板藍(lán)根水提物體外抑制人H7N9禽流感病毒藥效研究

李征途，李 莉，王玉濤，黎旭釗，李潤(rùn)峰，李小波，楊子峰

(1. 呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣州醫(yī)科大學(xué))/廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2. 陜西省榆林市第一醫(yī)院，陜西 榆林 719000；3. 廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，廣東 廣州 510623)

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論 著

板藍(lán)根水提物體外抑制人H7N9禽流感病毒藥效研究

李征途1，李 莉2，王玉濤1，黎旭釗1，李潤(rùn)峰1，李小波3，楊子峰1

(1. 呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣州醫(yī)科大學(xué))/廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2. 陜西省榆林市第一醫(yī)院，陜西 榆林 719000；3. 廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，廣東 廣州 510623)

目的 評(píng)價(jià)板藍(lán)根水提物體外抑制人H7N9禽流感病毒的藥效。方法 利用改良的方法提取純化板藍(lán)根水提物。在雞胚尿囊腔中擴(kuò)增人H7N9禽流感病毒，以藥物毒性試驗(yàn)(MTT法)檢測(cè)藥物的毒性，在狗腎細(xì)胞上種植人流感病毒PR8株(A/PR/8/34，H1N1)和人H7N9禽流感病毒(A/Anhui/01/2013和A/Shanghai/01/2013)，采用細(xì)胞病變抑制法(CPE法)在治療作用策略下研究板藍(lán)根水提物在體外抑制人H7N9禽流感病毒的藥效。結(jié)果 板藍(lán)根水提物體外的半數(shù)有毒濃度(TC50)為>5 000 μg/mL。板藍(lán)根水提物在體外對(duì)于人流感病毒PR8株(A/PR/8/34，H1N1)的IC50為2 500 μg/mL，選擇指數(shù)(SI)>2；對(duì)于人禽流感病毒H7N9(A/Anhui/01/2013)的IC50為5 000 μg/mL，SI>1；對(duì)于H7N9(A/Shanghai/01/2013)IC50為2 500 μg/mL，SI>2。板藍(lán)根水提物在體外能抑制人H7N9禽流感病毒，且對(duì)于H7N9(A/Shanghai/01/2013)毒株的抑制效果更佳。結(jié)論 板藍(lán)根水提物在體外能有效抑制人H7N9禽流感病毒，藥效和作用于人流感病毒藥效相當(dāng)。

板藍(lán)根水提物；人H7N9禽流感病毒；體外藥效

2013年3月在中國(guó)出現(xiàn)了新型的流感病毒感染人，這種新型的流感病毒被命名為A型人H7N9禽流感病毒[1]。人H7N9禽流感病毒感染人后可以引起嚴(yán)重的肺部疾病，甚至導(dǎo)致患者死亡[2]。面對(duì)突如其來(lái)的新型H7N9禽流感病毒感染人的事件，由于使用流感疫苗的時(shí)機(jī)有誤，所以主要的武器就是抗流感病毒藥物。目前臨床用于治療與預(yù)防流感的藥物主要有M2離子通道抑制劑(金剛脘胺、金剛乙胺)、神經(jīng)氨酸酶抑制劑(奧司他韋及扎那米韋等)[3]。但是隨著這些藥物的廣泛使用，不良反應(yīng)和藥物的耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重[4-9]，甚至出現(xiàn)了人H7N9禽流感病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑耐藥的報(bào)道[10]?？共《局委熑源嬖谝恍叶礇Q的問(wèn)題，如高耐藥性、高不良反應(yīng)等，因此需要尋求新型的抗人H7N9禽流感病毒的藥物。面對(duì)新出現(xiàn)的禽流感病毒，中藥具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力。而在眾多傳統(tǒng)中藥中，板藍(lán)根治療流感歷史悠久，長(zhǎng)期以來(lái)已被廣泛用于防治呼吸道病毒性疾病。板藍(lán)根作為抗病毒、防流感的經(jīng)典品種，在1979—2010年的《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱藥典)中均有收錄，同時(shí)也是《國(guó)家基本藥物目錄》《醫(yī)保目錄》品種。2003年上半年“非典”時(shí)期，被全國(guó)防治非典型肺炎指揮部列入8大抗SARS病毒中成藥。本研究組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根的有效成分如水提物、多糖成分、木脂素化合物M4等均具有抗人流感病毒的作用[11-13]，日本也曾有報(bào)道糖蛋白和多糖為板藍(lán)根抗病毒成分之一。但是對(duì)于板藍(lán)根水提物能否抑制H7N9禽流感病毒仍是未知的，為了全面評(píng)價(jià)板藍(lán)根水提物對(duì)H7N9禽流感病毒的作用，本研究首次選擇了人流感病毒、H7N9禽流感病毒安徽株和上海株，觀察板藍(lán)根水提物體外抗H7N9禽流感病毒的藥效，旨在為進(jìn)一步研究其抗H7N9禽流感病毒機(jī)制提供更多依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 藥物 陽(yáng)性對(duì)照藥：羧酸奧司他韋和帕拉米韋，購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司；實(shí)驗(yàn)藥物：板藍(lán)根生藥材由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供，采自黑龍江大慶及安徽阜陽(yáng)板藍(lán)根GAP基地，由中國(guó)科學(xué)院華南植物院葉華國(guó)研究員鑒定為菘藍(lán)Isatis infigotica Fort.的根，即板藍(lán)根。南板藍(lán)根提取成分由澳門(mén)科技大學(xué)提供。

