臍帶血干細(xì)胞對(duì)慢乙肝失代償期肝硬化的臨床療效

王麗華陳玉梅李炳茂孫建順楊彬張麗賢

·論著·

臍帶血干細(xì)胞對(duì)慢乙肝失代償期肝硬化的臨床療效

王麗華1陳玉梅1李炳茂2孫建順1楊彬1張麗賢1

目的 觀察經(jīng)肝動(dòng)脈注入臍帶血干細(xì)胞治療慢乙肝肝硬化的臨床療效。方法 納入60例慢乙肝肝硬化失代償期患者，經(jīng)肝動(dòng)脈注人臍帶血干細(xì)胞（2 ~ 6）×107，觀察治療后1周、4周、12周、20周肝功能[白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBIL）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、凝血酶原活動(dòng)度（PTA）]水平變化；檢測(cè)第20周血清肝纖維化指標(biāo)[層粘連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原PC-Ⅲ、Ⅳ型膠原Ⅳ-C]改善情況，上述兩種指標(biāo)采用配對(duì)t檢驗(yàn)，同時(shí)觀察臨床癥狀（食欲、精力、體力情況）及體征（水腫、腹水情況）的改善情況。結(jié)果 全部病人均順利完成治療，治療后未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)及并發(fā)癥；治療12周時(shí)多半患者食欲、精力、體力改善至正常水平，雙下肢浮腫、腹腔積液等體征消失，治療后1周血ALT、AST較治療前增高（t = 2.289，2.603；P = 0.026，0.012）、ALB較治療前降低（t = 2.352，P = 0.022），TBIL較治療前略高（t = 1.985，P = 0.052），PTA較治療前略低（t = 1.924，P = 0.059），但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；治療后4周ALT、AST、ALB、PTA、TBIL均恢復(fù)至治療前水平；治療后12周ALT、AST（t = 2.259，P = 0.028）較治療前降低（t = 2.565，2.259；P = 0.013，0.028），PTA較治療前升高（t = 2.572，P = 0.013），ALB較治療前明顯改善（t = 20.04，P < 0.001），TBIL較治療前略低（t = 1.962，P = 0.055），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；20周后各項(xiàng)指標(biāo)ALT、AST、ALB、PTA、TBIL及肝纖四項(xiàng)均改善（t = 10.13，8.652，26.686，6.385，4.194，P均< 0.001）。結(jié)論 經(jīng)肝動(dòng)脈注入臍帶血干細(xì)胞治療慢乙肝肝硬化近期有效。

臍血干細(xì)胞； 肝硬化； 肝炎，乙型，慢性

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是導(dǎo)致肝硬化的主要原因之一，失代償期肝硬化往往由代償期肝硬化隱匿發(fā)展而至，一些相關(guān)因素可導(dǎo)致病情發(fā)展。乙型病毒性肝炎急性發(fā)作可導(dǎo)致大約14﹪代償期肝硬化患者進(jìn)展為失代償期，表現(xiàn)為肝硬化急性失代償。失代償期肝硬化為肝病終末期，目前肝移植被認(rèn)可是肝病終末期的唯一有效方法，但肝臟來(lái)源稀少、移植費(fèi)昂貴和長(zhǎng)久使用抗免疫制劑等原因限制了其廣泛應(yīng)用，近來(lái)隨著干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)興起，發(fā)現(xiàn)臍帶血干細(xì)胞移植可以代償部分肝功能，現(xiàn)將我科近年來(lái)臨床研究作以下報(bào)道。

