芬戈莫德通過(guò)鞘氨醇-1-磷酸信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)研究

王忠夏 張廣 曹胤 江春平

·論著·

芬戈莫德通過(guò)鞘氨醇-1-磷酸信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)研究

王忠夏 張廣 曹胤 江春平

目的 探討鞘氨醇-1-磷酸（S1P）信號(hào)通路及其抑制劑芬戈莫德（FTY720）在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)不同侵襲潛能人肝細(xì)胞癌（HCC）細(xì)胞遷移能力的作用。方法 通過(guò)Real-time PCR和免疫印跡的方法比較低侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97L和高侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97H中S1P信號(hào)通路關(guān)鍵分子及下游促遷移信號(hào)通路的表達(dá)與活性水平。使用外源性S1P刺激MHCC-97L細(xì)胞，并使用siRNA干擾MHCC-97H細(xì)胞中S1P受體1（S1PR1）的表達(dá)，通過(guò)劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCC細(xì)胞遷移能力的變化。最后使用FTY720處理MHCC-97H細(xì)胞，觀察S1P及其下游信號(hào)通路表達(dá)及活性的變化，并研究FTY720對(duì)MHCC-97H細(xì)胞遷移能力的影響。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。結(jié)果高侵襲潛能MHCC-97H細(xì)胞中，S1PR1、鞘氨醇激酶1（SphK1）及鞘氨醇激酶2（SphK2）的相對(duì)表達(dá)量分別為5.94±0.78、1.64±0.30及1.48±0.28，高于低侵襲潛能MHCC-97L細(xì)胞的1.00±0.06、1.00±0.06及1.00±0.09，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = -10.96，-3.575，-2.841；P均< 0.05）。MHCC-97H細(xì)胞中S1PR1、SphK1及SphK2的蛋白表達(dá)水平及活性以及S1PR1下游與細(xì)胞遷移能力密切相關(guān)的Src、粘著斑激酶（FAK）和Janus激酶2（JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）信號(hào)通路活性明顯高于MHCC-97L細(xì)胞。外源性S1P可促進(jìn)MHCC-97L細(xì)胞的劃痕愈合能力。MHCC-97L的Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示：S1P刺激組遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)為（178.33±10.01）個(gè)/視野，顯著多于空白對(duì)照組的（88.00±8.54）個(gè)/視野，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 116.60，P < 0.01）。相反的，使用siRNA干擾MHCC-97H細(xì)胞中S1PR1表達(dá)后，細(xì)胞的劃痕愈合能力受到明顯抑制，Transwell實(shí)驗(yàn)顯示：陰性對(duì)照組遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)為（209.33± 4.51）個(gè)/視野，而S1PR1特異性siRNA轉(zhuǎn)染組遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)為（98.67±9.02）個(gè)/視野，顯著少于陰性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =19.01，P < 0.01）。FTY720作為S1P通路抑制劑，同樣抑制了MHCC-97H細(xì)胞的劃痕愈合能力，Transwell實(shí)驗(yàn)同樣顯示：FTY720處理組遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)為（58.67±6.03）個(gè)/視野，顯著少于對(duì)照組的（203.33±10.41）個(gè)/視野，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 20.833，P < 0.01）。FTY720的作用機(jī)制可能在于通過(guò)下調(diào)SphK1和S1PR1，抑制下游促遷移信號(hào)通路的活性，并進(jìn)一步抑制HCC細(xì)胞的遷移。結(jié)論 S1P信號(hào)通路參與了HCC細(xì)胞的遷移，而FTY720作為一種具有抗HCC活性的免疫抑制劑，可能通過(guò)下調(diào)S1P及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制HCC細(xì)胞的遷移能力。

