中試規(guī)模純化海洋芽孢桿菌源脂肽類(lèi)化合物

顧康博，管成，許家慧，李淑蘭，羅遠(yuǎn)嬋，沈國(guó)敏，張道敬，李元廣

1 華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237 2 上海澤元海洋生物技術(shù)有限公司，上海 200237

海洋生物技術(shù)

中試規(guī)模純化海洋芽孢桿菌源脂肽類(lèi)化合物

顧康博1，管成1，許家慧1，李淑蘭2，羅遠(yuǎn)嬋1，沈國(guó)敏1，張道敬1，李元廣1

1 華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237 2 上海澤元海洋生物技術(shù)有限公司，上海 200237

顧康博, 管成, 許家慧, 等. 中試規(guī)模純化海洋芽孢桿菌源脂肽類(lèi)化合物. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(11): 1549-1563.

Gu KB, Guan C, Xu JH, et al. Pilot-scale purification of lipopeptide from marine-derived Bacillus marinus. Chin J Biotech, 2016, 32(11): 1549-1563.

本次研究旨在建立經(jīng)濟(jì)可行的海洋芽孢桿菌源脂肽類(lèi)化合物的中試規(guī)模純化工藝。對(duì)包括酸化沉淀、甲醇浸提、溶劑沉淀、鹽析、萃取、硅膠柱層析和HZ806大孔樹(shù)脂吸附工藝在內(nèi)的可放大的成熟單元工藝進(jìn)行反復(fù)試驗(yàn)，考察脂肽類(lèi)化合物表面活性對(duì)單元工藝的影響。嚴(yán)格遵循以高收率為前提循序漸進(jìn)逐步減少雜質(zhì)的原則，組合上述單元工藝對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行提取和純化，并最終獲得高純度脂肽樣品。新工藝可從1 t海洋芽孢桿菌Bacillus marinus B-9987的發(fā)酵液中，以百克量級(jí)的規(guī)模制備87.51%-100%純度的脂肽類(lèi)化合物樣品，收率>81.73%。本研究首次實(shí)現(xiàn)了高純度的海洋芽孢桿菌源脂肽類(lèi)化合物的百克量級(jí)制備；允許發(fā)酵生產(chǎn)階段使用天然培養(yǎng)基，緩解了脂肽中游發(fā)酵生產(chǎn)和下游大規(guī)模純化之間的矛盾；且各單元工藝規(guī)避了脂肽類(lèi)化合物水溶液的乳化起泡和不經(jīng)濟(jì)的大體積水溶液蒸發(fā)濃縮。新工藝實(shí)用可行，經(jīng)濟(jì)合理。

海洋芽孢桿菌，脂肽，中試規(guī)模純化，百克量級(jí)，放大

自Arima等[1]從枯草芽孢桿菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)脂肽類(lèi)化合物表面活性素 (Surfactin)以來(lái)，在過(guò)去的半個(gè)世紀(jì)中已有十多種不同類(lèi)型的脂肽被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[2]。脂肽類(lèi)化合物的分子結(jié)構(gòu)同時(shí)含有親水基團(tuán)和親油基團(tuán)，因此具有顯著的表面活性和生物活性[3]：由于表面活性可降低表面張力提高烴類(lèi)化合物的溶解性，脂肽類(lèi)化合物及其產(chǎn)生菌被用于清理石油和烴類(lèi)化合物所導(dǎo)致的環(huán)境污染[4-5]；脂肽類(lèi)化合物的表面活性和抗細(xì)菌活性等特點(diǎn)在化妝品行業(yè)具有潛在的應(yīng)用前景[6]；在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，脂肽類(lèi)化合物被證實(shí)具有抗真菌[7-9]、抗細(xì)菌[8,10-11]、抗癌[8,12-13]等生物活性，其中放線菌源的脂肽類(lèi)抗生素達(dá)托霉素作為萬(wàn)古霉素的替代品已于2003年在美國(guó)批準(zhǔn)上市[14]；在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，由于脂肽類(lèi)化合物具有環(huán)境友好和可降解等優(yōu)點(diǎn)[3,15]，具有開(kāi)發(fā)成農(nóng)用殺菌劑[8,16-17]、免疫誘導(dǎo)劑[18]以及殺蟲(chóng)劑[19]等綠色農(nóng)藥的潛力，也是目前可持續(xù)農(nóng)業(yè)的研究熱點(diǎn)之一[15]。

