驗采用大孔樹脂純化辣根中的烯丙基硫代葡萄糖苷,探究靜態(tài)條件下樹脂類型、吸附酸堿度,洗脫劑種類及濃度因素對純化的影響,并進行動態(tài)吸附實驗。旨在獲取最佳的純化工藝條件,以期日后用于工業(yè)生產,為研究異硫氰酸烯丙酯相關性質進行原料積累。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣根粉 由射陽縣天德食品有限公司提供。ZGA398大孔強堿性陰離子交換樹脂,ZGA430大孔弱堿性陰離子交換樹脂,ZGA412大孔弱堿性陰離子交換樹脂和ZGD630大孔弱堿性陰離子交換樹脂 浙江爭光實業(yè)有限公司,樹脂的理化性質見(表1)。

表1 大孔堿性陰離子交換樹脂的物理性質Table 1 Physical characters of macroporous anion-exchange resins

無水乙醇,乙酸鋇,氫氧化鈉,氯化鈉磷酸氫二鈉,磷酸二氫鈉(均為分析純),鹽酸(35%～37%),甲醇(色譜純) 美國Fisher公司;四甲基溴化銨(色譜純) 德國Sigma公司;黑芥子硫氰酸鉀(sinigrin,純度≥99.0%) 德國Sigma公司。

LC-20AD型高效液相色譜儀 日本SHIMADZU公司;DSHZ-300A回旋式水浴恒溫振蕩器 太倉市實驗設備廠;RE-5203型旋轉蒸發(fā)器 SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司;PHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;pH計;BSZ-100型自動部分收集器 上海瀘西分析儀器廠有限公司;DG15系列蠕動泵 保定蘭格恒流泵有限公司;L530型臺式低速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;Alpha 1-2LD plus型真空冷凍干燥機 德國Christ公司;AWL-1002-U型超純水系統(tǒng) 美國艾科浦國際公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 烯丙基硫代葡萄糖苷的檢測方法

1.2.1.1 HPLC檢測條件 參照文獻[21],檢測器為PDA檢測器,檢測波長為226 nm,色譜柱:COSMOSIL Packed Column 5C18-MS-Ⅱ(4.6 mm×250 mm),流動相為5 mmol·L-1四甲基溴化銨水溶液∶甲醇=19∶1(v/v),梯度洗脫條件見表2,流速:0.8 mL·min-1,柱溫:40 ℃,進樣量:5 μL。

表2 梯度洗脫條件表Table 2 The conditions of gradient elution

1.2.1.2 標準曲線的繪制 準確稱取4 mg烯丙基硫苷標準品,配制成2 mg·mL-1的標準儲備液,依次稀釋為2、1、0.5、0.25、0.125、0.05 mg·mL-1的烯丙基硫代葡萄糖苷標準溶液,進入HPLC進行檢測,以烯丙基硫苷濃度(mg·mL-1)作為橫坐標(x),以峰面積作為縱坐標(y),繪制標準曲線。

1.2.2 烯丙基硫代葡萄糖苷的提取 應用劉佳[20]優(yōu)化的溶劑回流法,稱取100 g辣根粉,以料液比1∶20(g∶mL),加入80%乙醇水溶液2000 mL,在65 ℃的條件下提取3 h,過濾,棄沉淀,上清液中加入4 mmol/L乙酸鋇溶液200 mL,靜置30 min,過濾去除沉淀。然后在50 ℃下進行旋蒸濃縮,至約200 mL。

1.2.3 樹脂的預處理與篩選

1.2.3.1 樹脂的預處理 對于弱堿性陰離子交換樹脂,首先將樹脂用5%鹽酸浸泡4 h后,用蒸餾水多次清洗至pH不變,再用5%氫氧化鈉溶液浸泡4 h,用蒸餾水多次清洗至pH不變,再用5%鹽酸浸泡4 h,用蒸餾水洗至pH不變,備用。對于強堿性陰離子交換樹脂,首先將樹脂用5%鹽酸浸泡4 h后,用蒸餾水多次清洗至pH不變,再用5%氫氧化鈉溶液浸泡4 h,用蒸餾水洗至pH不變,備用。

