奇異變形桿菌中賴氨酸-2-羥基異丁?；鞍椎姆治?/h1>

2016-12-14 07:02:13董瀚陽郭振昌田姍姍翟貴金

色譜訂閱 2016年12期 收藏

關(guān)鍵詞：?；?/a>原核賴氨酸

董瀚陽, 郭振昌, 田姍姍, 翟貴金, 張 鍇

(1. 天津市醫(yī)學(xué)表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,天津市醫(yī)學(xué)表觀遺傳協(xié)同創(chuàng)新中心, 天津 300070)

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奇異變形桿菌中賴氨酸-2-羥基異丁?；鞍椎姆治?/p>

董瀚陽, 郭振昌, 田姍姍, 翟貴金, 張 鍇*

(1. 天津市醫(yī)學(xué)表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,天津市醫(yī)學(xué)表觀遺傳協(xié)同創(chuàng)新中心, 天津 300070)

蛋白質(zhì)的賴氨酸修飾廣泛參與基因調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、代謝等重要的生物過程。在真核細(xì)胞組蛋白上發(fā)現(xiàn)了一種新的賴氨酸修飾——2-羥基異丁酰化,這種修飾對(duì)于生殖細(xì)胞分化具有調(diào)控功能。該研究旨在探索這種修飾在原核生物非組蛋白中的特征。通過親和富集、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析,在奇異變形桿菌中鑒定到大量未見報(bào)道的2-羥基異丁?；鞍准捌湮稽c(diǎn),進(jìn)而考察了原核生物中2-羥基異丁?；揎椀鞍椎姆植继卣?、分子網(wǎng)絡(luò)和通路特點(diǎn)。研究表明，賴氨酸-2-羥基異丁?；谠松镏芯哂袕V泛的分布,其生物學(xué)意義值得進(jìn)一步研究。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;翻譯后修飾;2-羥基異丁?；?賴氨酸;奇異變形桿菌

蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translational modifications, PTMs)通常由生物酶介導(dǎo),發(fā)生在蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的化學(xué)修飾。目前已發(fā)現(xiàn)400多種蛋白質(zhì)修飾形式,如酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化、天冬酰胺的糖基化、賴氨酸的泛素化等[1-6]。這些修飾改變了蛋白質(zhì)氨基酸殘基的物理、化學(xué)性質(zhì)及蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。在各種蛋白質(zhì)的氨基酸殘基中,賴氨酸的修飾形式最為廣泛[7],如賴氨酸甲基化、泛素化和乙酰化等,這些修飾過程參與基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和能量代謝等重要生物過程的調(diào)控,一旦修飾和去修飾的動(dòng)態(tài)平衡發(fā)生異常,就可能導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生[8,9]。

盡管賴氨酸修飾分布廣泛,但其豐度較低[10],因此賴氨酸修飾的富集是其鑒定的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來,隨著蛋白質(zhì)翻譯后修飾富集技術(shù)的發(fā)展[7]及高效分離和高靈敏質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步,很多新的賴氨酸修飾方法被報(bào)道[10],如賴氨酸的丙?；痆11]、丁?；痆12]、琥珀?；痆13]、巴豆酰化[14]等。最近在組蛋白上發(fā)現(xiàn)了一種新的賴氨酸修飾----2-羥基異丁酰化,它對(duì)精子細(xì)胞的分化起到重要的調(diào)控作用[15]。這種新修飾是否具有更廣泛的分布和生物學(xué)意義值得進(jìn)一步關(guān)注。

本文采用抗體親和富集和蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)鑒定了原核細(xì)胞奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)中賴氨酸2-羥基異丁?；揎?結(jié)合生物信息學(xué)工具,探索了這一修飾在原核生物中的分布規(guī)律和蛋白質(zhì)特征,考察了這些修飾蛋白質(zhì)間的關(guān)聯(lián)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