目前脂肽類(lèi)化合物的研究領(lǐng)域，主要對(duì)脂肽產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步的提取和預(yù)處理，再通過(guò)薄層色譜法 (TLC)[7-8,20]、凝膠排阻層析[9,21-22]或者高效液相色譜 (HPLC)[7,9,21]等手段，對(duì)目標(biāo)脂肽類(lèi)化合物進(jìn)行分離純化，所獲得的純化樣品往往極少，只能進(jìn)行離體試驗(yàn)[7-8,22]，或者對(duì)離體的葉片和作物等進(jìn)行規(guī)模較小的生測(cè)試驗(yàn)[9,20]，制備規(guī)模難以滿足諸如田間藥效試驗(yàn)和毒理學(xué)試驗(yàn)對(duì)純品的大量需求。脂肽產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，亟待高純度脂肽類(lèi)化合物的規(guī)模制備工藝的建立。

然而，由于脂肽類(lèi)化合物的表面活性顯著，混合物中的脂肽所表現(xiàn)出的溶解性、極性和膠束狀態(tài) (影響凝膠排阻層析和超濾的截留分子量的選擇)，會(huì)隨著樣品濃度、雜質(zhì)種類(lèi)和雜質(zhì)數(shù)量的變化而變化，對(duì)下游分離純化工藝的建立構(gòu)成嚴(yán)重的干擾。目前，脂肽類(lèi)化合物僅放線菌源的達(dá)托霉素的開(kāi)發(fā)較為成功，主要得益于該脂肽分子的電離特性，可采用離子交換法實(shí)現(xiàn)其分離純化[23-24]。而芽孢桿菌源脂肽類(lèi)化合物，比如常見(jiàn)的表面活性素、芬薺素 (Fengycin)和伊枯草菌素 (Iturin)[25]，均難以復(fù)制這個(gè)成功的先例。為了克服脂肽類(lèi)化合物表面活性對(duì)分離純化工藝的干擾，往往需要從源頭減少雜質(zhì)數(shù)量，降低下游分離純化的難度。合成培養(yǎng)基組分明確而穩(wěn)定，不易引入過(guò)多的雜質(zhì)，適合于脂肽類(lèi)化合物的分離純化研究[25-27]。得益于合成培養(yǎng)基這一優(yōu)點(diǎn)，Dhanarajan等[25]研究了大孔樹(shù)脂吸附工藝，可毫克量級(jí)制備68.3%純度伊枯草菌素、77.6%純度芬薺素和91.6%純度表面活性素；Zhang等[26]建立了絮凝-過(guò)濾工藝，可克量級(jí)制備79.5%純度表面活性素；Chen等[27]研究了超濾法制備工藝，可克量級(jí)制備83%純度表面活性素。然而，合成培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)單一，成本較高，多用于代謝研究以及疫苗生產(chǎn)，并不適用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)[28]。因此上述純化工藝的規(guī)模不過(guò)克量級(jí)和毫克量級(jí)，尚不能滿足脂肽類(lèi)化合物開(kāi)發(fā)對(duì)純化樣品較大的需求量。

本次研究，以海洋芽孢桿菌Bacillus marinus B-9987所產(chǎn)新結(jié)構(gòu)脂肽類(lèi)化合物為研究對(duì)象，建立經(jīng)濟(jì)可行的高純度脂肽類(lèi)化合物的中試規(guī)模制備工藝。該工藝不但不限制中游大規(guī)模發(fā)酵對(duì)天然培養(yǎng)基的需求，還能從發(fā)酵產(chǎn)品中高效地提取和純化目標(biāo)脂肽類(lèi)化合物，而且其中的單元工藝也需盡量規(guī)避脂肽水溶液的乳化起泡和不經(jīng)濟(jì)的大體積水溶液蒸發(fā)濃縮，保證該工藝經(jīng)濟(jì)實(shí)用，易于向其他芽孢桿菌源脂肽類(lèi)化合物的開(kāi)發(fā)領(lǐng)域推廣。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵生產(chǎn)菌、目標(biāo)脂肽類(lèi)化合物及發(fā)酵生產(chǎn)

