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    腺病毒轉(zhuǎn)染新生及成年鼠內(nèi)耳細(xì)胞的研究

    2016-12-13 09:00:28舒易來(lái)陶永李文妍陳正一李華偉
    關(guān)鍵詞:毛細(xì)胞基因治療內(nèi)耳

    舒易來(lái)陶永李文妍陳正一李華偉

    ·論著·

    腺病毒轉(zhuǎn)染新生及成年鼠內(nèi)耳細(xì)胞的研究

    舒易來(lái)1,2陶永2李文妍1,2陳正一2李華偉1

    目的 探討腺病毒攜帶目的基因Cre和Oct4導(dǎo)入新生和成年小鼠轉(zhuǎn)染內(nèi)耳細(xì)胞的可行性,為內(nèi)耳基因治療提供可行性研究。方法 采用納升級(jí)顯微操作系統(tǒng),經(jīng)耳蝸中階顯微注射攜帶基因編輯基因Cre和綠色熒光蛋白(GFP)基因的5型重組腺病毒懸液于新生鼠(P1)和成年鼠,并以腺病毒攜帶Oct4基因轉(zhuǎn)染入成年鼠內(nèi)耳,注射4 d后取雙側(cè)耳蝸標(biāo)本做基底膜鋪片,觀察GFP和Oct4表達(dá)情況。結(jié)果 新生鼠組:術(shù)后第4 d見(jiàn)耳蝸底圈62﹪和中圈54﹪支持細(xì)胞表達(dá)GFP。成年鼠組:術(shù)后第4天可見(jiàn)耳蝸底圈96﹪和中圈51﹪內(nèi)毛細(xì)胞表達(dá)GFP,底圈72﹪和中圈40﹪支持細(xì)胞表達(dá)GFP。31﹪內(nèi)毛細(xì)胞和43﹪支持細(xì)胞表達(dá)Oct4。未注射耳未見(jiàn)GFP和Oct4表達(dá)。結(jié)論 顯微注射腺病毒攜帶目的基因Cre和Oct4可高效導(dǎo)入新生鼠及成年鼠內(nèi)耳并表達(dá),可用來(lái)研究?jī)?nèi)耳基因功能和基因治療。

    腺病毒科; 耳蝸; 內(nèi)耳; 基因療法

    據(jù)2006年我國(guó)第二次殘疾人抽樣調(diào)查顯示,我國(guó)聽(tīng)力殘疾人達(dá)2 780萬(wàn),并且還在不斷增加[1]。耳聾可大致分為3種類型:傳導(dǎo)性耳聾、感音神經(jīng)性耳聾和混合性耳聾。感音神經(jīng)性耳聾是由于耳蝸Corti氏器毛細(xì)胞、聽(tīng)神經(jīng)、聽(tīng)傳導(dǎo)徑路或各級(jí)神經(jīng)元受損害,致聲音的感受與神經(jīng)沖動(dòng)傳遞障礙。因噪音、耳毒性藥物、遺傳、感染和自身免疫性疾病等引起的毛細(xì)胞丟失或毛細(xì)胞、支持細(xì)胞等功能缺失引起的感音神經(jīng)性耳聾占很大一部分,哺乳動(dòng)物的耳蝸毛細(xì)胞在死亡后不能再生。目前上百種基因突變所致的遺傳性耳聾的治療是助聽(tīng)器和人工耳蝸植入,但并不理想。

    隨著越來(lái)越多的內(nèi)耳感覺(jué)細(xì)胞決定基因和因子被發(fā)現(xiàn)和突變基因的發(fā)現(xiàn),關(guān)于毛細(xì)胞再生和遺傳性耳聾基因治療的研究取得了一定進(jìn)展。一系列研究發(fā)現(xiàn)為耳聾的治療帶來(lái)了希望,但仍然充滿了挑戰(zhàn)。所以需要發(fā)現(xiàn)和研究新的基因來(lái)解決毛細(xì)胞再生[2-9]。上百種基因突變引起遺傳性耳聾,目前以基因治療的手段在原位恢復(fù)聽(tīng)覺(jué)是有前景的途徑,但用于臨床仍然需要解決很多問(wèn)題[10-17]。依靠構(gòu)建轉(zhuǎn)基因模型來(lái)研究相關(guān)內(nèi)耳基因費(fèi)時(shí)費(fèi)力,所以迫切需要新的方法來(lái)高效的研究大量的內(nèi)耳基因功能。