癌，肝細(xì)胞； 鞘氨醇； 芬戈莫德； 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

肝癌是全球范圍內(nèi)位列腫瘤相關(guān)性死因第二位的惡性腫瘤，據(jù)世界癌癥統(tǒng)計(jì)顯示，全球約50﹪的肝癌發(fā)生在我國(guó)，居世界首位。目前肝癌是我國(guó)發(fā)病率排名第四、死亡率排名第三的惡性腫瘤，其中肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占肝癌總數(shù)的70﹪~ 90﹪[1-2]。肝移植可同時(shí)切除HCC病灶并替換病變肝臟，因此成為了HCC治療最有效的手段之一[3]。腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響HCC肝移植術(shù)后患者預(yù)后的主要因素之一，即使在嚴(yán)格選擇的患者中，移植術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍可達(dá)15﹪~20﹪[4]。在影響復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的諸多因素中，免疫抑制劑的使用起到了重要的作用?？鼓[瘤免疫抑制劑雷帕霉素的使用已被證實(shí)有助于降低移植后HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此，繼續(xù)尋找和評(píng)價(jià)具有抗HCC作用的免疫抑制劑可能有助于進(jìn)一步改善HCC肝移植的療效。鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）作為內(nèi)源性脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，參與了免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移等多種重要的生物學(xué)過(guò)程[6]。在腫瘤細(xì)胞中，S1P的生成催化酶鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SphK1）及鞘氨醇激酶2（sphingosine kinase 2，SphK2）常呈磷酸化的活化狀態(tài)，較正常細(xì)胞產(chǎn)生更多的S1P。S1P與其最重要的受體之一：S1P受體1（S1P receptor 1，S1PR1）結(jié)合后，可進(jìn)一步活化下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使Src、黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化并激活，通過(guò)促進(jìn)肌動(dòng)蛋白重構(gòu)、偽足形成、增加基質(zhì)金屬蛋白酶分泌等方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移能力，參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為[6-9]。芬戈莫德（fi ngolimod，F(xiàn)TY720）是一種作用機(jī)制獨(dú)特的新型免疫抑制劑，

它并不直接抑制淋巴細(xì)胞的激活和增生，而是通過(guò)調(diào)控S1P信號(hào)通路，使外周淋巴細(xì)胞歸巢進(jìn)入淋巴組織，并抑制激活的淋巴細(xì)胞活性，從而起到免疫抑制作用。近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用[10]。因此，F(xiàn)TY720作為一種潛在的抗腫瘤免疫抑制劑，可能對(duì)于降低HCC肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)具有積極的意義。由于細(xì)胞遷移是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的重要生物學(xué)過(guò)程，本研究使用不同侵襲潛能的HCC細(xì)胞系，探討了S1P信號(hào)通路及FTY720的干預(yù)對(duì)于HCC細(xì)胞遷移能力的影響。

材料與方法

一、主要材料與試劑

1.細(xì)胞系：低侵襲潛能人HCC細(xì)胞系MHCC-97L、高侵襲潛能人HCC細(xì)胞系MHCC-97H由復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所惠贈(zèng)，以含10﹪胎牛血清及100 U/ml青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.實(shí)驗(yàn)試劑：FTY720購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；S1P購(gòu)自美國(guó)Cayman公司。Trizol RNA提取試劑購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green Real-timePCR試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司；Real-timePCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。小干擾RNA（siRNA）由上海吉瑪基因技術(shù)有限公司合成，Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Life Technologies公司。S1P受體1（S1P receptor 1，S1PR1）一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；SphK1、磷酸化SphK1（p-SphK1）、SphK2、磷酸化SphK2（p-SphK2）一抗購(gòu)自美國(guó)ECM Biosciences公司；Src及磷酸化Src（p-Src）、FAK及磷酸化FAK（p-FAK）、JAK2及磷酸化JAK2（p-JAK2）、STAT3及磷酸化STAT3（p-STAT3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗及辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記二抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自南通碧云天生物技術(shù)公司。Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.Real-time PCR檢測(cè)人HCC細(xì)胞系S1P信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)水平：分別培養(yǎng)低侵襲潛能及高侵襲潛能人HCC細(xì)胞系MHCC-97L、MHCC-97H，收集細(xì)胞后使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備細(xì)胞cDNA，通過(guò)SYBR Green法使用Life Technologies公司Viia-7 Realtime PCR儀檢測(cè)兩種人HCC細(xì)胞系中S1P信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)水平，以上操作均按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.免疫印跡法檢測(cè)HCC細(xì)胞內(nèi)S1P信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)及活化情況：取各組處理后細(xì)胞加入RIPA裂解液，于4℃下孵育20 min，隨后于4℃下12 000 × g離心20 min，取上清液，以二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后95℃變性5 min。制備十二烷基磺酸鈉-丙烯酰胺凝膠，每孔上樣總蛋白20 μg進(jìn)行電泳分離，隨后使用半干式轉(zhuǎn)印槽將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（poly vinylidene fl uoride，PVDF）膜上，以5﹪脫脂牛奶封閉1 h后加入一抗，4℃下緩慢搖動(dòng)過(guò)夜，TBS-T洗膜3次，每次10 min。加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h后，TBS-T洗膜3次，每次10 min。使用化學(xué)發(fā)光法在天能5200化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)中顯影。