本次研究對(duì)象為海洋芽孢桿菌B. marinus B-9987所產(chǎn)的marihysin A、maribasin A和maribasin B新結(jié)構(gòu)脂肽類(lèi)化合物[16-17,29]，統(tǒng)稱為BM脂肽類(lèi)化合物。B. marinus B-9987產(chǎn)BM脂肽類(lèi)化合物的發(fā)酵液，由上海澤元海洋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)提供。BM脂肽類(lèi)化合物的發(fā)酵生產(chǎn)采用營(yíng)養(yǎng)豐富的天然培養(yǎng)基[30]，取代文獻(xiàn)[25-27]中所報(bào)道的有利于脂肽分離純化而不利于發(fā)酵生產(chǎn)的合成培養(yǎng)基。本次發(fā)酵規(guī)模達(dá)到2.5 t發(fā)酵液/批次 (裝液系數(shù)：0.5)，BM發(fā)酵水平達(dá)到120 mg/L。

1.2 BM脂肽類(lèi)化合物定量檢測(cè)方法

采用HPLC檢測(cè)樣品中BM脂肽類(lèi)化合物的含量。液相系統(tǒng)：Waters 1525高壓液相色譜系統(tǒng)和Waters 2487紫外檢測(cè)器。液相條件：分析柱為Cosmoil 5C18-MS-Ⅱ (粒徑5 μm，規(guī)格4.6 mm×250 mm)；柱溫25 ℃；進(jìn)液量20 μL；以70%甲醇為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。根據(jù)HPLC圖譜中BM目標(biāo)化合物的峰面積之和，代入線性回歸方程Y=23 140X-17 741 (R2=0.999 7) 計(jì)算HPLC檢測(cè)樣品中BM物質(zhì)的含量。其中，Y為BM圖譜中BM目標(biāo)化合物的峰面積之和，單位μV·s；X為檢測(cè)樣品的BM含量，單位μg/mL；該回歸方程在15.62-1 000 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

基于精確的HPLC檢測(cè)方法，結(jié)合檢測(cè)樣品的濃縮/稀釋比例，計(jì)算出原待測(cè)樣品溶液中BM物質(zhì)的濃度和總量；結(jié)合干重?cái)?shù)據(jù)，確定BM物質(zhì)的純度；同理，可以測(cè)定單元工藝前后BM物質(zhì)總量的變化，計(jì)算該單元工藝的收率(得率)。

1.3 中試規(guī)模純化工藝的研究

1.3.1 中試規(guī)模純化工藝所需儀器、材料、填料及試劑

儀器為管式離心機(jī) (上海章泉離心機(jī)技術(shù)有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海青浦滬西儀器廠)、循環(huán)水式真空泵 (上海亞榮生化儀器廠)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)、層析用玻璃柱 (聚四氟乙烯活塞)、布氏漏斗；耗材及填料分別為定性濾紙 (杭州特種紙業(yè)有限公司)、硅膠 (200-300 目，上海天蓮化工科技有限公司)、HZ806、HZ807、HZ816、HZ818大孔樹(shù)脂 (上海華震科技有限公司)、XAD 7HP大孔樹(shù)脂 (美國(guó)羅門(mén)哈斯公司，Rohm & Haas)；工藝所需的試劑為濃鹽酸 (AR)、甲醇 (工業(yè)級(jí)和AR)、乙醚 (AR)、乙酸乙酯 (AR)、氯仿 (AR)、苯 (AR)、二氯甲烷 (AR)、正丁醇(AR)、無(wú)水硫酸鎂 (AR)、NaOH (AR)、硫酸銨(CP)、工業(yè)乙醇 (工業(yè)級(jí)，含量95%)。