    目前在內(nèi)耳基因治療中的載體分為病毒性載體和非病毒性載體兩類。病毒性載體有腺病毒(adenovirus,Ad)、腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)、單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒等。其中最常用的是腺病毒和腺相關(guān)病毒。筆者團(tuán)隊(duì)以及其他學(xué)者前期研究了AAV在新生鼠和成年鼠內(nèi)耳中的表達(dá)[18-19]。腺病毒可以感染非分裂和分裂細(xì)胞;高效、迅速地傳遞和表達(dá)基因;易于增殖和純化、滴度高;為研究各基因功能常用的載體。國(guó)內(nèi)外學(xué)者以小鼠、豚鼠圓窗膜、中階等的路徑注射腺病毒,報(bào)道其感染耳蝸內(nèi)細(xì)胞不一[19-24]。

    Cre-LoxP小鼠是常用的基因研究系統(tǒng),一條常用的途徑是通過(guò)腺病毒攜帶Cre重組酶(Cre)局部注射來(lái)實(shí)現(xiàn)。多潛能性干細(xì)胞可以通過(guò)加入包括Oct4在內(nèi)的4種因子從鼠成纖維細(xì)胞中得到,Oct4被證實(shí)在維持胚胎干細(xì)胞方面可能更據(jù)主導(dǎo)地位[25]。由于腺病毒轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染細(xì)胞受多方面因素影響,在研究毛細(xì)胞再生以及遺傳性耳聾基因治療時(shí),需要對(duì)載體腺病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)耳細(xì)胞做一系統(tǒng)的研究。本研究采用納升水平的導(dǎo)入系統(tǒng),將攜帶Cre和綠色熒光蛋白(green fl uorescent protein, GFP)標(biāo)記(Ad-Cre-GFP)或攜帶Oct4(Ad-Oct4)的5型腺病毒局部注射入新生和成年小鼠內(nèi)耳,研究其對(duì)內(nèi)耳細(xì)胞的轉(zhuǎn)染特點(diǎn)。

    材料與方法

    一、材料

    1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:本實(shí)驗(yàn)采用CBA/CAJ出生后1 d新生鼠(P1)及6 ~ 8周成年的小鼠,按兩個(gè)年齡段隨機(jī)分組,即在兩年齡段各注射Ad-Cre-GFP 4只。另外一組成年鼠注射Ad-Oct4,各組動(dòng)物均以右耳作為手術(shù)耳,非手術(shù)耳作為空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)小鼠來(lái)源于美國(guó)Charles River動(dòng)物中心,符合美國(guó)醫(yī)用動(dòng)物使用標(biāo)準(zhǔn)。

    2.主要試劑和器材:4﹪多聚甲醛、EDTA、Triton X-100均來(lái)自美國(guó)Sigma公司;麻醉藥xylazine、ketamine 分別來(lái)自美國(guó)VEDCO、Ketaset公司;Ad-Cre-GFP懸液購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Baylor College of Medicine;Ad-Oct4懸液來(lái)自哈佛醫(yī)學(xué)院;免疫組化抗體:Rabbit anti-Oct4(Invitrogen,USA)、Myosin7a Rabbit Polyclonal antibody (Proteus Biosciences,USA)、Sox2(Y-17)goat polyclona IgG(Santa Cruz Biotechnology,USA)、DAPI(Sigma,USA);二抗均來(lái)自美國(guó)Molecular Probes;動(dòng)物顯微手術(shù)器械和解剖器械來(lái)自于美國(guó)Fine Science Tools;玻璃微電極、納升級(jí)顯微注射系統(tǒng)來(lái)自美國(guó)WPI;手術(shù)顯微鏡來(lái)自德國(guó)Zeiss。