1.2.3.2 樹脂的篩選 分別準確量取四份60 mL烯丙基硫代葡萄糖苷提取液于干凈的錐形瓶中,接著分別加入0.4 g ZGA430、ZGA412、ZGD630、ZGA398型濕樹脂,在37 ℃下恒溫水浴振蕩4 h進行吸附。取適量吸附上清液,用0.45 μm有機系膜過濾,續(xù)濾液進入HPLC檢測。根據下面公式計算樹脂的吸附量。然后用純水沖洗樹脂1至2遍,加入0.5 mol/L NaOH溶液25 mL進行洗脫。在37 ℃下振蕩洗脫4 h,取適量洗脫上清液,過濾,進入HPLC檢測,根據下面公式計算解吸得率。

式(1)

式(2)

式中:C0-烯丙基硫苷的初始質量濃度mg·mL-1;C1-吸附收集液中烯丙基硫苷的質量濃度mg·mL-1;C2-洗脫液中烯丙基硫苷的質量濃度mg·mL-1;V0-吸附液的體積mL;V1-洗脫液的體積mL;M-樹脂質量g。

1.2.4 靜態(tài)吸附與解吸條件的優(yōu)化

1.2.4.1pH對吸附的影響 分別準確量取60mL烯丙基硫代葡萄糖苷提取液于6個錐形瓶中,并分別調節(jié)溶液pH為2、4、6、8、10、12,各加入0.4gZGD630型濕樹脂,在37 ℃下恒溫水浴振蕩4h進行吸附。取適量吸附上清液,調節(jié)其pH至液相色譜柱的耐受范圍,用0.45μm有機系膜過濾,續(xù)濾液進入HPLC檢測。根據式(1)計算樹脂的吸附量。然后用純水沖洗樹脂1至2遍,加入0.5mol/LNaCl溶液25mL,在37 ℃下振蕩洗脫4h,取適量洗脫上清液,過濾,進入HPLC檢測,根據式(2)計算解吸得率。

1.2.4.2 洗脫劑種類與濃度對解吸的影響 分別準確量取60mL烯丙基硫代葡萄糖苷提取液于8個錐形瓶中,調節(jié)溶液pH為6,各加入0.4gZGD630型濕樹脂,在37 ℃下恒溫水浴振蕩4h進行吸附。取適量吸附上清液,過濾,進入HPLC檢測,計算樹脂吸附量。用純水沖洗樹脂1至2遍,分別加入25mL濃度為1、0.5、0.1、0.05mol/L的NaCl溶液與HCl溶液,在37 ℃下振蕩洗脫4h,取適量洗脫上清液,調節(jié)其pH至色譜柱耐受范圍,過濾,進入HPLC檢測,計算解吸得率。

1.2.5 動態(tài)吸附與解吸 將ZGD630型樹脂以濕法裝柱(Φ1.0cm×20cm),平衡后上樣,進行吸附,上樣流速為0.5mL·min-1,使用自動收集器定時每4min收集一管,用上述HPLC法測定濃度,繪制動態(tài)穿透曲線,上樣結束后以純水連續(xù)沖洗樹脂柱,至流出液接近無色。用洗脫劑進行解吸,洗脫流速為0.5mL·min-1,每4min收集一管,用上述HPLC法測定濃度,繪制動態(tài)洗脫曲線,最后用純水沖洗樹脂柱備用。動態(tài)吸附量和動態(tài)解吸得率的計算公式如下所示:

式(3)

式(4)

式中:C0-烯丙基硫苷的初始質量濃度mg·mL-1;C1-吸附收集液中烯丙基硫苷的質量濃度mg·mL-1;C2-純水沖洗液中烯丙基硫苷的質量濃度mg·mL-1;C3-洗脫液中烯丙基硫苷的質量濃度mg·mL-1;V0-烯丙基硫苷樣品的上樣體積mL;V1-吸附收集液的體積mL;V2-純水沖洗液的體積mL;V3-洗脫液的體積mL;M-樹脂質量g。