1.2 細(xì)胞株 狗腎細(xì)胞(MDCK)引自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.3 病毒株 ①人流感病毒：流感病毒PR8株(A/PR/8/34，H1N1)購(gòu)自美國(guó)ATCC；②禽流感病毒H7N9(A/Anhui/01/2013， A/Shanghai/01/2013)由國(guó)家流感中心提供，保存于廣東省出入境檢驗(yàn)檢疫局BSL-3實(shí)驗(yàn)室(呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室高致病病原微生物研究室)。上述毒株流感病毒通過(guò)接種于9日齡的雞胚尿囊腔中擴(kuò)增，35 ℃孵育2 d，收獲尿囊液。 用MDCK細(xì)胞滴定病毒，以細(xì)胞病變抑制法(CPE)判定這些毒株的半數(shù)感染量(TCID50/100 μL)作為病毒原始滴度。

1.4 主要試劑 二甲基亞砜(DMSO),美國(guó)SIGMA公司；MEM,美國(guó)GIBCO公司，批號(hào)：20140217；胎牛血清,美國(guó)GIBCO公司，批號(hào)：10099；10 mmol/L PBS，美國(guó)GIBCO公司,批號(hào)：20140122；1 mg/mL TPCK，廣州捷倍斯生物科技有限公司，批號(hào)：20140220 ；MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2],購(gòu)自Genebase；Agar(低熔點(diǎn)瓊脂)，購(gòu)自O(shè)XOID；DEAE(二乙氨乙基纖維素)，MP Biomedicals；結(jié)晶紫，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.5 板藍(lán)根水提物的制備和化學(xué)分析 參照文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行板藍(lán)根水提物提取和化學(xué)分析，分離程序見(jiàn)圖1。

圖1 北板藍(lán)根水提取物的制備及初步分離流程圖

1.6 藥物毒性試驗(yàn)(MTT法) 參照文獻(xiàn)[14]方法。按每孔約2.5×104MDCK細(xì)胞接種到96孔板，24 h后待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄去培養(yǎng)液，加入不同稀釋度的相應(yīng)藥物100 μL/孔，空白對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照孔加入100 μL/孔MEM，37 ℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)36～48 h，每孔加MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，置37 ℃、5%CO2溫箱中繼續(xù)孵育4 h。吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加100 μL DMSO，低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值。按照下列公式計(jì)算抑制率，并用Reed-Muench法計(jì)算50%毒性濃度為藥物半數(shù)有毒濃度(TC50)。抑制率=[(正常組平均OD值-空白組平均OD值)-(給藥組平均OD值-空白組平均OD值)]/(正常組平均OD值-空白組平均OD值)×100%。

1.7 板藍(lán)根水提取物體外抗流感病毒活性試驗(yàn) 以細(xì)胞病變抑制法 (Cytopathic Effect Reduction Method)在治療作用模式[11，15-16]下研究板藍(lán)根水提物對(duì)流感病毒的抑制作用。長(zhǎng)滿單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的MDCK細(xì)胞吸附病毒2 h，同時(shí)設(shè)定陽(yáng)性藥物和細(xì)胞對(duì)照，然后加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)液，置34 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h。細(xì)胞出現(xiàn)病變程度按以下6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄：(- )為細(xì)胞生長(zhǎng)正常，無(wú)病變出現(xiàn)；(±)為細(xì)胞病變少于整個(gè)單層細(xì)胞的10%；(+)為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的25%；()為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的50%；()為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的75%：()為細(xì)胞病變占整個(gè)單層細(xì)胞的75%以上。用Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)，并以選擇指數(shù)SI表示(SI=TC50/IC50),SI>2表示低毒高效,SI 1～2表示高毒低效,SI<1表示無(wú)效。

