MicroRNA-630的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后相關(guān)性

加 雄，季 剛，郭震芳

(1.陜西楊凌示范區(qū)醫(yī)院；2.西京醫(yī)院；3.銅川市礦務(wù)局第二人民醫(yī)院)

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MicroRNA-630的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后相關(guān)性

加 雄1，季 剛2，郭震芳3

(1.陜西楊凌示范區(qū)醫(yī)院；2.西京醫(yī)院；3.銅川市礦務(wù)局第二人民醫(yī)院)

目的 在眾多microRNAs中，MiR-630在人類惡性腫瘤的多種生物學(xué)功能中具有復(fù)雜的調(diào)控作用，本研究主要探討胃癌患者組織中miR-630的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。方法 收集236例未接受術(shù)前新輔助化療的胃癌患者腫瘤組織及癌旁組織。用qPCR檢測(cè)miR-630的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其與患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 與癌旁組織相比，miR-630的表達(dá)水平在癌組織中高表達(dá)，并與胃癌侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)。生存分析顯示miR-630高表達(dá)與總體生存差相關(guān)。多因素分析顯示，miR-630是預(yù)測(cè)胃癌術(shù)后生存的獨(dú)立預(yù)后因素。結(jié)論 miR-630在胃癌組織中高表達(dá)，與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，是預(yù)測(cè)胃癌患者術(shù)后生存的獨(dú)立預(yù)后因素。

MiR-630 qPCR TNM 分期

相關(guān)數(shù)據(jù)表明，胃癌發(fā)病率存在地區(qū)差異，中國發(fā)病率比西方國家高[1]。根據(jù)2008年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我國胃癌發(fā)病率高達(dá)0.029%，成為目前中國第二大癌癥及惡性腫瘤相關(guān)的第三大致死原因，僅2008年就新增464 439例確診病例，死亡352 315例[2-10]。

MicroRNAs(miRNAs)是一類高度保守的單鏈小分子非編碼RNA，被認(rèn)為是通過轉(zhuǎn)錄抑制和裂解mRNA發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子[11]。MicroRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)，通過與靶mRNA的39個(gè)非轉(zhuǎn)錄區(qū)相結(jié)合，根據(jù)互補(bǔ)堿基配對(duì)的程度，降解mRNA和抑制轉(zhuǎn)錄[12，13]。目前的研究表明，MicroRNAs在發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡和代謝等多種生物學(xué)功能方面發(fā)揮十分重要的作用[14]，同時(shí)也參與惡性腫瘤血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移[15]。miRNA的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，依據(jù)它們作用的靶基因不同，一些miRNA發(fā)揮抑癌的作用，而另一些則發(fā)揮促癌的作用。對(duì)miRNA的深入研究能夠?qū)盒阅[瘤的診斷和預(yù)后判斷產(chǎn)生更加深刻的認(rèn)識(shí)[16]。近來有證據(jù)表明，miRNAs在多種惡性腫瘤如胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病中表達(dá)下調(diào)[17-19]。在人胃癌中，發(fā)現(xiàn)多種異常表達(dá)的miRNAs，如miR-21、miR-22、miR-23、miR-127、miR-148、miR-202、miR-433，它們多具有抑癌或促癌的作用[20-25]。這些結(jié)果表明，miRNAs在包括胃癌在內(nèi)的惡性腫瘤中發(fā)揮十分重要的作用。針對(duì)特定的miRNA的功能和臨床意義的研究，能夠更加深入地認(rèn)識(shí)相關(guān)miRNA的臨床意義。本研究中，我們檢測(cè)miR-630在胃癌組織標(biāo)本中的表達(dá)，并分析其與胃癌患者總體生存的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2007年1月至2008年12月間在第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病院接受胃癌手術(shù)患者的新鮮癌組織標(biāo)本及相對(duì)應(yīng)的正常粘膜組織標(biāo)本236例，所有患者術(shù)前均未接受化療，所有患者均簽署知情同意書。此外，收集18例非腫瘤性病變患者的正常粘膜組織作為對(duì)照。所有組織病理學(xué)結(jié)果均經(jīng)西京醫(yī)院病理科醫(yī)師證實(shí)。所有組織標(biāo)本均在離體后10分鐘內(nèi)放入液氮中保存，用于RNA的提取。同時(shí)收集患者的臨床病理資料如年齡、性別及腫瘤分化程度及TNM 分期等。所有患者術(shù)后至少隨訪5年。總體生存被定義為患者從接受手術(shù)起直至死亡的一段時(shí)間。所有患者的隨訪信息每3個(gè)月更新一次?；颊叩乃劳鼍?jīng)過家庭成員和死亡證明的確認(rèn)。