3.siRNA轉(zhuǎn)染：針對(duì)S1PR1 mRNA序列設(shè)計(jì)siRNA，siRNA序列為：5'-CUGCUCAAGACCGUA AUUATT-3'。以不針對(duì)任何已知基因的亂序siRNA作為陰性對(duì)照。在超凈工作臺(tái)中按Lipofectamine RNAiMAX試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在一離心管中加入適當(dāng)體積的Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基，再加入適量S1PR1 siRNA或陰性對(duì)照siRNA后混勻。取另一離心管，加入與上一步相同體積的Opti-MEM，按說(shuō)明書(shū)所示劑量加入Lipofectamine RNAiMAX脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑并混勻。將兩離心管中液體混合并混勻，靜置5 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

4.外源性S1P刺激HCC細(xì)胞：S1P以含0.5﹪去脂肪酸牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的無(wú)菌PBS溶解為母液備用，進(jìn)行外源性S1P刺激實(shí)驗(yàn)時(shí)加入上述S1P溶液至培養(yǎng)基，使其終濃度為200 nmol/L，并使用不含S1P的BSA溶液作為陰性對(duì)照。

5.細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCC細(xì)胞遷移能力：將HCC細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁并生長(zhǎng)至100﹪融合。在生物安全柜中以無(wú)菌移液器吸頭在細(xì)胞上劃痕，保持各組劃痕寬度一致，吸去培養(yǎng)基，以無(wú)菌PBS洗3次，去除脫落的細(xì)胞后加入無(wú)血清培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下拍照留存。按實(shí)驗(yàn)所需方法處理細(xì)胞，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，

觀察劃痕相同位置愈合情況，并拍照留存。

6.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCC細(xì)胞遷移能力：取8 μm孔徑的Transwell小室放置在24孔板中，以人纖維粘連蛋白（Fibronectin）包被小室下側(cè)面。消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以無(wú)血清培養(yǎng)基重懸5×103個(gè)細(xì)胞接種于Transwell小室上室，下室加入含10﹪胎牛血清的完全培養(yǎng)基。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所需處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用棉簽擦凈Transwell小室上室內(nèi)細(xì)胞，甲醇固定小室下側(cè)面細(xì)胞，以0.2﹪結(jié)晶紫染色后，顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移后細(xì)胞，并拍照留存。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

使用PASW Statistics 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，S1PR1、SPHK1、SPHK2相對(duì)表達(dá)量及Transwell實(shí)驗(yàn)遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)以± s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），并采用Dunnett法與空白對(duì)照組進(jìn)行兩兩比較，P < 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同侵襲潛能人HCC細(xì)胞S1P信號(hào)通路分子表達(dá)與活性水平的比較

