繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥對(duì)COPD男性患者呼吸功能和骨髓有核紅細(xì)胞凋亡及Bcl-2表達(dá)的影響※

齊亞麗，解友邦，顧玉海

(青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810007)

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繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥對(duì)COPD男性患者呼吸功能和骨髓有核紅細(xì)胞凋亡及Bcl-2表達(dá)的影響※

齊亞麗，解友邦，顧玉海*

(青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810007)

目的 探討繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥(SP)對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)男性患者呼吸功能和骨髓有核紅細(xì)胞凋亡及Bcl-2 mRNA的影響。方法 分別選取30名單純骨折男性患者和32名COPD男性患者、21名COPD+SP男性患者作為對(duì)照組和COPD組、COPD+SP組。用肺功能儀等儀器評(píng)價(jià)患者呼吸功能。用流式細(xì)胞儀測(cè)定骨髓有核紅細(xì)胞凋亡率、RT-PCR 法檢測(cè)Bcl-2 mRNA 的表達(dá)水平。結(jié)果 COPD+SP組肺功能(FEV1/FVC%)低于COPD組，而mMRC呼吸困難評(píng)價(jià)分級(jí)評(píng)分大于COPD組(P<0.05)；COPD+SP組骨髓有核紅細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組和COPD組(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組和COPD組(P<0.05)。結(jié)論 SP影響COPD男性患者的肺功能，加重呼吸困難的程度。Bcl-2家族分子可能參與了COPD+SP男性患者骨髓有核紅細(xì)胞凋亡異常的機(jī)制。

慢性阻塞性肺疾病 繼續(xù)性發(fā)紅細(xì)胞增多癥 骨髓有核紅細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 Bcl-2

目前關(guān)于慢性阻塞性肺疾病合并繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥的臨床研究文獻(xiàn)有一些報(bào)道[1-2]，但關(guān)于繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥(SP)影響慢性阻塞性肺疾病(COPD)骨髓紅系細(xì)胞凋亡和抗凋亡的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討了SP對(duì)COPD患者呼吸功能和骨髓有核紅細(xì)胞凋亡及Bcl-2 mRNA的影響，為臨床合理治療慢性阻塞性肺疾病合并繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選擇

患者共分為對(duì)照組和COPD組、COPD+SP組。對(duì)照組為30例男性單純骨折患者，年齡36.9±16.9歲，通過(guò)入院常規(guī)檢查排除其他疾病。COPD組為32例男性患者，年齡43.3±15.4歲，結(jié)合病史嚴(yán)格按照COPD指南進(jìn)行癥狀、體征、肺功能及其他相關(guān)輔助檢查。COPD+SP組為21例男性患者，年齡39.5±14.9歲，結(jié)合病史嚴(yán)格按照COPD指南和SP診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行癥狀、體征、肺功能及其他相關(guān)輔助檢查，并采用AS-PCR法檢測(cè)骨髓細(xì)胞JAK-2V617F突變情況，要求均為陰性，以排除真性紅細(xì)胞增多癥。研究經(jīng)青海省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，并取得研究對(duì)象知情同意。

1.2 呼吸功能評(píng)價(jià)

采用FEV1/FVC%、CAT(COPD assessment test，CAT)評(píng)分、mMRC(breathlessness measurement using the modified British Medical Reseach Council，mMRC)呼吸困難分級(jí)評(píng)分等評(píng)價(jià)患者呼吸功能。

1.3 血紅蛋白、紅細(xì)胞和紅細(xì)胞壓積測(cè)定

采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定患者血紅蛋白、紅細(xì)胞和紅細(xì)胞壓積。

1.4 有核紅細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用密度梯度法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞、免疫磁珠法分離單個(gè)核細(xì)胞中的有核紅細(xì)胞(CD71)；流式細(xì)胞儀法檢測(cè)骨髓有核紅細(xì)胞細(xì)胞凋亡。嚴(yán)格按凋亡試劑盒(美國(guó)BD公司) 說(shuō)明書(shū)操作。用流式細(xì)胞儀自帶軟件分析結(jié)果。

1.5 Bcl-2 mRNA表達(dá)測(cè)定

用Trizol試劑提取總RNA并定量，取適量RNA用AMV反轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA。用熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 60 s退火，共40個(gè)循環(huán)。每次擴(kuò)增設(shè)置β-actin基因內(nèi)參照。用PCR儀自帶軟件進(jìn)行熒光定量分析，得出Ct值。引物和TagMan熒光探針由Primer Express軟件設(shè)計(jì)，上海生工生物工程有限公司合成。

