microRNA在法醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展

董智杰綜述，吳 岳審校

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

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microRNA在法醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展

董智杰綜述，吳 岳審校

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

miRNAs是一類由22個(gè)左右核苷酸組成的單鏈內(nèi)源性非編碼小RNA分子，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控作用，廣泛存在于動植物和病毒中，其表達(dá)具有高度的組織特異性和階段特異性[1-2]。自miRNA于1993年被首次發(fā)現(xiàn)以來[3]，人們發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅參與脂質(zhì)代謝[4]、細(xì)胞的發(fā)育及干細(xì)胞的維持等眾多生理過程[5]，還參與腫瘤[6]、糖尿病[7]、心血管疾病[8]等病理過程。隨著對miRNA研究的逐漸深入，miRNA的應(yīng)用逐漸拓展到法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本文將從體液來源鑒定、死亡時(shí)間推斷、死亡原因分析、損傷時(shí)間推斷、精神疾病的鑒定及年齡推斷等方面對miRNA在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用現(xiàn)狀及可能存在的應(yīng)用空間進(jìn)行綜述，以期為今后miRNA在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供幫助。

1 體液來源鑒定

對案發(fā)現(xiàn)場遺留的體液進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定對案發(fā)現(xiàn)場的重建、案發(fā)過程的推斷及證據(jù)鏈的完善具有重要意義。法醫(yī)體液鑒定方法包括傳統(tǒng)的免疫學(xué)法或生化檢測分析法，但這些方法存在特異性低、需要檢材量大、不適合腐敗檢材等缺點(diǎn)[9]。之后，有學(xué)者提出用靈敏度高的光譜法進(jìn)行體液鑒定，但此方法不能區(qū)分非人類檢材并會破壞檢材的DNA[9]。近年來，具有組織特異性的mRNA被用來替代傳統(tǒng)方法進(jìn)行體液鑒定，但mRNA易受溫度、濕度及內(nèi)外源RNA酶等因素的影響而發(fā)生降解，因此同樣不適合對腐敗檢材檢測[10]。miRNA的表達(dá)具有組織特異性，且其片段小，穩(wěn)定不易降解，不受溫度、死因、年齡等的影響，適合腐敗檢材，因此miRNA比mRNA更適合作法醫(yī)體液鑒定[11]。

Hanson等[12]于2009年首次應(yīng)用miRNA進(jìn)行法醫(yī)相關(guān)體液鑒定，從452個(gè)人類miRNA中篩選出9個(gè)分別在外周血、精液、唾液、陰道分泌物、經(jīng)血中特異性表達(dá)的miRNA(見表1)，其靈敏度達(dá)到50 pg總RNA。

