血漿MicroRNA-134在西寧地區(qū)急性肺栓塞患者中的診斷價值※

王亞平，趙 振，張 恒，多 杰

(青海省人民醫(yī)院呼吸科，青海 西寧 810007)

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血漿MicroRNA-134在西寧地區(qū)急性肺栓塞患者中的診斷價值※

王亞平，趙 振，張 恒，多 杰*

(青海省人民醫(yī)院呼吸科，青海 西寧 810007)

目的 通過檢測血漿MicroRNA-134相對表達水平，探討其在西寧地區(qū)急性肺栓塞患者診斷中的臨床價值。方法 選取西寧地區(qū)急性肺栓塞患者、慢性肺栓塞患者及健康體檢者各20例，采用Real-timePCR法分別檢測各組患者血漿MicroRNA-134表達水平，使用ROC曲線評價MicroRNA-134在西寧地區(qū)急性肺栓塞患者中的診斷價值。結(jié)果 (1)MicroRNA-134在急性肺栓塞組中的表達水平顯著高于慢性肺栓塞組及健康對照組，慢性肺栓塞組的表達水平高于健康對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；(2)通過ROC曲線評估MicroRNA-134對急性肺栓塞患者的診斷價值，與D-二聚體作對照，兩者敏感性一致(均為100%)，其中MicroRNA-134特異性優(yōu)于D-二聚體(分別為71.41%，66.7%)。結(jié)論 血漿miRNA-134在西寧地區(qū)急性肺栓塞患者診斷中具有較高的臨床價值，可作為其診斷的潛在生物學標志物。

肺栓塞 MicroRNA-134 D-二聚體

尋找對肺栓塞診斷價值高、無創(chuàng)、簡便的診斷方法具有較大的現(xiàn)實意義。隨著醫(yī)學分子生物學的飛速發(fā)展，尋找具有重要診斷價值的分子生物學標志物是當前研究的熱點。

MicroRNA(miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，存在于真核細胞生物體內(nèi)，與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合，使其翻譯受到阻礙，完成對基因的調(diào)控，從而參與了機體許多生物進程，如細胞分裂增殖、血管生成、細胞代謝等[1-2]。由于循環(huán)miRNA可穩(wěn)定存在于體內(nèi)且不易被酶分解，其非常適合作為機體疾病診斷的生物學標志物。目前在心功能衰竭、心肌梗死、脊髓損傷中已經(jīng)篩選出了具有特異診斷價值的miRNA[3-8]。西寧地區(qū)平均海拔2260 m，輕度低氧為其主要的環(huán)境特點，該地區(qū)肺栓塞發(fā)病率及病死率較高。因此，篩選出適合本地區(qū)的具有明確診斷價值、無創(chuàng)、簡便的分子生物學標志物尤為重要。本研究通過檢測肺栓塞患者血漿miRNA-134表達水平，并與傳統(tǒng)血漿標志物D-二聚體進行診斷價值比較，探討miRNA-134在西寧地區(qū)急性肺栓塞患者診斷中的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年3～10月青海省人民醫(yī)院住院治療的西寧地區(qū)急性肺栓塞患者、慢性肺栓塞患者各20例為觀察組，并選取西寧地區(qū)門診健康體檢者20例為對照組。急性肺栓塞組患者男性14例，女性6例，慢性肺栓塞組患者男性13例，女性7例，健康對照組男性15例，女性5例，各組在性別分布(χ2=0.48，P=0.788)及年齡組成上無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)，各組間D-二聚體、肺動脈壓、氧分壓之間存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)(見表1)。

Table 1 Basic clinical data of the three ±s)

*：與健康對照組比較，P<0.05；△：與慢性肺栓塞組比較，P<0.05.

所有人群均需完善常規(guī)檢查項目：血常規(guī)、血氣、血漿D-二聚體、心電圖、心臟彩超、雙下肢血管彩超、胸片等。肺栓塞的診斷根據(jù)2001年中華醫(yī)學會呼吸病學分會《肺血栓栓塞癥的診斷與治療指南》，完成常規(guī)檢查及CT肺動脈造影明確診斷，急性肺栓塞為發(fā)病1個月以內(nèi)，慢性肺栓塞為發(fā)病超過3個月，排除原發(fā)性肺動脈高壓癥、重癥感染、惡性腫瘤、急性冠脈綜合征等重大疾病患者及精神異常不能配合者。

1.2 主要儀器及試劑

低溫超速離心機(HEMR)，ABI7500熒光實時定量PCR儀(ABI)，TRIzol RNA提取試劑盒(Invitrogen)，TIANGEN Script RT Kit(Tiangen)，2×SYBR Premix Ex Taq(ABI )。