資料與方法

一、一般資料

1.病例選擇的標(biāo)準(zhǔn)：（1）依據(jù)相關(guān)癥狀、體征以及輔助檢查確診為慢乙肝失代償期肝硬化患者，肝功能Child-pugh分級(jí)A、B、C級(jí)（年齡超過(guò)18歲，低于70歲）；（2）病因?qū)W明確的HBV感染證據(jù)；（3）目前只靠藥物治療效果不明顯；（4）向患者家屬及患者本人講解后，并詳細(xì)了解臍帶血干細(xì)胞治療的風(fēng)險(xiǎn)，仍同意接受治療并簽署臍帶血干細(xì)胞治療知情同意書。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）其他引起肝硬化的常見(jiàn)病因如丙型病毒性肝炎感染、飲酒、藥品等也需經(jīng)過(guò)詢問(wèn)病史或相關(guān)的檢查進(jìn)行確定或排除；（2）并存肝、心、腎、肺等重要器官功能衰竭或血液病患者；（3）原發(fā)性肝癌；（4）感染；（5）其它器官惡性腫瘤；（6）休克、生命體征不穩(wěn)定及不能配合操作者；（7）有嚴(yán)重過(guò)敏史者或高度過(guò)敏體質(zhì)。

依據(jù)上述原則選擇2009年10月至2014年10月哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院消化內(nèi)科明確的慢乙肝失代償期肝硬化患者60例，其中男48例，女12例；年齡40 ~ 66歲，中位年齡（54.56±6.39）歲；ChildpughC級(jí)14例，B級(jí)46例。入院后均給予患者常規(guī)保肝藥物及利尿治療1周，停用保肝藥物后給予臍帶血干細(xì)胞治療，治療前行肝功能化驗(yàn)、病毒檢測(cè)、腹部CT檢查并予以排除肝癌。

二、方法

1.分離：無(wú)菌采取臍帶血（經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，臍帶血取自健康足月順產(chǎn)新生兒臍血，每份60 ~ 120 ml，采集前產(chǎn)婦需做梅毒抗體、HIV抗體、乙肝五項(xiàng)、丙肝抗體、肝功能、支原體等檢測(cè)全部合格后方可采集），斷臍后1 ~ 2 min內(nèi)采集，于采集后12 h內(nèi)分離出0.5 ml細(xì)胞懸液，分選出臍帶血干細(xì)胞數(shù)量為（2 ~ 6）×107應(yīng)用于臨床輸注。

2.移植：應(yīng)用利多卡因麻醉，采用改良Sildinger技術(shù)，穿刺右側(cè)股動(dòng)脈超選肝固有動(dòng)脈，行數(shù)字減影血管造影以排除早期肝癌，將臍帶血干細(xì)胞懸液約12 ~ 16 ml按1:1比例用生理鹽水稀釋后經(jīng)導(dǎo)管以1 ml每分鐘的速度緩慢注入，手術(shù)完成后拔出導(dǎo)管，穿刺部位給予加壓包扎，右下肢制動(dòng)24 h。

3.觀察指標(biāo)：（1）記錄手術(shù)后第1周、4周、12周、20周臨床癥狀改善情況；（2）治療后第1周、4周、12周、20周觀察肝功能[白蛋白（albumin，ALB）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、凝血酶原活動(dòng)度（prothrombin time activity，PTA）]變化；（3）手術(shù)后第20周觀察血清肝纖維化指標(biāo)，包括[層粘連蛋白（laminin，LN）、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、Ⅲ型前膠原PC-Ⅲ、Ⅳ型膠原Ⅳ-C]改善情況；（4）觀察治療后不良反應(yīng)發(fā)生情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料（ALB、TBIL、ALT、AST、PTA）及（LN、HA、Ⅲ型前膠原 PC-Ⅲ、Ⅳ型膠原Ⅳ-C）變化以x ± s表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行組內(nèi)比較，以P < 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、成功率及不良反應(yīng)

60例患者均被成功將臍帶血干細(xì)胞注入至肝固有動(dòng)脈，手術(shù)成功率為100﹪；沒(méi)有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重并

發(fā)癥及不良反應(yīng)，治療后輕度發(fā)熱4例，均在24 h內(nèi)自行改善，且無(wú)肝區(qū)疼痛、出血、局部感染等情況發(fā)生。

二、臨床癥狀改善情況

治療后1周時(shí)40例患者食欲、乏力較前有所好轉(zhuǎn)，但腹脹、腹水、雙下肢水腫無(wú)好轉(zhuǎn)，第4周時(shí)，38例患者精力、體力、食欲恢復(fù)正常，不再需要輸注ALB，雙下肢水腫消失，腹脹、腹水有所改善，但肝功指標(biāo)未得到明顯好轉(zhuǎn)；治療后第12周52例患者精力、體力、食欲恢復(fù)正常，腹脹、腹水等情況消失，肝功能指標(biāo)較前改善。