繼而，Hanson等[13]又從1198個(gè)人類miRNA中，篩選出3個(gè)miRNA(miR144-5p、miR144-3p和miR185-5p)，并以此建立Logistic回歸模型，該模型對經(jīng)血鑒定的準(zhǔn)確度高達(dá)100%，其檢出限小于1 ng總RNA，從而在一定程度上解決了經(jīng)血和陰道分泌物不易區(qū)分的難題。Zubakov等[14]從718個(gè)人類miRNA中篩選出9個(gè)用于體液鑒定的miRNA(見表1)，其靈敏度高達(dá)0.1 pg總RNA，且在實(shí)驗(yàn)室條件下保存1年之久的體液miRNA未發(fā)生明顯降解。該研究中只有精液標(biāo)記物(miR-135a，miR-10a)與Hanson等[12]的結(jié)果(精液標(biāo)記物為miR-135b和miR-10b)相關(guān)，其他的miRNA標(biāo)記物沒有重疊。原因可能是Hanson等[12]用SYBR Green染料法而本實(shí)驗(yàn)用TaqMan探針法，且本實(shí)驗(yàn)的樣本量小，不能排除miRNA表達(dá)的個(gè)體差異。Wang等[15]用TaqManRT-qPCR技術(shù)，通過建立效率校準(zhǔn)模型證明miR-16在靜脈血中特異性表達(dá)，而miR-658和miR-205不具有唾液特異性，與Hanson等[12]的研究結(jié)果不一致，同樣可能是實(shí)驗(yàn)方法的不同造成的，此模型可提高miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性和可靠性。此后，Wang等[16]在檢測人唾液特異性miRNA時(shí)提出聯(lián)合應(yīng)用兩種或三種miRNA階梯式進(jìn)行體液鑒定的新方法，不僅可以鑒定唾液，而且可以有效地鑒定其余四種體液，為體液鑒定提供了新思路。Li等[17]用線性反轉(zhuǎn)錄引物建立了基于體液鑒定的miRNA和DNA共提取及共分析策略，從同一樣本中分析獲得了4個(gè)miRNA標(biāo)記物(見表1)和DNA STR譜，此方法不僅節(jié)省時(shí)間和檢材，還可以一次性完成體液鑒定及STR分型。Sauer等[18]提出了檢測相關(guān)體液miRNA表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)化策略，包括樣本的采集、保存及目的基因的提取均采用此標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)議，以將外部差異降到最低；同時(shí)選擇合適的內(nèi)源性參考基因，以補(bǔ)償內(nèi)源性非生物差異。此后，Sauer等[19]篩選出4種miRNA用以區(qū)分精液、唾液、陰道分泌物、靜脈血、經(jīng)血：miR-891 a-5 p用以準(zhǔn)確鑒定精液；miR-144-3 p和miR-203 a-3 p結(jié)合，通過判別函數(shù)分析，區(qū)分靜脈血和月經(jīng)血；miR-203 a-3p和miR-124-3 p結(jié)合，通過判別函數(shù)分析，區(qū)分唾液和陰道分泌物。但在此項(xiàng)研究中，miR-658在唾液中缺乏特異性擴(kuò)增，與Wang等[15]人的研究結(jié)果一致，而與Hanson等[12]人的研究結(jié)果矛盾，可能是由于Sauer和Wang等人使用TaqMan探針法，而Hanson等人用SYBR Green染料法所致。上述研究所用保存36年之久的外周血樣本其miRNA未見明顯降解。[19]

表1 miRNA用于體液鑒定的不同結(jié)果

Table 1 miRNA is used for different results of body fluid identification

由此可見，miRNA在體液鑒定方面有良好的應(yīng)用價(jià)值。不同團(tuán)隊(duì)研究結(jié)果不一的可能原因是實(shí)驗(yàn)方法、檢測平臺及統(tǒng)計(jì)分析模型不同所致。因此，從最初的樣本處理到實(shí)驗(yàn)方法、內(nèi)參基因的選擇及最后的統(tǒng)計(jì)分析模型的建立，均需要制定規(guī)范統(tǒng)一的準(zhǔn)則，以提高結(jié)果的可靠性。

2 死亡時(shí)間推斷

死亡時(shí)間推斷對確定案發(fā)時(shí)間、劃定偵察范圍、認(rèn)定和排除犯罪嫌疑人有重要意義。傳統(tǒng)死亡時(shí)間的推斷可根據(jù)尸體現(xiàn)象、胃內(nèi)容物消化程度、昆蟲發(fā)育情況等，但這些方法易受主觀因素和環(huán)境因素的影響。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，研究人員通過測定蛋白質(zhì)及DNA、mRNA的含量來推斷死亡時(shí)間，但上述分子不穩(wěn)定，易受環(huán)境因素及酶的影響而發(fā)生降解，使其在死亡時(shí)間推斷方面存在一定的局限性。miRNA因其片段短，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且不易受外界環(huán)境因素的影響[11]，被視為死亡時(shí)間推斷的一類新分子。

李文燦等[20]通過RT-qPCR檢測單一溫度下大鼠心肌組織miR-1-2的含量與死亡時(shí)間的關(guān)系：死后120 h內(nèi)miR-1-2含量保持相對穩(wěn)定，在死后早期可以作為內(nèi)參基因以校正其他分子的表達(dá)水平；在死亡120 h后表現(xiàn)出隨時(shí)間的延長而降解的趨勢，提示miR-1-2可用來推斷晚期死亡時(shí)間。此后，大批學(xué)者[11，21-23]進(jìn)一步研究了在不同溫度下不同組織的miRNA含量與死亡時(shí)間的關(guān)系：結(jié)果均表明，miRNA不受溫度的影響，在死后相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)不發(fā)生降解，可作為內(nèi)參標(biāo)記物或推斷晚期死亡時(shí)間的標(biāo)志物，與李文燦等[20]的研究結(jié)果一致。