1.3.2 單元工藝研究及中試規(guī)模純化工藝的建立

本次工藝研究，分別對(duì)酸化沉淀[9,25]、溶劑浸提[9,31]、溶劑沉淀[32]、鹽析[13,22]、萃取[20-21]、

硅膠柱層析[31,33]和大孔樹(shù)脂吸附[25]等可放大的常用單元工藝進(jìn)行比較，對(duì)不同純化階段的脂肽類(lèi)樣品進(jìn)行反復(fù)試驗(yàn)，根據(jù)各個(gè)單元工藝的特點(diǎn)加以整合，建立中試規(guī)模純化工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單元工藝的純化效果研究

BM脂肽類(lèi)化合物為胞外產(chǎn)物，B. marinus B-9987發(fā)酵液經(jīng)管式離心機(jī) (16 000 r/min) 菌液分離后，棄菌體取發(fā)酵上清液。此時(shí)，BM脂肽類(lèi)化合物在發(fā)酵上清液中的含量＜0.011%，去除水分后其在溶質(zhì)中的含量也僅為0.15%，需要后續(xù)的下游工藝進(jìn)行提取和純化。

2.1.1 酸化沉淀工藝

使用12 mol/L濃鹽酸將B. marinus B-9987發(fā)酵上清液 (BM脂肽純度為0.15%) 的pH值降至2.5-3.5之間，BM脂肽類(lèi)化合物均被完全沉淀，未發(fā)現(xiàn)類(lèi)似蛋白質(zhì)沉淀的等電點(diǎn)。然而，當(dāng)BM脂肽樣品的純度為40.01%、75.53%和87.51%時(shí) (BM脂肽水溶液的濃度同發(fā)酵上清液的120 mg/L)，酸化沉淀的收率出現(xiàn)明顯的下降，其中87.51%純度BM脂肽樣品，超過(guò)94%的BM物質(zhì)酸化后未被沉淀，這個(gè)結(jié)果與發(fā)酵上清液中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全不同，詳見(jiàn)表1。

酸化沉淀的試驗(yàn)結(jié)果表明，脂肽分子中雖然有肽環(huán)，但其分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于蛋白質(zhì)，不足以像蛋白質(zhì)一樣發(fā)生等電點(diǎn)沉淀；再者，酸化沉淀的過(guò)程，可能是酸化條件下多糖和胞外蛋白等物質(zhì)形成沉淀，并將BM脂肽類(lèi)化合物從上清液中完全轉(zhuǎn)移至沉淀中；然而，隨著脂肽類(lèi)化合物樣品純度的不斷提升，可以被酸化沉淀的雜質(zhì)也越來(lái)越少，因此酸化沉淀的效果開(kāi)始明顯下降。這也從一個(gè)方面體現(xiàn)了混合物中脂肽類(lèi)化合物理化性質(zhì)的多變。

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，酸化沉淀可用于發(fā)酵液中BM脂肽類(lèi)化合物的提取。將1 t發(fā)酵液的pH值降至2.80-3.20，僅需8 L 12 mol/L濃鹽酸，形成28 kg沉淀物 (干重)，前后體積濃縮了60-70倍，而且發(fā)酵上清液中的BM脂肽被完全轉(zhuǎn)移至沉淀中，收率為100%，純度也從0.011%提升至0.43%，明顯高于直接蒸發(fā)濃縮發(fā)酵液所獲得的0.15%含量的BM樣品，有利于后續(xù)的進(jìn)一步純化工作。但是，較高純度BM脂肽樣品的水溶液的酸化沉淀效果不佳，酸化沉淀工藝不能用于規(guī)避純化階段中后期的脂肽類(lèi)樣品水溶液的蒸發(fā)濃縮和起泡問(wèn)題。