EASY-nLC 1000液相色譜系統(tǒng)、Orbitrap Q-Exactive質(zhì)譜儀、LEGEND MICRO21R冷凍離心機(jī)、(美國(guó)ThermoFisher Scientific公司); VCX 130超聲破碎儀(美國(guó)SONICS公司); TS-2搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司); PowerPacTMBasic電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司); SY-1220恒溫水浴槽(美國(guó)精騏有限公司)。

2YT培養(yǎng)基(胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、三氯乙酸(TCA)、丙酮、二硫蘇糖醇(DDT)、碘乙酰胺(IAA)、半胱氨酸(上海生工生物工程有限公司); RIPA裂解液(上海碧云天生物科技研究所);胰蛋白酶(trypsin,北京華利世科技公司);抗2-羥基異丁?；贵w瓊脂糖凝珠、修飾多肽富集試劑盒(IP Buffer)(杭州景杰生物科技公司); C18 ZipTip(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 奇異變形桿菌的培養(yǎng)、蛋白質(zhì)的提取和修飾多肽的富集

用2YT培養(yǎng)基對(duì)奇異變形桿菌進(jìn)行培養(yǎng),將接種后的培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫?fù)u床中,以220 r/min培養(yǎng)過夜,待細(xì)菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,于4 ℃以5 000 g離心10 min,以獲取菌體沉淀。

用PBS洗滌菌體,加入適量RIPA裂解液后,超聲(運(yùn)行10 s,停滯30 s,共25次)至菌液澄清;于4 ℃以21 000 g離心30 min,上清液即為菌體蛋白質(zhì)溶液。加入與蛋白質(zhì)溶液等體積的TCA以沉淀蛋白質(zhì),離心，去除上清液后,加入5倍蛋白質(zhì)體積的冰丙酮進(jìn)行清洗(共2次),加入適量0.1 mol/L NH4HCO3充分溶解蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)溶液的終濃度為1～2 g/L;加入2%蛋白質(zhì)質(zhì)量的胰蛋白酶,于37 ℃水浴中過夜酶解;酶解后加入終濃度為5 mmol/L的DTT于56 ℃孵育1 h后,冷卻至室溫,加入終濃度15 mmol/L IAA避光孵育45 min,再加入終濃度30 mmol/L半胱氨酸于室溫孵育30 min;加入1%蛋白質(zhì)質(zhì)量的胰蛋白酶,于37 ℃振蕩孵育4 h;充分酶解后離心,上清液即為多肽溶液。

稱取1 mg多肽,加入200 μL預(yù)冷的IP Buffer充分溶解,按照修飾多肽富集試劑盒的步驟進(jìn)行富集,富集到的多肽溶液用真空離心濃縮儀干燥,將抽干的多肽粉末于-20 ℃冰箱冷藏。

1.3 色譜、質(zhì)譜條件

將上述多肽產(chǎn)物用C18 ZipTip除鹽,用10 μL流動(dòng)相A(0.1%(v/v)甲酸水溶液)溶解,采用C18毛細(xì)管柱(100 mm×50 μm, 2 μm,美國(guó)ThermoFisher Scientific公司)分離,流動(dòng)相由初始5%的流動(dòng)相B(含0.1%(v/v)甲酸、95%(v/v)乙腈的水溶液)在120 min內(nèi)線性升至95%的流動(dòng)相B,流速為0.3 μL/min,進(jìn)樣量為5 μL。

采用電噴霧離子(ESI)源進(jìn)行質(zhì)譜分析,具體參數(shù)如下:一級(jí)質(zhì)譜的掃描范圍為m/z350～1 800;分辨率(R)為70 000;采用Data dependent模式,選取10個(gè)相對(duì)豐度最高的離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜碎裂和掃描；采用HCD (higher energy collisional dissociation)裂解方式，歸一化碰撞能量為27%,自動(dòng)增益控制；動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為50 s。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Maxquant對(duì)HPLC-MS/MS的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行搜索分析,搜索時(shí)采用奇異變形桿菌全蛋白Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù),半胱氨酸的脲甲基化(carbamidomethylation)為固定修飾,2-羥基異丁?；癁榭勺冃揎?肽段一級(jí)離子質(zhì)量偏差設(shè)置為10×10-6(10 ppm),最大漏切位點(diǎn)設(shè)置為2個(gè),碎片離子質(zhì)量偏差設(shè)置為0.02 Da,以小于0.01的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)進(jìn)行過濾。最后將鑒定到的賴氨酸2-羥基異丁?；揎椀鞍淄ㄟ^DAVID 6.8、STRING10.0等在線生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC-MS/MS分析