    二、方法

    1.新生鼠內(nèi)耳顯微注射:所有手術(shù)器械經(jīng)高溫高壓消毒后烘干。新生鼠采用冰麻,麻醉后,術(shù)區(qū)以碘伏消毒,取左側(cè)臥位,在手術(shù)顯微鏡下,以顯微剪于耳后剪開(kāi)皮膚,分離下頜下腺、胸鎖乳突肌和下頜下腺,暴露耳蝸,以已連接玻璃微電極的納升級(jí)顯微操作系統(tǒng)吸取約400 nl Ad-Cre-GFP懸液,以連接的玻璃微電極尖端輕輕刺破耳蝸(玻璃微電極尖端的大小約為15 ~ 20 μm),共注射約200 nl。消毒后把小鼠置于37℃保溫袋復(fù)溫,待其蘇醒。

    2.成年鼠內(nèi)耳顯微注射:所有手術(shù)器械經(jīng)高溫高壓消毒后烘干。給予xylazine(20 mg/kg)和ketamine(100 mg/kg)腹腔注射麻醉,麻醉后備皮,取俯臥位頸部墊高,頭偏右側(cè)。術(shù)中以37℃保溫袋保溫。術(shù)區(qū)以碘伏消毒,在手術(shù)顯微鏡下,以眼科剪于耳后剪開(kāi)皮膚,分離暴露胸鎖乳突肌和下頜下腺后,挑開(kāi)聽(tīng)泡,擴(kuò)大后暴露鐙骨動(dòng)脈。在底圈以細(xì)針輕輕磨除蝸壁。以納升級(jí)顯微操作系統(tǒng),以玻璃微電極刺破耳蝸側(cè)壁韌帶,注射Ad-Cre-GFP或Ad-

    Oct4約322 nl懸液。注射完畢后停留約5 min后拔出玻璃微電極尖,縫合切口。

    3.內(nèi)耳標(biāo)本鋪片的制作:術(shù)后第4天處死動(dòng)物,迅速取出聽(tīng)泡,于解剖顯微鏡下暴露耳蝸,刺破圓窗膜,并將鐙骨輕推入前庭池以打開(kāi)前庭窗,然后將耳蝸置于4﹪多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中4℃避光固定過(guò)夜,成年鼠標(biāo)本則于10﹪EDTA脫鈣2 ~ 3 d,之后在解剖顯微鏡下分離出橢圓囊和基底膜。

    4.免疫組化:對(duì)基底膜和橢圓囊分離后鋪片染色,毛細(xì)胞以Myo7a染色標(biāo)記,支持細(xì)胞以Sox2染色標(biāo)記,細(xì)胞核以DAPI染色,詳細(xì)染色方法參照文獻(xiàn)[5]。

    5.細(xì)胞計(jì)數(shù):整個(gè)耳蝸基底膜分底圈、中圈、頂圈,把底圈最底處定義為0﹪,頂圈最頂處定義為100﹪,那么25﹪周圍區(qū)域代表底圈,50﹪周圍區(qū)域代表中圈,75﹪周圍區(qū)域代表頂圈。計(jì)數(shù)200 μm的長(zhǎng)度的基底膜。在激光共聚焦圖像中計(jì)算每一段中表達(dá)GFP或Oct4的毛細(xì)胞、支持細(xì)胞數(shù)比例。

    結(jié) 果

    一、耳蝸解剖基本情況

    術(shù)后耳蝸大體改變:術(shù)后4 d取材時(shí)見(jiàn)中耳腔清潔、干凈,成年組未見(jiàn)中耳及內(nèi)耳炎癥、出血等反應(yīng)。固定后在熒光顯微鏡下觀察,Ad-Cre-GFP組的術(shù)耳的基底膜有GFP明顯表達(dá),而未注射耳未見(jiàn)GFP表達(dá)。

    二、新生鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞、支持細(xì)胞GFP的表達(dá)在腺病毒顯微注射后的P1小鼠組,橢圓囊、耳蝸的毛細(xì)胞、支持細(xì)胞均成活。在Ad-Cre-GFP注射組,橢圓囊的支持細(xì)胞和毛細(xì)胞未見(jiàn)明顯GFP表達(dá),而耳蝸的支持細(xì)胞見(jiàn)GFP表達(dá)。耳蝸底圈62﹪和中圈54﹪支持細(xì)胞表達(dá)GFP(圖1a,b,c)。在未注射耳,耳蝸及橢圓囊均未見(jiàn)GFP表達(dá)(圖1d)。

    圖1 新生鼠注射Ad-cre-GFP在耳蝸表達(dá)結(jié)果 (免疫組化染色× 630)