1.2 qPCR

利用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取全部癌組織及癌旁組織的總RNA。提取的RNA經(jīng)證實(shí)完整性較好的(OD A260/A280值接近2.0)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用基因特異性引物合成miR-630和RNU44(特異性cDNA)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中hsa-miR-630的表達(dá)。所有樣品檢測(cè)均重復(fù)3次。利用△△CT法計(jì)算miR-630的相對(duì)表達(dá)量(RNU44為內(nèi)參)。利用ABI 7500系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，用SDS 2.2.2軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MiR-630在胃癌中的表達(dá)情況

我們利用real-time PCR檢測(cè)miR-630在236例胃癌組織及相對(duì)應(yīng)癌旁組織和18例正常胃粘膜組織中的表達(dá)(以RNU44為內(nèi)參)。miR-630在癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為8.51±1.63，在癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量為3.25±0.63，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=46.240，P=0.0000)，提示miR-630在胃癌中可能發(fā)揮促癌作用。我們將miR-630的相對(duì)表達(dá)量高于3.88者認(rèn)為是高表達(dá)，低于3.88為低表達(dá)。在236例患者中有138例高表達(dá)(58.47%)，98例低表達(dá)(41.53%)。

2.2 MiR-630的表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

為進(jìn)一步揭示miR-630在胃癌進(jìn)展過程中的作用，我們分析了胃癌患者臨床病理資料與miR-630表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果顯示，與T1和T2期患者相比，T3和T4期患者出現(xiàn)miR-630高表達(dá)的頻率更高(68.3% vs 49.6%，P=0.007)；miR-630的高表達(dá)頻率在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者(74.2% vs 39.8%，P<0.001)和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者(85.7% vs 54.8%，P=0.002)。此外，miR-630高表達(dá)的頻率隨著患者TNM分期升高而升高(P<0.001)。但miR-630的表達(dá)在不同性別、不同年齡、不同腫瘤分化程度、不同腫瘤部位以及不同lauren分級(jí)的胃癌患者中分布頻率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 胃癌患者臨床病理參數(shù)與miR-630表達(dá)的關(guān)系(%)

Table 1 The relationship between clinical pathological parameters and miR-630 expression in patients with gastric cancer(%)

2.3 MiR-630的表達(dá)與胃癌患者總體生存的關(guān)系

在整個(gè)隨訪期間，236例患者中有130例(55.1%)患者死亡，總體中位生存時(shí)間為48個(gè)月。利用Kaplan-Meier法分析miR-630表達(dá)對(duì)于預(yù)測(cè)胃癌患者術(shù)后總體生存的價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與miR-630低表達(dá)的患者相比，miR-630高表達(dá)的患者預(yù)后更差( Log-rankP<0.001，圖1)。由于miR-630低表達(dá)的患者中超過50%的患者在隨訪結(jié)束時(shí)仍存活，因而無法分析miR-630低表達(dá)患者的中位生存時(shí)間，miR-630高表達(dá)患者術(shù)后的中位生存時(shí)間僅34個(gè)月(95% CI：28.2-39.8)。當(dāng)我們把miR-630低表達(dá)患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio，HR)看作1，那么miR-630高表達(dá)患者的HR是低表達(dá)患者的2.28倍(95% CI：1.57-3.32；P<0.001)。由于單因素分析miR-630表達(dá)與胃癌患者術(shù)后總體生存相關(guān)，我們進(jìn)一步分析miR-630的表達(dá)是否是影響胃癌患者術(shù)后生存的獨(dú)立預(yù)后因素，我們將miR-630的表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移納入多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型，性別、年齡、TNM分期等變量作為校正變量。結(jié)果表明，miR-630高表達(dá)的患者經(jīng)校正后的 HR為3.51(95%CI：1.83-6.72；P<0.001)。這些結(jié)果表明miR-630是預(yù)測(cè)胃癌患者術(shù)后總體生存的獨(dú)立預(yù)后因子，miR-630表達(dá)增高的患者預(yù)后較差(表2)。