1.3 引物序列

通過查閱相關外文文獻及反復驗證，獲取目的基因miRNA-134及內(nèi)參基因U6的引物序列，所有引物序列均由Invitrogen公司純化合成，引物終濃度及序列為，目的基因：miRNA-134-human-f(400nmol/L)：5′-ACACTCCATCTGGGTGTGACTGGTTGACCAGA-3′，miRNA-134-human-r(400nmol/L)：5′-CTCAAC GTGTCGTGGA-3′；

內(nèi)參基因：U6-human-f(400nmol/L)：5′-TAAAATCTATATACACGACGGCTTCG-3′，U6-human-r(400nmol/L)：5′-TACTGTGCGTTTAAGCACTTCGC-3′。

1.4 血漿樣本及總RNA

采集清晨空腹血4 mL置入EDTA抗凝管中，4 ℃離心提取血漿，分裝后置-80 ℃冰箱冷凍儲存，用于批量檢測；血漿總RNA提取采用TRIzol RNA提取試劑盒，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。應用紫外分光光度儀測定OD比值(A260/A280)、瓊脂糖凝膠電泳測定血漿總RNA的濃度及質(zhì)量，選取OD值介于1.8～2.0之間、濃度大于或等于2 μg/μL者，作為實驗樣品凍存。

1.5 第一鏈cDNA

將RNA模板批量在冰上解凍，所有RNA模板的濃度調(diào)整為2 μg/μL，采用FastQuant RT Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，操作嚴格按照試劑盒說明書進行，得到的cDNA用于后續(xù)熒光實時定量PCR實驗。

1.6 血漿miRNA-134表達水平

采用熒光實時定量PCR法測定血漿miRNA-134表達水平，首先制作標準曲線，以樣品cDNA原濃度為起始濃度依次稀釋，稀釋因子為2，共稀釋5個濃度。根據(jù)標準曲線優(yōu)化反應體系，使得目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率相一致。

PCR反應體系(20μL體系)：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL(Applied Biosystems)，第一鏈cDNA 1 μL，目的基因miRNA-134及內(nèi)參基因U6上、下游引物各1 μL，用滅菌雙蒸水補齊至20 μL。實驗在ABI7500熒光實時定量PCR儀中進行，每個樣品設3個重復孔，每組樣品進行1次重復。目的基因與內(nèi)參基因的PCR反應條件一致，95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，40個循環(huán)，70 ℃ 30 s，反應結(jié)束后根據(jù)獲取的循環(huán)閾值(CT值)，采用相對定量法計算2-△△CT值，分析數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 三組間miRNA-134的表達水平比較

采用Real-time PCR法檢測三組人群血漿miRNA-134的表達水平，結(jié)果顯示，急性肺栓塞組血漿miRNA-134表達水平顯著高于慢性肺栓塞組及健康對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，慢性肺栓塞組表達水平高于健康對照組(P<0.05)。(表2)

Table 2 Comparison of plasma miRNA-134 expression in three ±s)

注：*與健康對照組比較P<0.05；△與慢性肺栓塞組比較P<0.05.

2.2 miRNA-134在急性肺栓塞診斷中的價值評價

采用ROC曲線分析評判血漿miRNA-134在急性肺栓塞中的診斷價值，并與經(jīng)典血漿診斷指標D-二聚體做比較，結(jié)果顯示，miRNA-134、D-二聚體所對應的曲線下面積(AUC)分別為0.876、0.794，對急性肺栓塞診斷均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而miRNA-134的AUC更高(圖1)；ROC曲線上左上角值表示靈敏性和特異性兩者總和最大值，以該點作為診斷急性肺栓塞的最佳臨界值，確定miRNA-134和D-二聚體診斷急性肺栓塞的最佳臨界值分別為1.07、5.40 ug/mL；以最佳臨界值作為判斷標準，分別計算miRNA-134和D-二聚體診斷急性肺栓塞的靈敏度和特異度，結(jié)果顯示兩者敏感性一致，但miRNA-134的特異性優(yōu)于D-二聚體(表3)。

圖1 miRNA-134、D-二聚體診斷急性肺栓塞的ROC曲線

Figure 1 ROC curve of miRNA-134 and D-dimer for acute pulmonary embolism diagnosis

表3 miRNA-134、D-二聚體在急性肺栓塞診斷中的ROC曲線分析結(jié)果

Table 3 ROC curve of miRNA-134 and D-dimer for acute pulmonary embolism diagnosis

3 討論

本研究采用Real-time PCR法檢測西寧地區(qū)肺栓塞患者血漿miRNA-134表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性肺栓塞組血漿miRNA-134表達水平顯著高于慢性肺栓塞組及健康對照組，慢性肺栓塞組表達水平高于健康對照組；并與經(jīng)典血漿診斷指標D-二聚體做比較，miRNA-134在西寧地區(qū)急性肺栓塞患者中具有較高的診斷價值，且特異性優(yōu)于D-二聚體。