    三、成年鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞、支持細(xì)胞GFP和Oct4的表達(dá)

    在成年鼠組,在Ad-Cre-GFP注射后,可見(jiàn)相對(duì)注射部位的底圈和中圈的外毛細(xì)胞缺失或部分缺失,所有的內(nèi)毛細(xì)胞、支持細(xì)胞以及橢圓囊的毛細(xì)胞均未見(jiàn)缺失。耳蝸底圈96﹪和中圈51﹪內(nèi)毛細(xì)胞表達(dá)GFP,底圈72﹪和中圈40﹪支持細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(圖2a,b)。在Ad-Oct4小組,31﹪內(nèi)毛細(xì)胞和43﹪支持細(xì)胞表達(dá)Oct4(圖3)。未注射耳未見(jiàn)GFP或Oct4表達(dá)(圖2c,圖3b)。

    討 論

    腺病毒靶細(xì)胞種類多,導(dǎo)入效率高,攜帶的

    目的基因表達(dá)迅速,能感染分裂或不分裂的細(xì)胞,在基因治療研究領(lǐng)域備受重視,應(yīng)用比較廣泛。本研究經(jīng)中階途徑注射腺病毒,在P1的小鼠中,GFP主要表達(dá)在支持細(xì)胞,在成年小鼠中,GFP的表達(dá)也主要是支持細(xì)胞,但在內(nèi)毛細(xì)胞也有高效表達(dá),未發(fā)現(xiàn)有前庭毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。這說(shuō)明不同年齡段腺病毒對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)染略有不同,這可能和毛細(xì)胞的成熟程度、形態(tài)等有關(guān)。

    圖2 成年鼠內(nèi)耳注射Ad-Cre-GFP在耳蝸表達(dá)結(jié)果 (免疫組化染色×630)

    圖3 成年鼠內(nèi)耳注射Ad-Oct4在耳蝸表達(dá)結(jié)果 (免疫組化染色×400)

    學(xué)者們對(duì)其在內(nèi)耳研究中的應(yīng)用進(jìn)行了一些研究。Staecker等[26]報(bào)道通過(guò)圓窗膜路徑的方法以腺病毒為載體轉(zhuǎn)染入外淋巴液后,目的基因表達(dá)在螺旋神經(jīng)節(jié)以及耳蝸和前庭的感覺(jué)細(xì)胞。國(guó)內(nèi)不少學(xué)者也進(jìn)行了相關(guān)研究。韓朝等[24]以豚鼠耳蝸側(cè)壁鉆孔中階入路轉(zhuǎn)染攜帶GFP的腺病毒,發(fā)現(xiàn)可以感染聽(tīng)器的支持細(xì)胞和血管紋緣細(xì)胞等。徐延軍等[23]經(jīng)小鼠耳后入路圓窗膜顯微注射途徑轉(zhuǎn)染攜

    帶GFP的腺病毒,發(fā)現(xiàn)耳蝸底回基底膜及螺旋神經(jīng)節(jié)上目的基因有表達(dá)。于子龍等[22]發(fā)現(xiàn)腺病毒介導(dǎo)的LacZ基因在內(nèi)耳組織中的表達(dá)至少可持續(xù)3周,其中在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表達(dá)穩(wěn)定,Corti器、前庭囊斑、壺腹嵴的毛細(xì)胞等也有較強(qiáng)的表達(dá)。

    本研究以納升水平的顯微操作導(dǎo)入系統(tǒng),精確的控制導(dǎo)入量和導(dǎo)入速度,使得手術(shù)對(duì)內(nèi)耳的損傷盡量減少到最小,驗(yàn)證了腺病毒攜帶Cre或Oct4能高效的轉(zhuǎn)染耳蝸支持細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞,表達(dá)迅速,并且在手術(shù)后的新生鼠的模型上未見(jiàn)有外毛細(xì)胞缺失,在各年齡段其可用于后期的關(guān)于耳蝸毛細(xì)胞再生研究的基因治療中,對(duì)于新生鼠,可用于遺傳性耳聾的基因治療的模型。大量的學(xué)者報(bào)道,以中階或是圓窗膜路徑轉(zhuǎn)染目的基因,高頻區(qū)會(huì)有聽(tīng)力損失,相對(duì)應(yīng)注射部位有不同程度的外毛細(xì)胞的缺失[3-5,10],這與實(shí)驗(yàn)中的成年鼠注射后結(jié)果相一致。新生鼠所有的毛細(xì)胞均沒(méi)有缺失,這可能和以下幾方面有關(guān):(1)毛細(xì)胞尚未發(fā)育成熟,對(duì)外界的創(chuàng)傷不敏感;(2)新生鼠手術(shù)不需要打洞,無(wú)明顯淋巴液漏;(3)使用了納升水平的顯微操作導(dǎo)入系統(tǒng),精確的控制導(dǎo)入量和導(dǎo)入速度。