Real-time PCR結(jié)果顯示，低侵襲潛能MHCC-97L細(xì)胞中，S1P信號(hào)通路的重要受體S1PR1相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.06，而在高侵襲潛能的MHCC-97H細(xì)胞中，S1PR1相對(duì)表達(dá)量為5.94±0.78，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = -10.96，P < 0.01）。同樣的，在MHCC-97L細(xì)胞中，催化S1P生成的關(guān)鍵酶SPHK1和SPHK2相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.06和1.00±0.09，而在MHCC-97H中，SPHK1和SPHK2的相對(duì)表達(dá)量分別為1.64±0.30和1.48±0.28，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = -3.575，-2.841；P = 0.023，0.047）。因此，相比于低侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97L，高侵襲潛能HCC細(xì)胞中，S1PR1、SPHK1、SPHK2均呈高表達(dá)狀態(tài)（圖1）。

圖1 Real-time PCR法檢測(cè)低侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97L及高侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97H中S1P信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)

同樣，免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示，高侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97H中S1PR1、SphK1及SphK2的蛋白表達(dá)水平顯著高于低侵襲潛能MHCC-97L細(xì)胞。并且SphK1和SphK2在MHCC-97H細(xì)胞中呈磷酸化形式，提示酶的活性處于活化狀態(tài)（圖2）。進(jìn)一步的，MHCC-97H細(xì)胞中，受S1PR1調(diào)控且與細(xì)胞遷移能力密切相關(guān)的Src、FAK和JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白磷酸化水平明顯高于MHCC-97L細(xì)胞，提示在高侵襲潛能HCC細(xì)胞中上述通路處于激活狀態(tài)（圖3）。

二、調(diào)控S1P信號(hào)通路可影響HCC細(xì)胞的遷移能力

使用外源性S1P刺激低侵襲潛能MHCC-97L細(xì)胞后，使用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力顯示：相比于空白對(duì)照及陰性對(duì)照組，200 nmol/L濃度的S1P顯著促進(jìn)了HCC細(xì)胞的劃痕愈合能力（圖4）。同樣的，使用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力顯示：200 nmol/L濃度的外源性S1P明顯促進(jìn)了HCC細(xì)胞的遷移能力（圖5），對(duì)遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯示（圖6），空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及S1P刺激組間遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)存在顯著差異（F = 116.60，P <

0.01）。陰性對(duì)照組和S1P刺激組分別與空白對(duì)照組進(jìn)行兩兩比較顯示：空白對(duì)照組遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)為（88.00±8.54）個(gè)/視野，陰性對(duì)照組遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)為（90.33±5.51）個(gè)/視野，兩組間沒(méi)有顯著

差異（P = 0.92）；而S1P刺激組遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)為（178.33±10.01）個(gè)/視野，與空白對(duì)照組相比存在顯著差異（P < 0.01）。

圖2 免疫印跡法檢測(cè)低侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97L及高侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97H中S1P信號(hào)通路關(guān)鍵分子在蛋白水平的差異

圖3 免疫印跡法檢測(cè)低侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97L及高侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97H中受 S1PR1 調(diào)控的下游信號(hào)通路激活水平

圖4 倒置顯微鏡觀察S1P促進(jìn)低侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97L的劃痕愈合能力 （×40）

圖5 倒置顯微鏡觀察S1P促進(jìn)低侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97L的遷移能力 （結(jié)晶紫染色×200）

圖6 S1P刺激MHCC-97L細(xì)胞后Transwell遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)

圖7 免疫印跡法檢測(cè)siRNA 轉(zhuǎn)染高侵襲潛能 MHCC-97H細(xì)胞后 S1PR1 的表達(dá)

相反的，使用siRNA的方法轉(zhuǎn)染MHCC-97H細(xì)胞后，免疫印跡的結(jié)果提示S1PR1特異性siRNA顯著抑制了S1PR1的表達(dá)，而與空白對(duì)照相比，陰性對(duì)照siRNA對(duì)S1PR1的表達(dá)無(wú)明顯影響（圖7）。