圖1 miR-630表達(dá)與胃癌患者術(shù)后總體生存關(guān)系圖

Figure 1 miR-630 expression for predicting overall survival of postoperative gastric cancer patients

表2 miR-630表達(dá)和臨床各因素與胃癌患者術(shù)后總體生存的關(guān)系

Table 2 The relationship between miR-630 expression and clinical factors with overall survival in postoperative patients with gastric cancer

3 討論

最近的研究表明，目前發(fā)現(xiàn)的miRNA超過1900種，在哺乳動(dòng)物中，這些miRNA調(diào)控了超過60%的基因表達(dá)[26]。由于它們?cè)诨虮磉_(dá)調(diào)控方面的重要性，目前認(rèn)為miRNA參與了多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，如增殖、凋亡和分化，因此miRNAs在從發(fā)育到癌癥等多種生理和病理過程中發(fā)揮十分重要的作用[27-29]。一項(xiàng)在一期非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)miRNAs能夠預(yù)測(cè)患者術(shù)后復(fù)發(fā)的研究表明，在1 000種miRNA中，mir-630是一種預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)最常用的miRNA之一[30]。另一項(xiàng)在非小細(xì)胞肺癌中的研究表明，miR-630調(diào)控順鉑誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡，提示miR-630在非小細(xì)胞肺癌中是調(diào)節(jié)順鉑反應(yīng)性的潛在調(diào)節(jié)因子[31]。此外，MiR-630還被發(fā)現(xiàn)在頭頸鱗癌順鉑化療后表達(dá)上調(diào)，并且調(diào)控ATG5、ATG6/BECN1、ATG10、ATG12、ATG16L1和UVRAG的表達(dá)[32，33]。最近的研究證實(shí)，在胰腺癌細(xì)胞中上調(diào)miR-630的表達(dá)能夠通過IGF-1R誘導(dǎo)凋亡[34]。由于不同的miRNAs在不同的腫瘤組織中作用的靶基因不同，因而miRNAs在不同腫瘤中的功能不同。因此，對(duì)特定miRNAs功能的研究能夠加深對(duì)腫瘤復(fù)雜性基因表達(dá)調(diào)控的理解。

在本研究中，我們利用real-time PCR檢測(cè)了236例術(shù)前未接受新輔助化療胃癌患者組織標(biāo)本中miR-630的表達(dá)，基于相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)的結(jié)果，我們進(jìn)一步分析了miR-630的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果表明，與癌旁組織及正常組織相比，miR-630在胃癌組織中高表達(dá)，提示miR-630可能參與了胃癌的進(jìn)展。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)miR-630的表達(dá)與胃癌侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān)。miR-630的高表達(dá)更容易發(fā)生在浸潤深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期較晚的患者中，提示miR-630可能參與了胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，miR-630可能在胃癌的發(fā)生和進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。

由于miR-630As的表達(dá)被發(fā)現(xiàn)與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，考慮到胃癌侵襲轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，miR-630可能成為潛在的預(yù)測(cè)胃癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立因素。我們通過Kaplan-Meier法分析總體生存狀況來評(píng)估m(xù)iR-630在胃癌生存預(yù)后中的價(jià)值。結(jié)果表明，miR-630高表達(dá)的患者總體生存要明顯短于miR-630低表達(dá)的患者，提示miR-630是胃癌患者生存預(yù)測(cè)的一個(gè)預(yù)后因子。我們用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)一步評(píng)估m(xù)iR-630在胃癌中預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-630的高表達(dá)是預(yù)測(cè)胃癌術(shù)后生存的獨(dú)立預(yù)后因子。這些結(jié)果表明，miR-630成為除TNM分期以外的獨(dú)立預(yù)測(cè)胃癌患者生存預(yù)后的分子標(biāo)記，miR-630高表達(dá)的患者術(shù)后具有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，于是這部分患者應(yīng)該接受更加積極的治療。這些結(jié)果與在非小細(xì)胞肺癌中的研究結(jié)果一致，提示miR-630在這兩種腫瘤中發(fā)揮的作用相似。于是，miR-630的表達(dá)與胃癌患者術(shù)后生存預(yù)后的正相關(guān)關(guān)系不僅能夠預(yù)測(cè)胃癌患者術(shù)后早期發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，還能夠?yàn)槲覀兩钊肜斫馕赴┣忠u轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制研究提供線索。

綜上所述，miR-630在胃癌中高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。因此，miR-630可能在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。同時(shí)，miR-630可能成為臨床上預(yù)測(cè)胃癌患者術(shù)后生存的重要分子標(biāo)記。特異性抑制miR-630的表達(dá)可能成為胃癌新的治療策略。

[1]Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61(2)：69-90.