    顯微注射腺病毒攜帶目的基因Cre和Oct4均可高效導(dǎo)入新生鼠及成年鼠內(nèi)耳并表達(dá),可高效的用來(lái)研究?jī)?nèi)耳基因功能和耳聾基因治療。

    1 第二次全國(guó)殘疾人抽樣調(diào)查辦公室. 第二次全國(guó)殘疾人抽樣調(diào)查主要數(shù)據(jù)手冊(cè)[M] . 北京: 華夏出版社, 2007 .

    2 Zheng JL, Gao WQ. Overexpression of math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears[J]. Nat Neurosci, 2000, 3(6):580-586.

    3 Yamamoto N, Tanigaki K, Tsuji M, et al. Inhibition of Notch/RBP-J signaling induces hair cell formation in neonate mouse cochleas[J]. J Mol Med (Berl), 2006,84(1):37-45.

    4 Doetzlhofer A, Basch ML, Ohyama T, et al. Hey2 regulation by FGF provides a Notch-independent mechanism for maintaining pillar cell fate in the organ of Corti[J]. Dev Cell,2009,16(1):58-69.

    5 Sage C, Huang M, Karimi K, et al. Proliferation of functional hair cells in vivo in the absence of the retinoblastoma protein[J]. Science, 2005, 307(5712):1114-1118.

    6 Weber T, Corbett MK, Chow LML, et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells[J]. Proc Natl AcadSci U S A, 2008, 105(2):781-785.

    7 Liu Z, DearmanJA, CoxBC, et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression[J]. J Neurosci, 2012, 32(19):6600-6610.

    8 Yang SM, Chen W, Guo WW, et al. Regeneration of stereocilia of hair cells by forced Atoh1 expression in the adult mammalian cochlea[J]. PloS One, 2012, 7(9):e46355.

    9 Kelly MC, Chang Q, Pan A, et al. Atoh1 directs the formation of sensory mosaics and induces cell proliferation in the postnatal mammalian cochlea in vivo[J]. J Neurosci, 2012, 32(19):6699-6710.

    10 Akil O, Seal RP, Burke K, et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy[J]. Neuron, 2012, 75(2):283-293.

    11 Askew C, Rochat C, Pan B, et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice[J]. SciTransl Med, 2015, 7(295): 295ra108.

    12 Chien WW, Isgrig K, Roy S, et al. Gene Therapy restores hair cell stereocilia morphology in inner ears of deaf whirler mice[J]. MolTher, 2016,24(1):17-25..

    13 Yu Q, Wang Y, Chang Q, et al. Virally expressed connexin26 restores gap junction function in the cochlea of conditional Gjb2 knockout mice[J]. Gene Ther, 2014, 21(1):71-80.

    14 Lentz JJ, Jodelka FM, Hinrich AJ, et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness[J]. Nat Med, 2013, 19(3):345-350.

    15 Maeda Y, Fukushima K, Nishizaki K, et al. In vitro and in vivo suppression of GJB2 expression by RNA interference[J]. Hum Mol Genet, 2005, 14(12):1641-1650.

    16 Zuris JA, Thompson DB, Shu YL, et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables effi cient protein-based genome editing in vitro and in vivo[J]. Nat Biotechnol, 2015, 33(1):73-80.

    17 Li M, Tao Y, Shu Y, et al. Discovery and characterization of a peptide that enhances endosomal escape of delivered proteins in vitro and in viv[J]. J Am Chem Soc, 2015, 137(44):4084-4093.

    18 Shu Y, Tao Y, Wang Z, et al. Identifi cation of adeno-associated viral vectors(AAV)that target neonatal and adult mammalian inner ear cell subtypes[J]. Hum Gene Ther, 2016, 27(9):687-699.