Bcl-2引物序列：

5′-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3′(上游引物)

5′-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3′(下游引物)

GAPDH引物序列：

5′-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3′(上游引物)

5′-CAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′(下游引物)

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 血紅蛋白、紅細(xì)胞和紅細(xì)胞壓積

對(duì)照組和COPD組、COPD+SP組的血紅蛋白和紅細(xì)胞、紅細(xì)胞壓積測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。表1顯示，與對(duì)照組比較，COPD+SP組的血紅蛋白和紅細(xì)胞、紅細(xì)胞壓積分別顯著升高69.93%和49.44%、23.20%。與COPD組比較，COPD+SP組的血紅蛋白、紅細(xì)胞和紅細(xì)胞壓積分別顯著升高61.07%、37.27%和11.47%。

2.2 呼吸功能評(píng)價(jià)結(jié)果

COPD組和COPD+SP組的肺功能比值(FEV1/FVC%)、CAT評(píng)分、mMRC呼吸困難評(píng)價(jià)分級(jí)評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表2。表2顯示，COPD+SP組肺功能比值(FEV1/FVC%)低于COPD組，而mMRC呼吸困難評(píng)價(jià)分級(jí)評(píng)分大于COPD組。

Table 1 Comparison of the levels of Hb，RBC and HCT in Control，COPD and COPD+SP ±s)

a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與COPD組比較，P<0.05.

組別例數(shù)FEV1/FVC(%)CAT評(píng)分mMRC呼吸困難分級(jí)(分)COPD組3275．36±5．643．86±1．284．52±1．26COPD+SP組2164．86±7．253．92±0．945．32±0．87

2.3 骨髓有核紅細(xì)胞凋亡率和Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平

對(duì)照組和COPD組、COPD+SP組的骨髓有核紅細(xì)胞凋亡情況見(jiàn)表3和圖1，Bcl-2 mRNA表達(dá)見(jiàn)表3。表3、圖1顯示，COPD+SP組骨髓有核紅細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組和COPD組(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組和COPD組。

組別例數(shù)骨髓有核紅細(xì)胞凋亡率(%)Bcl-2mRNA對(duì)照組304．62±1．205．92±1．16COPD組324．53±1．216．21±2．70COPD+SP組211．32±0．66※#10．15±2．92※#

a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與COPD組比較，P<0.05.

2.4 骨髓有核紅細(xì)胞凋亡率和Bcl-2 mRNA表達(dá)量及與Hb濃度的相關(guān)性

和Bcl-2 mRNA表達(dá)量及Hb濃度的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2顯示，Bcl-2 mRNA表達(dá)量和骨髓有核紅細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)，而凋亡率和血紅蛋白濃度呈負(fù)相關(guān)。

圖1 骨髓有核紅細(xì)胞凋亡指數(shù)流式圖(1：對(duì)照組；2：COPD組；3：COPD+SP組)

Figure 1 Apoptosis chart of bone marrow nucleated cells detected by flow cytometry(1：Control group；2：COPD group；3：COPD+SP group)

3 討論

本研究顯示，SP影響COPD男性患者的肺功能，加重呼吸困難的程度。Bcl-2家族分子可能參與了COPD+SP男性患者骨髓有核紅細(xì)胞凋亡異常的機(jī)制。

SP主要有真性、繼發(fā)性、相對(duì)性和應(yīng)激性紅細(xì)胞增多癥。SP又分新生兒紅細(xì)胞增多癥、高原性紅細(xì)胞增多癥以及慢性肺疾病、心血管疾病等繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥。慢性阻塞性肺疾病繼發(fā)紅細(xì)胞增多可導(dǎo)致脾大、高血壓、血栓等，這些并發(fā)癥對(duì)患者造成了嚴(yán)重威脅[3]。目前關(guān)于繼發(fā)性紅細(xì)胞增多對(duì)肺功能及呼吸困難程度的影響未見(jiàn)報(bào)道，但有學(xué)者在臨床治療中發(fā)現(xiàn)燈盞花素治療AECOPD可明顯改善患者的肺功能，降低血液粘稠度，糾正高凝狀態(tài)，改善微循環(huán)，增加血氧飽和度和改善肺功能[4]，COPD是引起腦梗死的高危因素，這可能與慢性阻塞性肺病患者長(zhǎng)期慢性缺氧，二氧化碳潴留，D-二聚體，血紅蛋白及纖維蛋白原升高有關(guān)[5]。