2 結果與討論

2.1 烯丙基硫代葡萄糖苷的標準曲線

烯丙基硫苷的標準曲線如圖2所示,得到的線性回歸方程為y=209.29x+4.0519,相關系數R2=0.9994,顯示了良好的線性關系。

圖2 烯丙基硫代葡萄糖糖苷標準曲線Fig.2 The standard curve of allyl glucosinolates

2.2 樹脂篩選

通過比較四種大孔樹脂在靜態(tài)吸附和解吸條件下對烯丙基硫苷的吸附量與解吸得率,確定最佳的樹脂類型。在控制實驗條件相同的情況下,僅改變樹脂類型這一變量,經過吸附、解吸,得到目標物烯丙基硫苷的吸附量與解吸得率,如圖3所示。相比ZGA430、ZGA412、ZGD630這三種弱堿性陰樹脂,大孔強堿性陰樹脂ZGA398的吸附量與解吸得率均最小,對于純化的烯丙基硫苷獲取量最少,不適宜使用。而在三種弱堿性陰樹脂中,ZGA430型樹脂的吸附量最大,其次是ZGD630型樹脂,最后是ZGA412型樹脂;ZGD630型樹脂的解吸得率最大,其次是ZGA412,然后是ZGA430。從目標物的獲得與樹脂的重復利用率來看,保證吸附量時,解吸得率越大越好。對于ZGA430,雖然它的吸附量最大,但是解吸得率較低,說明該樹脂上殘留了較多的烯丙基硫苷未解吸下來,不利于樹脂的重復利用,會減短樹脂的使用壽命。而ZGD630型樹脂的烯丙基硫苷吸附量較高,解吸得率最大。所以確定純化烯丙基硫代葡萄糖苷的最佳樹脂材料為ZGD630型弱堿性丙烯酸系陰樹脂。

圖3 樹脂對吸附量和解吸得率的影響Fig.3 Effect of resins on the adsorption and desorption rate

圖4中初步直觀展現了樹脂純化的效果,烯丙基硫苷提取液經高效液相檢測得到的色譜圖中雜質峰較多,表明粗提液中組分復雜,雜質較多。而通過樹脂純化后,可以明顯看到解吸液色譜圖中的雜質峰大多消失,目標峰清晰,說明去掉了大多數的雜質,純化效果明顯。但樣品具體純度還需后續(xù)實驗進一步驗證得到。

圖4 烯丙基硫代葡萄糖苷色譜圖Fig.4 The chromatogram of allyl glucosinolates注：1：烯丙基硫代葡萄糖苷解吸液；2：提取液；3：標準品。

2.3 吸附pH的影響

應用已確定的最佳樹脂材料ZGD630型樹脂,研究樹脂吸附時pH對純化效果的影響。以3 mol/L NaOH溶液與3 mol/L HCl溶液調節(jié)樣液pH分別為2、4、6、8、10、12,再加入ZGD630弱堿性陰樹脂進行吸附,然后進行洗脫。得到的結果如圖5所示,可以看到,當pH為2時,烯丙基硫苷的吸附量最大,在pH為2～8時,吸附量呈下降趨勢,隨后在pH10時略有升高,在pH12處無吸附量。在pH為2～12時,烯丙基硫苷的解吸得率先增加,并且在pH6時達到最大,隨后下降,在pH12處無解吸。雖然pH2處的吸附量最大,但是解吸得率很小,會影響樹脂的回收利用率,減少樹脂的使用壽命。而在pH6時烯丙基硫苷的吸附量雖然不是最高的,但是此時的解吸得率最大,表明樹脂上的烯丙基硫苷解吸的最多,樹脂上殘留少,利于樹脂重復使用,因而確定樹脂吸附時的最佳pH為6。