三、肝功能與術(shù)前對(duì)比

肝功能較前改善，1周后ALT、AST較治療前增高，ALB較治療前降低（P < 0.05），TBIL均值較治療前略高，PTA較治療前略低但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；4周后ALT、AST、ALB、PTA、TBIL均恢復(fù)至治療前水平；12周后ALT、AST較治療前降低（P < 0.05），PTA較治療前升高但仍低于正常值（P < 0.05），ALB較治療前明顯改善（P < 0.01），TBIL治療后較治療前略低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；20周后各項(xiàng)指標(biāo)較治療前明顯改善（P < 0.05或P < 0.01）（表1 ~ 4）。

表1 臍帶血干細(xì)胞治療前與治療后1周肝功能對(duì)比情況（± s）

表1 臍帶血干細(xì)胞治療前與治療后1周肝功能對(duì)比情況（± s）

組別ALT（U/L）AST（U/L）ALB（g/L）TBIL（μmol/L）PA（﹪）治療前51.63±5.7348.62± 5.6429.18±3.5046.72±10.4454.60±14.39治療后 1周53.70±6.8852.37±12.87 27.80±4.8447.15±10.3353.90±13.08 t 值2.2892.6032.3521.9851.924 P值0.0260.0120.0220.0520.059

表2 臍帶血干細(xì)胞治療前與治療后4周肝功能對(duì)比情況（± s）

表2 臍帶血干細(xì)胞治療前與治療后4周肝功能對(duì)比情況（± s）

組別ALT（U/L）AST（U/L）ALB（g/L）TBIL（μmol/L）PA（﹪）治療前51.63±5.7348.62±5.6429.18±3.5046.72±10.4454.60±14.39治療后 4周50.45±4.1747.73±7.5429.51±3.4646.00±12.0454.93±13.37 t 值1.6621.3441.7891.6650.180 P值0.1020.1840.0790.1010.858

表3 臍帶血干細(xì)胞治療前與治療后12周肝功能對(duì)比情況（± s）

表3 臍帶血干細(xì)胞治療前與治療后12周肝功能對(duì)比情況（± s）

組別ALT（U/L）AST（U/L）ALB（g/L）TBIL（μmol/L）PA（﹪）治療前51.63± 5.7348.62± 5.6429.18±3.5046.72±10.4454.60±14.39治療后12周47.63±10.7044.67±13.6636.47±1.4744.98±11.6758.17± 9.98 t 值2.5652.25920.041.9622.572 P值0.0130.0280.0000.0550.013

表4 臍帶血干細(xì)胞治療前與治療后20周肝功能對(duì)比情況（± s）

表4 臍帶血干細(xì)胞治療前與治療后20周肝功能對(duì)比情況（± s）

組別ALT（U/L）AST（U/L）ALB（g/L）TBIL（μmol/L）PA（﹪）治療前51.63±5.7348.62± 5.6429.18±3.5046.72±10.4454.60±14.39治療后20周39.62±8.1535.05±11.9839.91±3.5441.82±10.4363.32± 9.05 t 值10.1308.65226.6864.1946.385 P值0.0000.0000.0000.0000.000

表5 臍帶血干細(xì)胞治療前后血清肝纖維化指標(biāo)對(duì)比（± s）

表5 臍帶血干細(xì)胞治療前后血清肝纖維化指標(biāo)對(duì)比（± s）

組別HA/（ng/L）PCⅢ/（ng/L）IV-C/（ng/L）LN/（ng/L）治療前171.56±55.58170.58±48.21168.95±48.97169.69±54.43治療后20周148.44±30.43153.98±32.54147.22±39.00147.29±40.89 t 值 3.1152.6662.5893.412 P值0.0030.0100.0120.001

血清肝纖維化指標(biāo)對(duì)比第20周時(shí)血清透明質(zhì)酸HA、層黏連蛋白LN、Ⅲ型前膠原PC-Ⅲ及Ⅳ型膠原Ⅳ-C與治療前比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P < 0.05，表5）。