使用S1PR1特異性siRNA干擾高侵襲潛能MHCC-97H細(xì)胞后，使用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力顯示：相比于亂序siRNA轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組，S1PR1特異性siRNA顯著抑制了HCC細(xì)胞的劃痕愈合能力（圖8）。而使用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力顯示：S1PR1干擾明顯降低了HCC細(xì)胞的遷移能力（圖9），對(duì)遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯示（圖10），陰性對(duì)照組遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)為（209.33± 4.51）個(gè)/視野，而S1PR1特異性siRNA轉(zhuǎn)染組遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)為（98.67±9.02）個(gè)/視野，顯著少于陰性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 19.01，P < 0.01）。

三、FTY720通過(guò)抑制S1P信號(hào)通路抑制HCC細(xì)胞遷移能力

使用S1P信號(hào)通路抑制劑FTY720處理高侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97H，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：5 μmol/L濃度的FTY720顯著抑制了高侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97H的劃痕愈合能力（圖11）。而使用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力也顯示：FTY720處理明顯降低了HCC細(xì)胞的遷移能力（圖12），對(duì)遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯示（圖13），對(duì)照組遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)為（203.33± 10.41）個(gè)/視野，而FTY720處理組遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)為（58.67±6.03）個(gè)/視野，顯著少于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 20.833，P < 0.01）。

使用0、1，2.5，5，7.5，10 μmol/L濃度的FTY720處理MHCC-97H細(xì)胞24 h后，通過(guò)免疫印跡方法檢測(cè)S1P信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)量及活化情況。結(jié)果顯示，F(xiàn)TY720可劑量依賴性的下調(diào)SphK1及S1PR1，并進(jìn)一步對(duì)于S1PR1調(diào)控的促遷移信號(hào)通路Src、FAK及JAK2/STAT3的磷酸化具有抑制

作用，這可能是其抑制HCC細(xì)胞遷移的潛在機(jī)制（圖14）。

圖8 倒置顯微鏡觀察干擾S1PR1抑制高侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97H的劃痕愈合能力 （×40）

圖9 倒置顯微鏡觀察干擾S1PR1抑制高侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97H的遷移能力 （結(jié)晶紫染色×200）

圖10 S1PR1特異性siRNA轉(zhuǎn)染MHCC-97H細(xì)胞后Transwell實(shí)驗(yàn)遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)

討 論

免疫抑制劑的使用是肝移植術(shù)后必要的治療手段，但也與移植術(shù)后HCC的復(fù)發(fā)密切相關(guān)[11]。雷帕霉素是目前臨床唯一可用的抗腫瘤免疫抑制

劑，對(duì)于預(yù)防肝移植術(shù)后HCC復(fù)發(fā)具有有益的作用[12]。因此，尋找和評(píng)價(jià)兼具抗腫瘤作用的免疫抑制劑對(duì)于改善HCC肝移植的預(yù)后具有積極的意義。芬戈莫德（FTY720）是一種作用機(jī)制獨(dú)特的免疫抑制劑，通過(guò)抑制S1P信號(hào)通路，促進(jìn)循環(huán)淋巴細(xì)胞歸巢淋巴組織并抑制激活的淋巴細(xì)胞活性，發(fā)揮免疫抑制作用[13]。S1P信號(hào)通路不僅參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，也調(diào)控了惡性腫瘤的諸多重要生物學(xué)行為。細(xì)胞內(nèi)SphK1和SphK2催化產(chǎn)生S1P，而S1P進(jìn)一

步與其受體結(jié)合，啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。作為S1P受體之一，S1PR1通過(guò)激活下游的Src[8-9]、FAK[7,14]和JAK2/STAT3[14-15]等信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞遷移，從而參與惡性腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移過(guò)程。

圖11 倒置顯微鏡觀察FTY720抑制高侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97H的劃痕愈合能力 （×40）

圖12 倒置顯微鏡觀察FTY720抑制高侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97H的遷移能力 （結(jié)晶紫染色×200）

圖13 FTY720處理MHCC-97H細(xì)胞后Transwell實(shí)驗(yàn)遷移過(guò)膜細(xì)胞數(shù)