    19 Kilpatrick LA, Li Q, Yang J, et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear[J]. Gene Ther, 2011, 18(6):569-578.

    20 Raphael Y, Frisancho JC, Roessler BJ. Adenoviral-mediated gene transfer into Guinea pig cochlear cells in vivo[J]. Neurosci Lett, 1996, 207(2):137-141.

    21 Luebke AE, Steiger JD, Hodges BL, et al. A modifi ed adenovirus can transfect cochlear hair cells in vivo without compromising cochlear function[J]. Gene Ther, 2001, 8(10):789-794.

    22 于子龍, 韓德民, 林晨, 等. 內(nèi)耳轉(zhuǎn)基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華耳鼻咽喉科雜志, 2003, 38(5):340-342.

    23 徐延軍, 胡吟燕, 翟所強(qiáng), 等.耳后入路圓窗膜顯微注射小鼠耳蝸基因轉(zhuǎn)染新途徑的研究[J].聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志, 2009, 17(3):279-282.

    24 韓朝, 遲放魯, 黃一波, 等.兩種內(nèi)淋巴給藥方式對(duì)豚鼠耳蝸功能和形態(tài)的影響[J]. 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2009, 44(4):329-334.

    25 Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J]. Cell, 2006, 126(4):663-676.

    26 Staecker H, Li D, O'Malley BW Jr, et al. Gene expression in the mammalian cochlea:a study of multiple vector systems[J]. ActaOtolaryngol, 2001, 121(2):157-163.

    Study on adenovirus-infected inner ear cells in newborn and adult mouse

    Shu Yilai1,2, Tao Yong2,Li Wenyan1,2, Chen Zheng-Yi2, Li Huawei1.1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital, Shanghai Medical College, Fudan University, Key Laboratory of Hearing Medicine, National Health and Family Planning Commission, Shanghai 200031, China;2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School and Eaton-Peabody Laboratories, Massachusetts Eye & Ear Infirmary, Boston, MA, 02114, USA

    Objective To investigate the feasibility of target gene transfer into the inner ear cells of neonatal and adult mice by adenovirus vectors, so as to provide basis for gene therapy of inner ear. Methods Adenovirus vector 5 carrying GFP linked to a genome editing gene Cre recombinase (Ad-Cre-GFP) was injected into inner ear cells of neonatal (p1) and adult mice through nano-liter grade micro-operating system by cochleostomy.The Adenovirus vectors carrying Oct4 gene(Ad-Oct4) was administered into inner cells of another adult mice group. After 4 days of injection, bilateral cochlea was harvested for whole-mount membrane was sectioned into slices. Immunofluorescence was used to observe the expression of target protein. Results In neonatal(P1) cochleae injected with Ad-Cre-GFP, GFP expression was detected in 62﹪ of supporting cells in the base circle and 54﹪ of supporting cells in middle circle after 4 days of injection. In adult mice, GFP was expressed in 72﹪and 40﹪ supporting cells at base and middle circle of cochlear respectively. 96﹪ and 51﹪ inner hair cells was found expressing GFP at base and middle circles respectively. In addition, Oct4 was detected in 31﹪ inner hair cells and 43﹪supporting cells after Ad-Oct4 injection. No GFP and Oct4 expression was observed in the control ears. Conclusion Our study indicate that micro-injection of adenovirus into both neonatal and adult mouse inner ears can achieve efficient exogenous gene transfer, which has great potential in inner cell gene therapy and inner ear gene function study.

    Adenoviridae; Cochlea; Inner ear; Gene therapy;

    2016-08-09)

    (本文編輯:李少 婷)

    10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.05.007

    國(guó)家自然科學(xué)基金(NSFC81300824);上海市浦江人才資助項(xiàng)目(15PJ1401000)

    200031 上海,復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科 國(guó)家衛(wèi)計(jì)委聽(tīng)覺(jué)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1;02114 波士頓,哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院麻省眼耳醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科2

    李華偉,Email:hwli@shmu.edu.cn

    舒易來(lái),陶永,李文妍,等.腺病毒轉(zhuǎn)染新生及成年鼠內(nèi)耳細(xì)胞的研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志:電子版, 2016, 6(5):302-306.

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