[2]DeSantis C，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics for African Americans[J].CA Cancer J Clin，2013，63(3)：151-166.

[3]Siegel R，Naishadham D.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2013，63(1)：11-30.

[4]Bray F，Sankila R，F(xiàn)erlay J，et al.Estimates of cancer incidence and mortality in Europe in 1995[J]. Eur J Cancer，2002，38(1)：99-166.

[5]Dassen AE，Lemmens VE，van de Poll-Franse LV，et al.Trends in incidence，treatment and survival of gastric adenocarcinoma between 1990 and 2007：a population-based study in the Netherlands[J].Eur J Cancer2010，46(6)：1101-1110.

[6]Lavy R，Kapiev A，Poluksht N，et al.Incidence trends and mortality rates of gastric cancer in Israel.Gastric Cancer，2013，16(2)：121-125.

[7]Jing JJ，Liu HY，Hao JK，et al.Gastric cancer incidence and mortality in Zhuanghe，China，between 2005 and 2010.World J Gastroenterol，2012，18(11)：1262-1269.

[8]Yang L.Incidence and mortality of gastric cancer in China[J].World J Gastroenterol，2006，12(1)：17-20.

[9]Lin Y，Ueda J，Kikuchi S，et al.Comparative epidemiology of gastric cancer between Japan and China[J].World J Gastroenterol，2011，17(39)：4421-4428.

[10]Inoue M，Tsugane S.Epidemiology of gastric cancer in Japan[J].Postgrad Med J，2005，81(957)：419-424.

[11]Krol J，Krzyzosiak WJ.Structure analysis of microRNA precursors[J].Methods Mol Biol，2006，342：19-32.

[12]Iorio MV，Croce CM.MicroRNA dysregulation in cancer：diagnostics，monitoring and therapeutics.A comprehensive review[J].EMBO Mol Med，2012，4(3)：143-159.

[13]Shah AA，Meese E，Blin N.Profiling of regulatory microRNA transcriptomes in various biological processes：a review[J].J Appl Genet 51(4)：501-507.

[14]Chen F，Hu SJ.Effect of microRNA-34a in cell cycle，differentiation，and apoptosis：a review[J].J Biochem Mol Toxicol，2012，26(2)：79-86.

[15]Yanokura M，Banno K，Kobayashi Y，et al.MicroRNA and endometrial cancer：Roles of small RNAs in human tumors and clinical applications(Review)[J].Oncol Lett，2010，1(6)：935-940.

[16]Srivastava K，Srivastava A.Comprehensive review of genetic association studies and meta-analyses on miRNA polymorphisms and cancer risk[J].PloS One，2012，7(11)：e50966.

[17]Piva R，Spandidos DA，Gambari R.From microRNA functions to microRNA therapeutics：Novel targets and novel drugs in breast cancer research and treatment(Review)[J].Int J Oncol，2013，43(3)：985-994.

[18]Catto JW，Alcaraz A，Bjartell AS，et al.MicroRNA in prostate，bladder，and kidney cancer：a systematic review[J].Eur Urol，2011，59(5)：671-681.

[19]Mazeh H，Mizrahi I，Ilyayev N，et al.The Diagnostic and Prognostic Role of microRNA in Colorectal Cancer-a Comprehensive review[J].J Cancer 4(3)：281-295.

[20]Chan SH，Wu CW，Li AF，et al.miR-21 microRNA expression in human gastric carcinomas and its clinical association[J].Anticancer Res，2008，28(2A)：907-911.

[21]Zhao Y，Li C，Wang M，et al.Decrease of miR-202-3p Expression，a Novel Tumor Suppressor，in Gastric Cancer[J].PLoS One，2013，8(7)：e69756.