圖14 FTY720 抑制高侵襲潛能HCC細(xì)胞MHCC-97H促遷移信號(hào)通路的活性

本研究的結(jié)果顯示，相比于低侵襲潛能的同源細(xì)胞系MHCC-97L，高侵襲潛能的MHCC-97H細(xì)胞中，SphK1/2和S1PR1在mRNA和蛋白水平呈顯著高表達(dá)狀態(tài)，且作為催化S1P形成的關(guān)鍵酶，SphK1/2處于活化狀態(tài)。更為重要的是，受S1PR1調(diào)控且與促進(jìn)腫瘤遷移密切相關(guān)的Src、FAK和JAK2/STAT3信號(hào)通路在高侵襲潛能HCC細(xì)胞中呈激活狀態(tài)，提示S1P及其下游信號(hào)通路可能與HCC細(xì)胞的遷移能力密切相關(guān)。本研究使用相同基因背景的不同侵襲能力HCC細(xì)胞，初步建立了S1P及其促遷移信號(hào)通路活化情況與HCC細(xì)胞遷移能力的相關(guān)性，上述結(jié)果還需在不同侵襲轉(zhuǎn)移狀態(tài)HCC臨床樣本中進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。

進(jìn)一步的，使用S1P刺激低侵襲潛能的MHCC-97L細(xì)胞可顯著增強(qiáng)其遷移能力，而相應(yīng)的在高侵襲潛能的MHCC-97H細(xì)胞中干擾S1PR1的表達(dá)抑制了高侵襲細(xì)胞的遷移能力。提示S1P通過(guò)S1PR1調(diào)控下游信號(hào)通路，促進(jìn)HCC細(xì)胞的遷移，進(jìn)而可能參與其臨床復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。FTY720作為S1P信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑，其抗腫瘤藥理作用可能包括通過(guò)下調(diào)SphK1和S1PR1的活性和表達(dá)水平，從而抑制S1P相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，顯著抑制下游Src、FAK及JAK2/STAT3通路的活性，并進(jìn)一步通過(guò)下調(diào)上述通路對(duì)于肌動(dòng)蛋白重構(gòu)、細(xì)胞偽足形成及基質(zhì)金屬蛋白酶分泌等的調(diào)控[8-9,14-16]，對(duì)HCC細(xì)胞的遷移能力產(chǎn)生抑制。

本文的結(jié)果和已有的證據(jù)證明，F(xiàn)TY720可直接抑制SphK1在蛋白水平的表達(dá)，或通過(guò)下調(diào)其酶活性，使得S1P產(chǎn)生減少。另外，F(xiàn)TY720作為S1P類(lèi)似物，還可以降低受體S1PR1的表達(dá)。因此，F(xiàn)TY720可從S1P生成酶和受體兩個(gè)水平同時(shí)抑制S1P信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13,16-18]。本研究還提示，高侵襲潛能HCC細(xì)胞中SphK1不僅表達(dá)量高于低侵襲潛能HCC細(xì)胞，且處于磷酸化的活化形式。由于FTY720可下調(diào)SphK1的蛋白表達(dá)總量，因而無(wú)論SphK1的磷酸化活性如何，F(xiàn)TY720均可通過(guò)抑制SphK1產(chǎn)生S1P的作用，下調(diào)S1P相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但FTY720是否通過(guò)影響SphK1的磷酸化影響其酶活性也是值得研究的話題。與SphK1不同，SphK2主要位于細(xì)胞核，目前對(duì)于其功能了解尚不清楚。SphK2可能通過(guò)產(chǎn)生S1P，在細(xì)胞核內(nèi)參與調(diào)控組蛋白的乙?；?，進(jìn)而影響基因表達(dá)[19]。FTY720對(duì)于SphK2是否存在直接的藥理作用也不完全明確，本研究結(jié)果提示SphK2的表達(dá)及活性同樣可能與HCC細(xì)胞的遷移能力相關(guān)，因此SphK2是否直接參與HCC細(xì)胞遷移及FTY720對(duì)SphK2的表達(dá)和酶活性是否存在調(diào)節(jié)作用同樣值得進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明，S1P及其下游信號(hào)通路參與了HCC細(xì)胞的遷移。而FTY720作為S1P信號(hào)抑制劑，對(duì)HCC細(xì)胞遷移具有顯著的抑制作用。FTY720兼具抗腫瘤和免疫抑制的活性[16]，因此可能對(duì)于改善HCC肝移植術(shù)后的臨床預(yù)后具有一定的意義，值得進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究深入探討其臨床價(jià)值。