首先在未進(jìn)行特異富集的情況下對(duì)奇異變形桿菌蛋白多肽直接進(jìn)行HPLC-MS/MS分析,鑒定得到3個(gè)賴氨酸2-羥基異丁?；揎椀牡鞍踪|(zhì),修飾豐度極低。當(dāng)采用泛抗體富集賴氨酸2-羥基異丁?；嚯臅r(shí)(具體方法見圖1),發(fā)現(xiàn)在212個(gè)蛋白質(zhì)的327個(gè)賴氨酸位點(diǎn)上存在2-羥基異丁酰化修飾,表明抗體富集提高了修飾的鑒定率,同時(shí)也暗示其在原核生物中具有較為廣泛的分布。

圖 1 奇異變形桿菌全蛋白賴氨酸2-羥基異丁?；姆治龇椒‵ig. 1 Analytical method for global profiling of lysine 2-hydroxyisobutyrylation in Proteus mirabilis Khib : lysine 2-hydroxyisobutyrylation.

圖 2 奇異變形桿菌2-羥基異丁?；揎椀鞍椎?生物過程和分子功能Fig. 2 Biological process and molecular function of 2-hydroxyisobutyrylated proteins in Proteus mirabilis

2.2 修飾蛋白的特征分析

為進(jìn)一步探究2-羥基異丁?；揎椀鞍自谠松镏械奶攸c(diǎn),利用DAVID軟件進(jìn)行GO(gene ontology)分析(見圖2)。生物學(xué)過程分析結(jié)果表明，大多數(shù)的修飾蛋白與基因轉(zhuǎn)錄和RNA代謝相關(guān);分子功能分析表明，大多數(shù)的修飾蛋白具有生物學(xué)活性;細(xì)胞組成分析顯示，大部分2-羥基異丁酰化修飾的蛋白質(zhì)主要存在于核糖體和胞漿內(nèi)。GO分析結(jié)果說明2-羥基異丁?；揎椩谠松镏蟹植紡V泛,具有潛在的生物學(xué)意義。

在蛋白質(zhì)分布特征的基礎(chǔ)上,運(yùn)用STRING軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,探究2-羥基異丁?；揎椀鞍字g的關(guān)系(見圖3)。結(jié)果表明,這些修飾的蛋白質(zhì)間關(guān)系密切,相互作用復(fù)雜。

圖 3 奇異變形桿菌中2-羥基異丁?；揎椀鞍组g的 相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig. 3 Protein-protein interaction network of 2-hydroxyisobutyrylated proteins in Proteus mirabilis

為考察2-羥基異丁酰化修飾的潛在功能,分析了某些重要生物學(xué)通路(pathways)中關(guān)鍵分子的修飾情況。結(jié)果顯示,很多重要代謝過程的催化酶中均存在2-羥基異丁酰化修飾位點(diǎn),尤其在糖酵解、檸檬酸循環(huán)、丙酮酸代謝等能量代謝過程中分布廣泛。丙酮酸代謝通路中關(guān)鍵分子的修飾情況見圖4。在丙酮酸脫氫酶組分E1(aceE)、甲酸乙酰還原酶(pflB)、蘋果酸脫氫酶(mdh)和延胡索酸還原酶亞基黃素蛋白(frdA)等成分中均發(fā)現(xiàn)大量未見報(bào)道的2-羥基異丁?；揎椢稽c(diǎn)。在aceE的兩個(gè)重要結(jié)構(gòu)域中共鑒定到17個(gè)2-羥基異丁?；揎椢稽c(diǎn),表明E1的酶活性受2-羥基異丁?；绊?此外,在mdh中,第81位精氨酸為酶活性結(jié)合位點(diǎn),而與此相鄰的82位賴氨酸也發(fā)生了2-羥基異丁?；揎?這種鄰近功能位點(diǎn)上的修飾會(huì)影響該蛋白質(zhì)的活性,從而調(diào)控蘋果酸脫氫酶的功能;丙酮酸代謝過程中,其他重要酶(如乙醛酸激酶、延胡索酸還原酶和乙醛脫氫酶)中的結(jié)構(gòu)域和關(guān)鍵活性位點(diǎn)均存在2-羥基異丁?；揎?表明2-羥基異丁?；揎椩谄娈愖冃螚U菌的丙酮酸代謝酶中可能分布廣泛且存在于重要的功能區(qū)域,其生物學(xué)意義值得進(jìn)一步深入研究。