討 論

乙肝肝硬化是慢性乙型肝炎病毒感染的重要臨床結(jié)局，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）調(diào)查，2002年關(guān)于全球死于肝硬化的患者，其中約30﹪患有乙型肝炎病毒感染，中位生存期為10 ~ 12年。一旦進(jìn)展為失代償，患者往往出現(xiàn)由門脈高壓所致的食管胃底靜脈曲張破裂出血、腹腔積液、肝性腦病、脾功能亢進(jìn)、肝腎綜合征等嚴(yán)重并發(fā)癥，死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[1]，由于乙肝肝硬化難治性，已成為各國(guó)學(xué)者普遍關(guān)注的問(wèn)題，目前肝移植是治療終末期肝病的最佳方法，但供體缺乏、費(fèi)用高等因素限制了其推廣，因此，尋求肝移植以外的有效治療手段成為大家不斷追求的目標(biāo)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，臍帶血干細(xì)胞具有定向分化、增殖的潛能，在肝臟微環(huán)境下能分化為肝細(xì)胞，可對(duì)損傷肝臟組織進(jìn)行修復(fù)和重構(gòu)，改善肝功能[2-3]，臍帶血干細(xì)胞，作為一種全能細(xì)胞，具有多項(xiàng)分化潛能，與骨髓相比，免疫原性相對(duì)較弱，能夠更大程度耐受HLA配型不符，移植抗宿主病發(fā)生相對(duì)較低，故臍帶血干細(xì)胞作為一種新的替代細(xì)胞來(lái)源，具有極大優(yōu)勢(shì)和潛力[4]。

本實(shí)驗(yàn)患者臍帶血干細(xì)胞治療后1至4周食欲、乏力、腹脹等臨床癥狀開始逐步改善，腹水及雙下肢水腫逐步改善，術(shù)后12周明顯改善，術(shù)后1周ALT、AST較術(shù)前增高，ALB較術(shù)前降低，考慮與肝動(dòng)脈穿刺對(duì)肝臟暫時(shí)性刺激有關(guān)，上述指標(biāo)均在術(shù)后4周時(shí)恢復(fù)至術(shù)前水平，提示臍帶血干細(xì)胞注入肝固有動(dòng)脈后從定植到分化為肝細(xì)胞約需4周時(shí)間，與楊彥林[5]報(bào)道相一致；術(shù)后12周時(shí)較術(shù)前明顯好轉(zhuǎn)，但轉(zhuǎn)氨酶仍未恢復(fù)正常值，術(shù)后20周轉(zhuǎn)氨酶恢復(fù)正常，說(shuō)明使轉(zhuǎn)氨酶恢復(fù)正常可能需20周時(shí)間或更長(zhǎng)時(shí)間，轉(zhuǎn)氨酶升高代表肝細(xì)胞損傷，可能機(jī)制為20周后臍帶血干細(xì)胞在肝內(nèi)進(jìn)一步增殖、分化、修復(fù)損傷肝細(xì)胞，使其肝臟腺泡細(xì)胞數(shù)量增加達(dá)到改善肝功能效果；同時(shí)臍帶血干細(xì)胞亦可能與體內(nèi)的肝細(xì)胞“融合”，從而促使基因重排而行使了肝細(xì)胞的功能[6]。TBIL術(shù)后1 ~ 12周變化均不明顯，與以往報(bào)道[7-8]相似，20周后膽紅素水平得到改善，可能因?yàn)槟懠t素升高代表肝臟大量細(xì)胞功能減退，受損壞死，干細(xì)胞移植只能代替部分肝功能，完全修復(fù)壞死肝細(xì)胞可能需要更長(zhǎng)時(shí)間；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，各項(xiàng)肝功能均逐步改善，至20周時(shí)各項(xiàng)肝功能均達(dá)到正常范圍，這表明臍帶血干細(xì)胞從植入肝臟到轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞完全取代壞死肝細(xì)胞需要20周或更長(zhǎng)時(shí)間或反復(fù)干細(xì)胞移植，這需要進(jìn)一步大樣本、多中心、臨床研究。