本研究發(fā)現(xiàn)COPD合并繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥后，肺功能降低明顯，可能與紅細(xì)胞的過(guò)度累計(jì)導(dǎo)致血液粘度增大，進(jìn)而影響氣血交換有關(guān)。高原紅細(xì)胞增多癥患者血粘度和紅細(xì)胞壓積相比高原健康人群顯著升高，由于環(huán)境缺氧，血液中紅細(xì)胞數(shù)代償性增加，使紅細(xì)胞壓積升高，血紅蛋白增加，引起血粘度升高，使紅細(xì)胞的變形性下降，引起全血粘度升高[6]，但目前關(guān)于血液粘度對(duì)肺功能的影響國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道，但很多文獻(xiàn)報(bào)道COPD患者通過(guò)活血化瘀或抗凝治療改善患者肺功能的同時(shí)減輕呼吸困難的程度。

慢性高原病紅細(xì)胞增多的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，在骨髓有核紅細(xì)胞增多的基礎(chǔ)上伴有紅細(xì)胞凋亡的降低[7，8]，但是關(guān)于COPD合并繼發(fā)性紅細(xì)胞增多的骨髓有核紅細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究較少。有報(bào)道稱，繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥患者血清P53蛋白和Bcl-2蛋白水平增加，并且均與Hb濃度呈顯著正相關(guān)，提示P53蛋白和Bcl-2蛋白可能與繼發(fā)紅細(xì)胞增多的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[10]。

我們的研究結(jié)果證實(shí)，繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥患者骨髓有核紅細(xì)胞凋亡指數(shù)下降，抗凋亡相關(guān)基因表達(dá)增加，提示慢性阻塞性肺疾病繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥可能是促紅細(xì)胞生成素增加導(dǎo)致紅細(xì)胞異常增生和抗凋亡減少，并導(dǎo)致過(guò)度積累的雙重作用結(jié)果。

骨髓紅系細(xì)胞通過(guò)與造血微環(huán)境的相互作用維持機(jī)體內(nèi)紅細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。其過(guò)程復(fù)雜，涉及紅系細(xì)胞外的調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞內(nèi)的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)調(diào)控等多個(gè)環(huán)節(jié)[11]。缺氧是引起紅細(xì)胞增多的主要原因，主要有EPO介導(dǎo)的紅細(xì)胞增殖學(xué)說(shuō)，低氧誘導(dǎo)因子1通過(guò)與促紅細(xì)胞生成素(EPO)的啟動(dòng)子結(jié)合，提高EPO-mRNA活性，致EPO的分泌增加。但在HAPC患者中EPO水平不總是和紅細(xì)胞增生的數(shù)量相一致。其他可能性因素包括遺傳適應(yīng)性、對(duì)EPO的反應(yīng)性、造血生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子及造血系統(tǒng)微環(huán)境的調(diào)控等[12]。但紅細(xì)胞的數(shù)量的衡定是在骨髓紅細(xì)胞生成和外周凋亡之間保持平衡的結(jié)果，在骨髓紅系統(tǒng)分化調(diào)控的同時(shí)伴隨細(xì)胞凋亡的參與。在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，線粒體起著關(guān)鍵性的作用，細(xì)胞線粒體通透性的改變可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡，Bcl-2 家族蛋白參與線粒體的這種通透性的改變[13，14]。線粒體膜的通透性受Bc1-2家族蛋白成員精確的調(diào)控，線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道可由Bc1-2家族蛋白誘導(dǎo)開(kāi)放。缺氧誘導(dǎo)Bcl-2 表達(dá)，從而抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，降低caspase-3 的活性，抑制細(xì)胞凋亡[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在COPD合并繼發(fā)性紅細(xì)胞增多的患者中，Bcl-2mRNA表達(dá)增高，提示抗凋亡因素也參與在心肺疾病導(dǎo)致紅細(xì)胞增多的過(guò)程。

心肺疾患導(dǎo)致的繼發(fā)紅細(xì)胞增多是紅細(xì)胞過(guò)度生成和凋亡減少共同作用的結(jié)果，COPD繼發(fā)紅細(xì)胞增多的細(xì)胞凋亡機(jī)制與其他疾病的凋亡有著相同或相似的信號(hào)傳導(dǎo)通路，它是一個(gè)復(fù)雜的、由caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程。本研究初步探討了繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥對(duì)慢性阻塞性肺疾病患者呼吸功能和骨髓有核紅細(xì)胞凋亡及Bcl-2 mRNA的影響，詳細(xì)機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

[1]López-Campos JL，Tan W，Soriano JB.Global burden of COPD[J].Respirology，2016，21(1)：14-23.