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Immunosuppressant fingolimod inhibits the migration of hepatocellular carcinoma cells throughsphingosine-1-phosphate signaling pathway

Wang Zhongxia, Zhang Guang, Cao Yin, JiangChunping. Department of Hepatobiliary Surgery, the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, China

Objective To investigate the effects of fingolimod (FTY720), an inhibitor

Carcinoma，hepatocellular； Sphingosine； Fingolimod； Cell movement

2016-05-23）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.05.002

國(guó)家自然基金項(xiàng)目（81572393，81602093）；南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目（ZKX15020）；江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（BK20160118）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金（021414380215、021414380242、021414380258）

210008 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院肝膽外科

江春平，Email: chunpingjiang@163.com

of sphingosine-1-phosphate (S1P) signaling pathway, on the migration of hepatocellular carcinoma (HCC) cells with different invasive ability in vitro. Method The expression of S1P signaling pathway molecules was compared using Real-time PCR and immunoblotting in highly invasive HCC cell line MHCC-97H and less invasive HCC cell line MHCC-97L. Exogenous S1P was used to stimulate MHCC-97L cells and siRNA transfection was used to interfere the expression of S1P receptor 1 (S1PR1) in MHCC-97H cells. The ability of migration was observed using wound healing assay and transwell assay. Finally, MHCC-97H cells were treated with FTY720. After treatment, the expression of S1P signaling pathway molecules were determined by immunoblotting. Data among multiple groups were compared by one-way ANOVA and data between two independent groups were compared by t-test. Result Relative expression of S1PR1, sphingosine kinase 1 (SphK1) and sphingosine kinase 2 (SphK2) were significantly higher in MHCC-97H HCC cells as compared with MHCC-97L cells (5.94±0.78 versus 1.00±0.06, 1.64±0.30 versus 1.00±0.06 and 1.48 ±0.28 versus 1.00±0.09, t = -10.96, -3.575, -2.841；P < 0.05). The protein levels of S1PR1, SphK1, SphK2 in MHCC-97H cells were also higher than those in MHCC-97L cells. Accordingly, the expression of S1PR1 downstream molecules Src, focal adhesion kinase (FAK) and Janus kinase 2(JAK2)/signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) were also upregulated in MHCC-97H cells. Exogenous S1P promoted wound healing of MHCC-97L cells. As indicated by Transwell assay, migrated cell number in the S1P group was 178.33±10.01 per field, which was significantly more than that in the control group (88.00±8.54 per field, F = 116.60，P < 0.01). In contrast, interfering the expression of S1PR1 in MHCC-97H cells by siRNA inhibited wound healing and, as indicated by Transwell assay, migrated cells in S1PR1 siRNA group was 98.67±9.02 per field, which was significantly less than that in the negative control group (209.33±4.51 per field, t =19.01, P < 0.01). As an inhibitor of S1P pathway, FTY720 also inhibited wound healing ability of MHCC-97H cells. Similarly, in Transwell assay, migrated cell number in FTY720 group was significantly smaller than that in the control group (58.67±6.03 per field versus 203.33±10.41 per field, t = 20.833，P < 0.01). FTY720 inhibited S1P-mediated signaling transduction by down-regulating SphK1 and S1PR1, which inhibited the migration of HCC cells. Conclusion S1P signaling pathway participates in the migration of HCC cells. As an immunosuppressant with anti-HCC activity, FTY720 inhibits the migration of HCC cells through S1P signal pathway.

王忠夏,張廣,曹胤,等. 芬戈莫德通過(guò)鞘氨醇-1-磷酸信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志:電子版, 2016, 6(5):270-279.