Kakimoto等[24]研究了用福爾馬林固定長達(dá)3年之久的急性心肌梗死病人心肌組織中miRNA的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)miR-191和miR-26 b的含量穩(wěn)定，未發(fā)生降解，并用作為內(nèi)參基因。進(jìn)一步證明miRNA的穩(wěn)定性及作為內(nèi)參基因的可靠性。

Sharma等[25]研究發(fā)現(xiàn)小鼠心臟和大腦組織中AATF RNA基因組(包括AATF mRNA及其編碼的miR-2909)的晝夜節(jié)律與死亡時(shí)間具有協(xié)同性，為死亡時(shí)間的推斷提供了更精確可靠的方式，同時(shí)為miRNA在死亡時(shí)間推斷方面的應(yīng)用提供了新思路。

目前，miRNA在死亡時(shí)間推斷方面的研究還局限于動物實(shí)驗(yàn)和單一環(huán)境，與人體和自然環(huán)境存在較大差異，需進(jìn)一步對人體標(biāo)本和環(huán)境溫度濕度及含氧量進(jìn)行綜合研究，以提高準(zhǔn)確性。

3 死亡原因分析

全面正確的死因分析為案件的偵察、審理提供有力的科學(xué)依據(jù)，關(guān)系到案件的性質(zhì)及對當(dāng)事人的定罪量刑，因此死因分析至關(guān)重要。常規(guī)的死因分析主要通過尸體解剖和病理檢查進(jìn)行，目前免疫組織化學(xué)法和分子生物學(xué)法被用來進(jìn)行死因分析的研究。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可作為死因的標(biāo)記物，為死因分析提供輔助參考依據(jù)，有望成為死因分析的新手段。

Courts等[26]研究發(fā)現(xiàn)在嬰兒猝死綜合癥中，心臟特異性miR-1和腦組織特異性let-7 b的表達(dá)水平顯著上調(diào)。表明miR-1和let-7 b可作為嬰兒猝死綜合癥的分子標(biāo)記物，為嬰兒的死因分析提供輔助參考依據(jù)。Sharma等[27]在研究砷毒性RNA組學(xué)調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答的過程中發(fā)現(xiàn)，亞砷酸鈉中毒小鼠miR-2909的表達(dá)升高。提示miRNA含量的變化在毒物慢性中毒中有一定價(jià)值，可以輔助法醫(yī)進(jìn)行毒物分析及死亡原因推斷。Yu等[28]發(fā)現(xiàn)了8種miRNA在淡水溺死模型中表達(dá)量增加，而在海水中減少，其中，miR-706在淡水溺死模型中的表達(dá)量比在對照組和海水溺死模型中的表達(dá)量均高，可以作為溺死模型鑒定的潛在分子標(biāo)記物。Schober等[29]研究發(fā)現(xiàn)，用miR-138/miR-744或miR-195/miR-324-5 p可完全區(qū)分創(chuàng)傷性額皮質(zhì)損傷死與自然死亡者。提示miRNA可用作創(chuàng)傷性腦損傷的標(biāo)志物或評估腦損傷的嚴(yán)重程度，為死因分析提供依據(jù)。

4 損傷時(shí)間推斷

準(zhǔn)確推斷損傷時(shí)間可以鑒別生前傷和死后傷以及確定損傷后存活時(shí)間，對于案件重建和偵破有重要意義。損傷時(shí)間推斷的方法包括肉眼觀察、顯微鏡檢查和酶組織化學(xué)法、生物化學(xué)法、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)法檢測等，還有學(xué)者測定創(chuàng)口中mRNA、DNA含量來推斷損傷時(shí)間。近年來，有研究顯示miRNA表達(dá)譜在損傷后變化顯著，可用來推斷損傷時(shí)間。

彭濤等[30]研究新生大鼠缺氧缺血性腦損傷大腦皮質(zhì)miRNA表達(dá)量的變化，用miRNA芯片篩選出27個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)超過2倍，60個(gè)下調(diào)超過2倍，又用RT-qPCR檢測所選擇的9個(gè)miRNA，結(jié)果與miRNA芯片趨勢相同。提示miRNA的量在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷中顯著變化，深入研究miRNA表達(dá)量的變化規(guī)律，可以揭示其與損傷時(shí)間之間的關(guān)系。