2 結(jié) 果

2.1 板藍(lán)根水提物藥物毒性的檢測(cè) MTT法體外檢測(cè)北板藍(lán)根水提物的半數(shù)有毒濃度(TC50)為>5 000 μg/mL。

2.2 板藍(lán)根水提物藥效 板藍(lán)根水提物對(duì)人流感H1N1(A/PR/8/34)有較好的體外抑制作用，IC50為2 500 μg/mL，SI>2，但和化學(xué)藥物羧酸奧司他韋和帕拉米韋有一定差距。板藍(lán)根水提物對(duì)人H7N9禽流感病毒也表現(xiàn)出較好的體外抗病毒藥效，相對(duì)于抗安徽H7N9毒株的藥效，其抗上海H7N9毒株的藥效更佳，和抗人流感H1N1的效果相當(dāng)，但和化學(xué)藥物藥效有一定差距。見(jiàn)表1。

表1 板藍(lán)根水提物抑制人H7N9禽流感病毒的藥效

3 討 論

2013年在中國(guó)爆發(fā)的人感染H7N9禽流感病毒疫情已成為全球關(guān)注的健康問(wèn)題，H7N9病毒感染人后除了引起死亡外，也可以導(dǎo)致輕癥的流感癥狀[17]。目前臨床上用于治療人感染H7N9禽流感病毒的藥物為神經(jīng)氨酸酶抑制劑，但是對(duì)于抗H7N9病毒的化學(xué)藥物存在可選擇性少、易產(chǎn)生耐藥性及不良反應(yīng)明顯等問(wèn)題，因此抗禽流感病毒藥物的新藥研發(fā)已成為臨床急需解決的重要問(wèn)題。傳統(tǒng)中草藥在我國(guó)長(zhǎng)期應(yīng)用于呼吸道感染性疾病的防治，且取得了較好效果，也為抗流感藥物研發(fā)提供了寶貴的線索和資源。傳統(tǒng)治療感冒的中藥作用機(jī)制和靶點(diǎn)與現(xiàn)有化學(xué)藥物不同，因此從中草藥中挖掘新型抗病毒藥物對(duì)于解決化學(xué)藥物長(zhǎng)期應(yīng)用引起的耐藥性和不良反應(yīng)問(wèn)題提供了一個(gè)新選擇。眾多傳統(tǒng)中藥中，板藍(lán)根對(duì)流感病毒等病毒性疾病均有一定療效。鄧甘霖[18]報(bào)道較大劑量復(fù)方板藍(lán)根治療急性咽炎安全有效。本研究組早期已經(jīng)證明板藍(lán)根水提物在體外具有抑制多種流感亞型病毒株以及禽流感病毒株(如H6N2，H7N3，H9N2)的作用[13]，而H9N2亞型曾有感染人類的報(bào)道[19]；板藍(lán)根水提物進(jìn)一步純化的產(chǎn)物G2(多糖)在體外對(duì)多種亞型的甲型流感及乙型流感病毒均有抑制作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根水提物對(duì)H7N9禽流感病毒具有體外抑制作用，其對(duì)于上海H7N9禽流感病毒株的抑制作用和其抑制人流感病毒H1N1(A/PR/8/34)的效果相當(dāng)，對(duì)于安徽H7N9禽流感病毒株的抑制作用略差，這可能與不同病毒間存在差異以及與板藍(lán)根水提物抑制H7N9禽流感病毒的機(jī)制有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。板藍(lán)根水提物在體外抑制人流感病毒和禽流感病毒藥效間的差異，可能與人流感病毒和禽流感病毒結(jié)合的受體(唾液酸受體；人流感病毒結(jié)合α2-6受體，禽流感病毒結(jié)合α2-3受體)以及人流感病毒和禽流感病毒的血凝素(HA)結(jié)構(gòu)存在差異有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)存在的不足之處是缺乏板藍(lán)根水提物抑制H7N9禽流感病毒機(jī)制的研究，但是筆者之前的研究已經(jīng)表明板藍(lán)根水提物以及板藍(lán)根水提物的純化物G2在體外抑制多種亞型流感病毒是通過(guò)抑制流感病毒HA，阻斷病毒吸附，從而抑制病毒的進(jìn)一步復(fù)制而起作用[12-13]，推測(cè)這可能也是板藍(lán)根水提物體外抑制H7N9禽流感病毒的作用機(jī)制，但是有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。這也可以解釋因?yàn)榘逅{(lán)根水提物作用于HA，而H7N9禽流感病毒間以及H7N9 禽流感病毒和人流感病毒間存在HA的差異，造成S-03在不同的H7N9禽流感病毒以及人流感病毒和H7N9禽流感病毒間存在抑制效果的差異。HA是H7N9禽流感病毒與宿主細(xì)胞間結(jié)合的橋梁，而板藍(lán)根水提物對(duì)HA存在抑制作用，可以阻斷H7N9禽流感病毒和人細(xì)胞間的吸附，有利于治療H7N9禽流感病毒導(dǎo)致的疾病。