[22]Guo LH，Li H，Wang F，et al.The Tumor Suppressor Roles of miR-433 and miR-127 in Gastric Cancer[J].Int J Mol Sci，2013，14(7)：14171-14184.

[23]Wang SH，Li X，Zhou LS，et al.microRNA-148a suppresses human gastric cancer cell metastasis by reversing epithelial-tomesenchymal transition[J].Tumour Biol，2013，36(4)：3705-3712.

[24]Wang W，Li F，Zhang Y，et al.Reduced expression of miR-22 in gastric cancer is related to clinicopathologic characteristics or patient prognosis[J].Diagn Pathol，2013，8：102.

[25]Liu X，Ru J，Zhang J，et al.miR-23a targets interferon regulatory factor 1 and modulates cellular proliferation and paclitaxel-induced apoptosis in gastric adenocarcinoma cells[J].PLoS One，2013，8(6)：e64707.

[26]Esteller M.Non-coding RNAs in human disease[J].Nat Rev Genet，2011，12(12)：861-874.

[27]He L，Hannon GJ.MicroRNAs：small RNAs with a big role in gene regulation[J].Nat Rev Genet，2004，5(7)：522-531.

[28]Mendell JT .MicroRNAs：critical regulators of development，cellular physiology and malignancy[J].Cell Cycle，2005，4(9)：1179-1184.

[29]Kasinski AL，Slack FJ.Epigenetics and genetics.MicroRNAs en route to the clinic：progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy[J].Nat Rev Cancer，2011，11(12)：849-864.

[30]Patnaik SK，Kannisto E，Knudsen S，et al.Evaluation of microRNA expression profiles that may predict recurrence of localized stage I non-small cell lung cancer after surgical resection[J].Cancer Res，2010，70(1)：36-45.

[31]Galluzzi L，Morselli E，Vitale I，et al.(2010)miR-181a and miR-630 regulate cisplatin-induced cancer cell death[J].Cancer Res，2010，70(5)：1793-1803.

[32]Huang Y，Chuang A，Hao H，et al.(2011)Phospho-DeltaNp63alpha is a key regulator of the cisplatin-induced microRNAome in cancer cells[J].Cell Death Differ，2011 18(7)：1220-1230.

[33]Huang Y，Guerrero-Preston R，Ratovitski EA.Phospho-DeltaNp63 alphadependent regulation of autophagic signaling through transcription and micro-RNA modulation[J].Cell Cycle，2012，11(6)：1247-1259.

[34]Farhana L，Dawson MI，Murshed F，et al.Upregulation of miR-150 and miR-630 induces apoptosis in pancreatic cancer cells by targeting IGF-1R[J].PLoS One，2013，8(5)：e61015.

Analysis on the relationship between microRNA-630 expression and prognosis of gastric cancer

Jia Xiong1，Ji Gang2，Guo Zhenfang3

(1.Hospital of Yang Lin Demonstration Area；2.Xi Jing Hospital；3. Second Hospital of Tong Chuan for Bureau of Mines)

Objective microRNAs are noncoding RNAs that regulate multiple cellular processes during cancer progression.Among various microRNAs，miR-630 has recently been identified to be implicated in many critical processes in human malignancies.We aimed to investigate the significance and prognostic value of miR-630 in human gastric cancer.Methods Gastric cancer and adjacent normal specimens from 236 patients who had not received chemotherapy were collected.The expression of miR-630 was investigated by quantitative real-time PCR assay and its association with cancer prognosis was analyzed by statistical analysis.Results miR-630 expression level was significantly increased in gastric cancer compared with adjacent normal specimens.It showed that miR-630 expression was associated with gastric cancer invasion，lymph node metastasis，distant metastasis and TNM stage.In addition，survival analysis proved that elevated miR-630 expression was associated with poor prognosis of patients.Multivariate survival analysis also proved that miR-630 was an independent prognostic marker for postoperative survival of patients with gastric caner.Conclusions Higher expression of miR-630 is associated with tumor progression and it may be an independent prognostic factor for postoperative patients with gastric cancer.

MiR-630 qPCR TNM staging

R656.6

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.03.008

2015-12-13

加雄(1975～)，男，漢族，陜西籍，主治醫(yī)師