Sun等[31]研究了創(chuàng)傷性腦損傷后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬miRNA譜的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)17種miRNA在各時(shí)間點(diǎn)均有顯著性變化，提示損傷后miRNA的表達(dá)變化規(guī)律具有很好的時(shí)序性。并指出miR-142-3 p和miR-221可作為創(chuàng)傷性腦損傷的潛在生物標(biāo)記物。

5 精神疾病鑒定

確定被鑒定人在實(shí)施危害行為時(shí)的精神狀態(tài)及刑事責(zé)任能力是法醫(yī)精神病學(xué)的重要任務(wù)之一，這決定了被鑒定人是否要承擔(dān)刑事責(zé)任。近年來的研究表明，精神病患者與miRNA的表達(dá)水平具有一定的關(guān)聯(lián)性，可為精神疾病的鑒定提供新的依據(jù)。

Moreau等[32]研究了精神分裂癥和躁郁癥患者死后腦組織435種miRNA表達(dá)水平的變化，其中19%的miRNA表達(dá)水平下降，在躁郁癥患者中表現(xiàn)得尤為明顯，表明miRNA可作為精神疾病的一種新標(biāo)記物。Liang等[33]研究發(fā)現(xiàn)，let-7家族啟動子的基因多態(tài)性會增加重度抑郁癥的風(fēng)險(xiǎn)。因此，可以通過測定let-7的基因型來輔助診斷是否患有重度抑郁癥，進(jìn)一步證實(shí)miRNA與精神疾病緊密相關(guān)，可為精神疾病的鑒定提供新的思路。

6 年齡推斷

年齡的推斷對確定尸源及判斷刑事責(zé)任能力至關(guān)重要，目前主要通過骨骼和牙齒的形態(tài)特征推斷年齡，但這些方法對生物痕跡身源者的年齡推斷不適用。為滿足法醫(yī)實(shí)踐的需求，研究者們檢測到一些年齡相關(guān)的分子，其中包括miRNA，可作為年齡推斷的參考標(biāo)記物。

Hooten等[34]研究發(fā)現(xiàn)外周血單核細(xì)胞中9種miRNA(miR-103，miR-107，miR-128，miR-130a，miR-155，miR-24，miR-221，miR-496，miR-1538)的表達(dá)豐度在老年組中顯著低于年輕組，提示在人類的衰老過程中伴隨著miRNA表達(dá)的變化，miRNA可作為年齡推斷的標(biāo)記物。Hackl等[35]研究細(xì)胞和機(jī)體衰老模型中miRNA表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)miR-17、miR-19 b、miR-20 a和miR-106 a均呈現(xiàn)出下調(diào)，以miR-17下調(diào)最為顯著，進(jìn)一步證實(shí)miRNA的表達(dá)量具有隨年齡變化的規(guī)律。同樣，Li等[36]研究發(fā)現(xiàn)，mir-223、let-7 d和mir-130 a調(diào)節(jié)人類衰老過程；Rubie等[37]提出，miR-496通過控制雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路參與人類衰老的調(diào)節(jié)過程。這些研究結(jié)果提示，miRNA可作為年齡推斷的新型標(biāo)記物，為年齡的推斷提供新思路。

綜上所述，miRNA的應(yīng)用在法醫(yī)學(xué)中表現(xiàn)出巨大潛力，涉及法醫(yī)學(xué)中的多個(gè)方向，為體液鑒定、死亡時(shí)間推斷、死亡原因分析、損傷時(shí)間推斷、精神疾病鑒定及年齡推斷提供了一個(gè)新的視角。但目前對其研究仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，且不同團(tuán)隊(duì)得出的結(jié)果各異。因此，如何將實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐當(dāng)中且建立可靠的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程是未來研究的重點(diǎn)。由于miRNA參與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展過程，在機(jī)體不同的病理生理狀態(tài)下其表達(dá)量有差異，因此會影響其在法醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的準(zhǔn)確性，故只能對健康個(gè)體進(jìn)行miRNA相關(guān)法醫(yī)學(xué)推斷。

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10.13452/j.cnki.jqmc.2016.03.013

2016-05-02

董智杰(1990～)，女，漢族，河南籍，2014級科學(xué)班研究生