已知肺栓塞以其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率成為全球關注的焦點，其診斷方法目前主要有臨床可能性評估、實驗室輔助檢查(包括動脈血氣分析、血漿D- 二聚體檢測等)以及影像學診斷(包括胸部X 線、彩色多普勒超聲、肺動脈造影等)。上述各種診斷方法，在檢查條件、技術要求及患者配合度等方面均有較高的要求，限制了其在臨床的應用。

已知miRNA可對基因進行轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控[9-10]，在各組織、細胞及血清中表達具備特異性和穩(wěn)定性[11]，且含量穩(wěn)定，適合做生物標記。國外的一項研究發(fā)現(xiàn)[12]，急性肺栓塞患者血漿中miR-134的表達水平較正常人增高了10倍以上，可能是診斷急性肺栓塞的新的潛在血漿生物學標志物，其與我們的研究結(jié)果基本一致。認為當發(fā)生急性肺栓塞時，細胞缺血、缺氧致變性、壞死，使細胞膜通透性改變，此時肺高度特異性表達的miRNA-134以微泡形式從受損的細胞質(zhì)中釋放到外周血中。

本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-134在急性肺栓塞患者診斷中具有較高的敏感性及特異性，且特異性明顯優(yōu)于經(jīng)典肺栓塞血漿診斷指標D-二聚體，我們認為血漿miR-134的表達水平能夠區(qū)分急性肺栓塞患者、非急性肺栓塞患者及健康人群，血漿miR-134檢測可作為臨床上診斷急性肺栓塞更為理想的生物學標志物。但近期相關的研究發(fā)現(xiàn)，外周血單核細胞中miR-134在不穩(wěn)定性心絞痛及心肌梗塞患者中的表達水平明顯高于穩(wěn)定性心絞痛患者及健康人群，miR-134的表達水平與發(fā)生心力衰竭的危險因素密切相關，其可能是心肌梗死的一個潛在預測指標[13-14]。也有研究發(fā)現(xiàn)[15-16]，miR-134與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制密切相關，在鱗狀細胞癌組織中的表達水平也較正常組織升高[17]。因此，我們在診斷急性肺栓塞時需盡量排除合并有心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤等其他疾病的患者，以確保試驗結(jié)果準確可靠。

綜上所述，血漿miRNA-134具有較高的敏感性及特異性，有望成為西寧地區(qū)臨床上診斷急性肺栓塞新的預測指標，為臨床提高早期治療的可能性。但由于本研究例數(shù)較少、對照病例不夠全面，試驗復雜、技術難度大等客觀因素，仍需繼續(xù)提高試驗技能、改進試驗方法、擴大研究范圍進行更深入的研究。

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The diagnostic value of plasma MicroRNA-134 for patients with acute pulmonary embolism at Xining area※

Wang Yaping，Zhao zhen，Zhang Heng，Duo Jie*

(Respiratory Department of Qinghai Provincial People′s Hospital，Xining，810007)

Objective To discuss the clinical diagnostic value of MicroRNA-134 in patients with acute pulmonary embolism at Xining area.Methods 20cases of patients with acute pulmonary embolism，20cases of chronic pulmonary embolism and 20cases of healthy volunteers were selected in trial groups.The plasma levels of MicroRNA-134 in each group were measured by Real-time PCR，and the clinical diagnostic value of miRNA-134 for patients with acute pulmonary embolism at Xining area were evaluated by using ROC curve.Results (1) The levels of miRNA-134 in acute pulmonary embolism group were obviously higher than that of the chronic pulmonary embolism and healthy control groups，and the levels of miRNA-134 in chronic pulmonary embolism group were higher than that of the healthy control group，the differences were statistically significant(P<0.05).(2)The clinical diagnostic value of miRNA-134 for patients with acute pulmonary embolism were evaluated by using ROC curve.Compared with the levels of D-dimer，there are the same sensitivities(100%)，but the specificity of miRNA-134 was better than that of D-dimer(71.41%，66.70%，respectively).Conclusions It shows that the plasma miRNA-134 has high diagnostic value for acute pulmonary embolism，it can be used as a potential biological markers for diagnosis of acute pulmonary embolism.

Pulmonary embolism MicroRNA-134 D-dimer

R322.3

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.03.001

2016-05-07

※：青海省科學技術廳應用基礎研究計劃項目(2014-ZJ-763)；*：通訊作者，主任醫(yī)師，0971-8066256 王亞平(1982～)，女，漢族，甘肅籍，博士，主治醫(yī)師