圖5 pH對吸附量和解吸得率的影響Fig.5 Effect of pH value on the adsorption and desorption rate

2.4 洗脫劑種類與濃度的影響

洗脫劑的選擇是影響樹脂純化效果的重要因素之一,常用洗脫劑NaCl溶液與HCl溶液在濃度為0.05、0.1、0.5和1 mol·L-1時對烯丙基硫苷的解吸得率見圖6。控制吸附條件一致,保證了樹脂對烯丙基硫代葡萄糖苷吸附量相同,繼而以不同洗脫劑的不同濃度進行洗脫,考察洗脫劑種類及濃度對硫苷的洗脫效果。如圖6所示,對比了兩種洗脫劑在相同濃度時的解吸得率?？梢钥吹?濃度為0.5 mol·L-1時兩種洗脫劑的解吸得率均高于其他濃度,其中NaCl溶液的解吸得率較大,即表明其解吸效果較好;濃度為0.05 mol·L-1時兩種洗脫劑的解吸得率均最小,解吸效果都最差。所以洗脫劑的種類與濃度均會影響解吸效果,相比HCl,NaCl不僅價廉、安全,而且對于烯丙基硫苷的解吸得率還高。因而確定最佳洗脫劑為0.5 mol·L-1NaCl溶液。

圖6 洗脫劑對解吸得率的影響Fig.6 Effect of eluent for desorption rate

2.5 動態(tài)吸附與解吸實驗

根據靜態(tài)實驗確定的樹脂ZGD630,采用濕法裝柱,將其裝填于小樹脂柱(Φ1.0 cm×20 cm)中,圖7展示了用純水平衡直接上樣(測得樣品pH為5.8)與用pH6磷酸鹽緩沖液平衡上樣(使用微量氫氧化鈉溶液調節(jié)樣品pH至6)后,經樹脂吸附得到的收集液中烯丙基硫苷的濃度隨時間的變化圖,即穿透曲線。用純水平衡直接上樣的方法,穿透曲線在16 min處穿透,呈逐漸上升態(tài)勢,并趨于平緩,于160 min后濃度不變,達到樣品原始濃度,即表明樹脂吸附量已飽和。用pH6磷酸鹽緩沖液平衡上樣的方法,曲線在20 min處穿透,與純水平衡中上升態(tài)勢相比略緩慢,隨后趨于平緩,于180 min時達到樣品原始濃度,樹脂飽和。純水平衡直接上樣使樹脂在160 min達到吸附飽和,而采用pH6的磷酸鹽緩沖液平衡,再上pH6的樣品則使樹脂在180 min才達到吸附飽和。從穿透時間與樹脂吸附飽和時間來看,純水平衡直接上樣的時間均要少,即省時,而且還省去了試劑調節(jié)pH的操作,省錢省力,節(jié)約成本。

圖7 不同的平衡液對烯丙基硫代葡萄糖苷穿透曲線的影響Fig.7 Effect of different equilibration buffers on the breakthrough curve of allyl glucosinolates

圖8顯示了用純水平衡直接上樣(測得樣品pH為5.8)與用pH6磷酸鹽緩沖液平衡上樣(使用微量氫氧化鈉溶液調節(jié)樣品pH至6)后,經氯化鈉溶液解吸得到的收集液稀釋30倍后測得的烯丙基硫苷濃度隨時間的變化圖,即洗脫曲線。當純水平衡直接上樣時,洗脫曲線在56 min處解吸得到的烯丙基濃度最大,為0.7414 mg·mL-1;當用pH6磷酸鹽緩沖液平衡上樣時,洗脫曲線在44 min處解吸得到的烯丙基濃度最大,為0.5146 mg·mL-1。雖然后者用時較短,但前者解吸得到的目標物顯然多于后者,從解吸量來看,還是應該用前者。所以應選用純水平衡直接上樣,得到的動態(tài)吸附量為2.057 mg·g-1。

圖8 不同平衡液對烯丙基硫代葡萄糖苷洗脫曲線的影響Fig.8 Effect of different equilibration buffers on the elution curve of allyl glucosinolates