本研究發(fā)現(xiàn)20周時(shí)血清學(xué)纖維化指標(biāo)均得到了明顯改善，這說(shuō)明隨著時(shí)間延長(zhǎng)臍帶血干細(xì)胞可以改善肝臟纖維化程度，可能由于臍血干細(xì)胞促進(jìn)纖維化肝臟血管新生，改善血液供應(yīng)，從而促進(jìn)肝竇重建和肝再生[9]，這一結(jié)果仍需進(jìn)一步大樣本臨床驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)全部患者均圓滿完成治療并順利出院，無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)及并發(fā)癥。雖然邵珺等[10]發(fā)現(xiàn)1例患者行臍帶血干細(xì)胞治療后并發(fā)了自發(fā)性腎周出血，但在本組患者中并未有相似發(fā)現(xiàn)。

從本研究結(jié)果來(lái)看，臍血干細(xì)胞移植可以改善肝功能，但其機(jī)制及對(duì)肝組織損傷修復(fù)的確切作用和途徑如何尚未明確，臍血干細(xì)胞經(jīng)提取后是進(jìn)行直接體內(nèi)移植還是體外培養(yǎng)經(jīng)純化后進(jìn)行移植、最佳劑量、移植的最佳時(shí)間、移植次數(shù)、途徑、移植的條件和適應(yīng)證尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，臍帶血干細(xì)胞治療后的近期療效和遠(yuǎn)期結(jié)局仍缺乏客觀的循證證據(jù)，是否會(huì)具有致瘤作用，均是將來(lái)各國(guó)學(xué)者需要進(jìn)一步研究和解決的問(wèn)題。

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Effect of umbilical cord blood stem cells for the treatment of decompensated cirrhosis in patients with chronic hepatitis B

Wang Lihua1, Chen Yumei1, Li Bingmao2, Sun Jianshun1, Ya Bin1,Zhang Lixian1.1Department of Gastroenterology,2Department of Traditional Chinese Medicine, Harrison International Peace Hospital, Hengshui 053000, China

Objective To evaluate the clinical efficacy of umbilical cord blood stem cell therapy on decompensated cirrhosis in patients with chronic hepatitis B. Methods 60 chronic hepatitis B patients with decompensated cirrhosis were enrolled. The umbilical cord blood stem cells[（2 ~ 6）×107] were injected into liver by hepatic artery. To evaluate the clinical efficacy, albumin, total bilirubin, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and prothrombin activity after 1,4,12,20 weeks were observed. Serum Fibrosis Indexes (laminin LN, Hyaluronic acid HA, Ⅲprocollagen PC-Ⅲ and Ⅳ collagen Ⅳ-C) after 20 weeks and clinical symptoms were evaluated. Results No patients reported severe postoperative complications and adverse reactions. The spirit, strength and appetite of most patients returned to normal at 12 week. Edema and ascites disappeared. After one week of treatment, ALT, AST increased and serum albumin levels decreased ( P < 0.05), while TBIL slightly increased and PTA slightly decreased ( P > 0. 05). ALT, AST, ALB, PTA and TBIL returned to the levels of pretreatment, after four weeks of treatment. After twelve weeks of

Umbilical cord blood stem cell； Cirrhosis； Hepatitis B，chronic

2016-08-05）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.05.005

河北省中醫(yī)藥管理局科研基金項(xiàng)目（2012234）

053000 衡水，哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院消化內(nèi)科1，中醫(yī)科2

陳玉梅，Email：cym031900@163.com

treatment, ALT, AST decreased( P < 0.05), Serum albumin levels improved greatly（P < 0.01）, and PTA increased too( P < 0. 05), while TBIL slightly decreased(P > 0.05). All serum biochemical index improved at twenty weeks after treatment,（P < 0.05）. Conclusion Umbilical cord blood stem cells are safe and effective for decompensated cirrhosis in patients with chronic hepatitis B.

王麗華，陳玉梅，李炳茂，等. 臍帶血干細(xì)胞對(duì)慢乙肝失代償期肝硬化的臨床療效[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志:電子版, 2016, 6(5):292-296.