[2]Vestbo J，Hurd SS，Agustí AG，et al.Global strategy for the diagnosis，management，and prevention of chronic obstructive pulmonary disease：GOLD executive summary[J].Am J Respir Crit Care Med，2013，187(4)：347-365.

[3]Mihalache A，F(xiàn)itting JW，Nicod LP.Chronic obstructive pulmonary diseaseand its links with cardiovascular risk factors[J].Rev Med Suisse，2015，11(495)：2151-2156.

[4]張秀芬，劉淑娜，趙娜，等.燈盞花素對(duì)慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者肺功能和血液流變學(xué)的影響[J].臨床合理用藥雜志，2015，25：67-68.

[5]呂志，楊萬(wàn)春，胡杰貴.慢性阻塞性肺疾病與腦梗死相關(guān)性研究[J].臨床肺科雜志，2014，12：2206-2208.

[6]陶成芳.拉薩市紅細(xì)胞增多癥血液流變學(xué)分析[J].西南軍醫(yī)，2010，06：1103.

[7]張朝霞，崔森，張萍，等.慢性高原病患者骨髓組織中Bcl-w和Bid蛋白的表達(dá)研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2015，25(24)：19-22.

[8]陳媛清，崔森，李占全，等.Bcl-2、Bcl-xl、Bax及Bid在慢性高原病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及意義[J].廣東醫(yī)學(xué)，2015，36(18)：2881-2883.

[10]葉冬梅，瑞云.繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥患者血清P53和Bcl-2蛋白表達(dá)水平及意義[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2011，03：265-267.

[11]Hattangadi SM，Wong P，Zhang L，et al.From stem cell to red cell：regulation of erythropoiesis at multiple levels by multipleproteins，RNAs，and chromatin modifications[J].Blood.2011，118(24)：6258-6268.

[12]杜亞利，郭馨云，俞平，等.造血相關(guān)因子在高原紅細(xì)胞增多癥中的作用[J].醫(yī)學(xué)綜述，2015，15：2703-2706.

[13]Adrain C，Martin SJ.The mitochondrial apoptosome：a killer unleashed by the cytochrome seas[J].Trends Biochem Sci，2001，26(6)：390-397.

[14]Orrenius S.Mitochondrial regulation of apoptotic cell death[J].Toxicol Lett，2004，149(1-3)：19-23.

[15]Baek JH，Jang JE，Kang CM，et al.Hypoxia-induced VEGF enhancestumor survivability via suppression of serum deprivation-induced apoptosis[J].Oncogene，2000，19(40)：4621-4631.

Influence of Secondary polycythemia on respiratory function，apoptosis of bone marrow nucleated red blood cells and Bcl-2 mRNA in patients with COPD

Qi Yali，Xie Youbang，Gu Yuhai

(Qinghai Provincial People’s Hospital，Xining，Qinghai 810007)

Objective The aim of the study was to investigate the impact of secondary polycythemia(SP)on respiratory function，bone marrow nucleated red blood cells apoptosis and Bcl-2 mRNA expression in male patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD).Methods To select 30 male simple fracture patients as control group，32 male COPD patients and 21 male COPD complicated with SP patients as COPD group and COPD+SP group.Pulmonary function(FEV1/FVC)of patients were evaluated using the spirometer.The apoptosis rate of bone marrow nucleated red blood cells were measured by flow cytometry.Expression levels of Bcl-2 mRNA were detected by RT-PCR.Results Respiratory function(FEV1/FVC)of COPD+SP group were lower than COPD group and the mMRC score were greater than that of COPD group(P<0.05).Apoptosis rate of bone marrow nucleated red blood cells with COPD+SP were significantly lower than that of the control group and COPD group.The expression levels of Bcl-2 mRNA were significantly higher than that of the control group and COPD group(P<0.05).Conclusions SP can affect the male respiratory function(FEV1/FVC)and increase the degree of dyspnea in COPD patients.Bcl-2 family molecules may be involved in abnormal apoptosis of marrow nucleated red blood cells in male patients with COPD complicated with SP.

COPD Secondary polycythemia Bone marrow nucleated red blood cells Cells apoptosis Bcl-2

R555

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.03.002

2016-01-09

※：青海省重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目(呼吸科)(青財(cái)社字[2013]2578號(hào))資助.*：通訊作者，主任醫(yī)師，Email：qhguyuhai@163.com 齊亞麗(1978～)，女，漢族，甘肅籍，碩士，主治醫(yī)師