當樹脂填裝于大樹脂柱(Φ5.0 cm×30 cm)時,純水平衡直接上樣吸附,上樣流速與洗脫流速設置為9 mL·min-1。圖9是烯丙基硫苷的穿透曲線,在30 min處穿透,這是由于大柱子的體積比小柱子的體積大,在平衡后存留的純水相應更多,樣液流入時會被稀釋,所以穿透時間要長。圖10是解吸液稀釋100倍后測得的烯丙基硫苷濃度隨時間變化的洗脫曲線,在70 min時解吸液濃度達到最大,270 min后濃度降至接近0,得到動態(tài)吸附量為0.6611 mg·g-1,小于小樹脂柱的動態(tài)吸附量。

圖9 烯丙基硫代葡萄糖苷的穿透曲線Fig.9 The breakthrough curve of allyl glucosinolates

圖10 烯丙基硫代葡萄糖苷的洗脫曲線Fig.10 The elution curve of allyl glucosinolates

3 結論

本研究應用大孔樹脂技術純化烯丙基硫代葡萄糖苷,通過靜態(tài)實驗篩選出了最適的樹脂類型為ZGD630型弱堿性陰離子交換樹脂;提取液pH對吸附的影響較大,確定了ZGD630型樹脂吸附的最適pH為6;解吸時所用的最佳洗脫劑為濃度為0.5 mol/L的NaCl溶液;根據動態(tài)實驗過樹脂柱時,由于用pH6的磷酸鹽緩沖液平衡柱子反而使樹脂解吸量下降,所以直接采用純水平衡更好,不必用磷酸鹽平衡,節(jié)省了成本;樹脂柱增大時,穿透時間變長,洗脫濃度達到最大的時間變晚,吸附量變小。

應用樹脂吸附法優(yōu)化了烯丙基硫苷純化的吸附與解脫條件,去掉了大多數雜質,研究了動態(tài)柱純化,為工業(yè)連續(xù)化批量生產做鋪墊;操作過程簡單,所需試劑廉價安全,具有廣泛的推廣、應用、生產潛質。但是對于該法純化得到的烯丙基硫苷的純度還需進一步檢測,并致力探索獲得高純烯丙基硫代葡萄糖苷的技術手段,為日后其在生產異硫氰酸烯丙酯等應用上提供原料基礎。

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Studies on purification of Allyl glucosinolates from horseradish by macroporous resin

XIE Sai1,2,3,DING Ke1,2,3,CHEN Xiang-ning1,2,3,*

(1.College of Food Science and Engineering,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China;2.Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,Beijing 102206,China;3.Beijing Key Laboratory Agriculture Product Detection and Control for Spoilage Organisms and Pesticide,Beijing 102206,China)

Inthispaper,purificationofallylglucosinolatesfromHorseradishbymacroporousresinwasstudied.First,ZGD630wasscreenedoutasthebestresinunderthestaticconditions.EffectsofpHandeluentontheextractionwereinvestigated.TheresultsshowedthatoptimalpHofextractwaspH6,andtheoptimaleluentwas0.5mol/LNaClsolution.Subsequently,thedynamicadsorptioncapacityanddynamicdesorptionyieldwiththeresincolumnweremeasured,andthereagentonequilibrationandsizeofcolumnunderthedynamicconditionwerediscussed.Itwasdiscoveredthatpurewaterwasbetteronequilibrationofcolumn.Meanwhile,sizeofcolumngotlarger,thedynamicadsorptioncapacitydecreased.Asimpleandeffectivepurifyingmethodofallylglucosinolateswasestablishedanditlaidthefoundationforitsindustrialproductionandtheresearchaboutallylisothiocyanateofitsdegradationproduct.

allylglucosinolates;macroporousresin;purification;horseradishroots

2016-04-25

謝賽(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工與安全，E-mail:13552761962@163.com。

*通訊作者:陳湘寧(1972-)，女，博士，教授，研究方向：農產品貯藏加工，E-mail:cxn@bua.edu.com。

北京市屬高等學校高層次人才引進與培養(yǎng)計劃項目(CIT&TCD20154045);北京市自然科學基金(14L00184);北京市屬高等學校高層次人才引進與培養(yǎng)計劃項目(CIT&TCD20150315);現代農業(yè)產業(yè)技術體系北京市葉類蔬菜創(chuàng)新團隊項目(BAIC 07-2016)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)21-0070-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.005