圖 4 2-羥基異丁?；揎椀鞍自诒岽x中的分布Fig. 4 Distribution of 2-hydroxyisobutyrylated proteins in pyruvate metabolism 2-Hydroxy-hythel-Thpp: 2-(α-hydroxyethyl) thiamine diphosphate; S-acetyl-dihydrolipoamide-E: dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase; aceE: pyruvate dehydrogenase E1 component; pflB: formate acetyltransferase; mdh; malate dehydrogenase; frdA: fumarate reductase flavoprotein subunit; adhE: aldehyde-alcohol dehydrogenase.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過親和富集和HPLC-MS/MS分析,在奇異變形桿菌中鑒定得到在原核生物中未見報(bào)道的212個(gè)賴氨酸2-羥基異丁?；揎椀牡鞍踪|(zhì)和327個(gè)修飾位點(diǎn)。生物信息學(xué)分析表明,賴氨酸2-羥基異丁酰化修飾蛋白在奇異變形桿菌中分布廣泛,存在于多種細(xì)胞器中,參與重要的生物學(xué)過程,修飾蛋白質(zhì)間具有密切的聯(lián)系和互作關(guān)系。重要代謝通路中的調(diào)控酶均具有這一修飾形式,表明賴氨酸2-羥基異丁?；揎椩谠松镏芯哂袧撛诘纳飳W(xué)意義。

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Analysis of lysine 2-hydroxyisobutyrylation proteins inProteusmirabilis

DONG Hanyang, GUO Zhenchang, TIAN Shanshan, ZHAI Guijin, ZHANG Kai*

(1.TianjinKeyLaboratoryofMedicalEpigenetics,DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,TianjinMedicalUniversity,CollaborativeInnovationCenterofTianjinforMedicalEpigenetics,Tianjin300070,China)

Protein lysine modifications play important roles in gene regulation, transcription, metabolism and other biological processes. Lysine 2-hydroxyisobutyrylation on histones has recently been discovered as a novel protein modification, and this modification was associated with germ cell differentiation. The problem whether the novel modification may or may not exist in prokaryotes was investigated. A number of 2-hydroxyisobutyrylated proteins and sites were identified inProteusmirabilisusing affinity enrichment, high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) and bioinformatics. The modified proteins were further characterized according to protein distribution properties, interaction networks and pathways. The results indicated that lysine 2-hydroxyisobutyrylation is widely distributed in prokaryotes, and may be significant in biological functions in prokaryotes.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS); post-translational modifications (PTMs); 2-hydroxyisobutyrylation; lysine;Proteusmirabilis

10.3724/SP.J.1123.2016.08040

2016-08-31

國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃(2012CB910601);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21275077);天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(14JCYBJC24000).

Foundation item: National Basic Research Program of China (No. 2012CB910601); National Natural Science Foundation of China (No. 21275077); Tianjin Application Foundation and Advanced Technology Research Plan Program (No. 14JCYBJC24000)

O658

A

1000-8713(2016)12-1215-04

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(上)·研究快報(bào)

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(022)83336833,E-mail:kzhang@tmu.edu.cn.

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