綜上所述，板藍(lán)根水提物在體外具有抑制不同H7N9禽流感病毒的作用，可能的機(jī)制是通過(guò)抑制H7N9禽流感病毒的HA，阻斷H7N9禽流感病毒與宿主細(xì)胞的吸附，從而抑制病毒侵入宿主細(xì)胞而起作用，但是需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。中藥板藍(lán)根的成分復(fù)雜，在治療時(shí)不同的組分可以發(fā)揮不同的作用。板藍(lán)根水提物為板藍(lán)根的粗提取物，其成分為總多糖，但是也不排除板藍(lán)根中存在其他組分具有抗H7N9禽流感病毒作用，因此進(jìn)一步研究板藍(lán)根物質(zhì)構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)更多的抑制H7N9禽流感病毒成分是必要的。筆者下一階段將開(kāi)展板藍(lán)根水提物在小鼠體內(nèi)抗H7N9禽流感病毒藥效研究以及不同成分聯(lián)合用藥抗H7N9禽流感病毒的深入研究。

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Study on pharmacology of water extraction of radix isatidis in the inhibition of H7N9 avian influnza virus in vitro

LI Zhengtu1, LI Li2, WANG Yutao1, LI Xuzhao1, LI Runfeng1, LI Xiaobo3, YANG Zifeng1

(1.Guangzhou Medical University/The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, Guangdong, China; 2.The First Hospital of Yulin, Yulin 719000, Shaanxi, China; 3.Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guangzhou 510623, Guangdong, China)

Objective It is to observe the inhibition effect of water extraction of radix isatidis on H7N9 avian influnza virus in vitro.Methods Purification water extraction of radix isatidis were extracted by modified method. Human H7N9 avian influnza viruses were amplificated in chick embryo allantoic cavity,and their toxicity was detected by MMT method. Human influenza virus PR8(A/PR/8/34, H1N1) and human H7N9 avian influnza virus(A/Anhui/01/2013, H7N9) and (A/Shanghai/01/2013, H7N9) were planted in dog renal cells. Then the pharmacology of water extraction of radix isatidis in the inhibition of H7N9 avian influnza virus in vitro was studied by CPE method under strategy of the treatment. Results Half toxic concentration (TC50) of water extraction of radix isatidis in vitro was 5 000 μg/mL, IC50of human influenza virus PR8(A/PR/8/34, H1N1) was 2 500 μg/mL, selective index (SI)>2；IC50of human H7N9 avian influnza virus(A/Anhui/01/2013, H7N9) was 5 000 μg/mL, SI>1; IC50of human H7N9 avian influnza virus(A/Shanghai/01/2013, H7N9) was 5 000 μg/mL, SI>1. Chemical analysis showed that the main component of water extraction of radix isatidis was polysaccharide, nucleoside compounds and many kinds of amino acid also could be found. Water extraction of radix isatidis could inhibit H7N9 avian influnza virus in vitro, and the inhibition for H7N9 avian influnza virus(A/Shanghai/01/2013, H7N9) was the best. Conclusion Water extraction of radix isatidis could effectively inhibit H7N9 avian influnza virus in vitro, and the effect was similar to that for human influenza virus.

Water extraction of radix isatidis; human H7N9 avian influnza virus; pharmacology in vitro

李征途，男，博士，住院醫(yī)師，從事臨床病毒學(xué)相關(guān)研究工作。

楊子峰，E-mail：jeffyah@163.com

廣東省科技廳社會(huì)發(fā)展領(lǐng)域項(xiàng)目(2013B020224006)；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目-科技惠民專項(xiàng)(2014Y2-00031)；廣東省對(duì)外合作專項(xiàng)課題(2013B051000085)；國(guó)家自然科學(xué)基金廣東聯(lián)合基金資助項(xiàng)目(U1201227)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.35.001

R-33

A

1008-8849(2016)35-3877-04

2016-03-20