2.1.2 甲醇浸提工藝

甲醇溶解性較好、易于濃縮、可回收再利用，且蒸發(fā)過(guò)程中不存在乳化起泡等問(wèn)題，作為提取BM脂肽的溶劑較為合適。為了提升浸提的收率，進(jìn)行了8批次的甲醇浸提，每批次采用110-120 L甲醇浸提25-28 kg的沉淀物。浸提過(guò)程中甲醇浸提的平均分配系數(shù)僅為0.11 L/kg。除加熱外，機(jī)械攪拌和超聲波促進(jìn)溶解均不能提升分配系數(shù)，可見(jiàn)BM脂肽和酸化沉淀中的甲醇不溶物有較好的親和性，不受傳質(zhì)等動(dòng)力學(xué)因素影響，這和發(fā)酵液酸化沉淀中表現(xiàn)的高收率相符合。且酸化沉淀的甲醇浸提過(guò)程先難后易，BM浸膏樣品的純度也在不斷提升，從第1、 2批次的2.22%純度和16.67%收率，上升至第3-5批次的6.45%純度和65.30%收率，及至最高的第6-8批次的9.10%純度和13.33%收率。這一現(xiàn)象對(duì)脂肽類(lèi)化合物進(jìn)一步的純化較為有利。

甲醇浸提工藝的總收率為95.30%，浸膏平均純度為4.99%。經(jīng)酸化沉淀、甲醇浸提、合并與濃縮，1 t發(fā)酵液中的BM脂肽被完全轉(zhuǎn)移至10-20 L易于濃縮不易起泡的甲醇溶液中，體積濃縮了50-100倍，便于后續(xù)單元工藝的操作。隨后的研究采用純度最低 (純化難度最高)的第1、2批次甲醇浸提的2.22%純度樣品進(jìn)行試驗(yàn)，以保證新工藝適用于不同批次的浸提樣品。

表1 酸化沉淀工藝效果Table 1 Recovery rate of acid precipitation

2.1.3 溶劑沉淀工藝

根據(jù)介電常數(shù)衡量混合溶液的極性，以5 g/L純度2.22%的BM脂肽類(lèi)化合物的甲醇溶液為試驗(yàn)對(duì)象，按照極性由低到高的順序與不同的低極性的有機(jī)溶劑快速混合，藉由溶劑極性和溶解性的顯著變化析出目標(biāo)化合物，收集沉淀并進(jìn)行比較?；旌先軇┙殡姵?shù)按照立方根相加律進(jìn)行計(jì)算[34]，試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表2。

根據(jù)表2所示結(jié)果，直接采用液固提取法效率低下。液液混合沉淀因傳質(zhì)速度快，較為合理。再者，除了介電常數(shù)，溶劑種類(lèi)對(duì)沉淀效果有明顯的影響。甲醇/乙醚以體積比1∶6混合時(shí)，其介電常數(shù)為6.4，取其沉淀進(jìn)行檢測(cè)，BM脂肽樣品的純度從2.22%提升至6.90%。而同樣體積比的甲醇/苯混合后，介電常數(shù)更低，僅為4.0，但卻沒(méi)有BM物質(zhì)被沉淀，毫無(wú)提升效果。氯仿和二氯甲烷也有類(lèi)似現(xiàn)象。此外，采用甲醇/乙酸乙酯直接沉淀BM脂肽甲醇浸提溶液也毫無(wú)效果，但是用于沉淀甲醇/乙醚沉淀樣品的甲醇溶液卻有明顯效果，純度從6.90%升至9.08%。甲醇/甲酸甲酯沉淀時(shí)也有類(lèi)似現(xiàn)象。

由此得出結(jié)論：沉淀溶劑的選擇不僅要考慮極性，還要考慮溶劑的種類(lèi)；在確定溶劑種類(lèi)的情況下，以逐步提升極性漸進(jìn)除雜的方式進(jìn)行，才能獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果。

溶劑沉淀法可應(yīng)用于酸化沉淀和甲醇浸提之后，先濃縮甲醇溶液至相對(duì)較小的體積以減少沉淀溶劑用量。BM脂肽甲醇溶液的濃度在5-20 g/L之間均有效，但要避免過(guò)度濃縮導(dǎo)致甲醇溶液過(guò)于黏稠，不利于分散、傳質(zhì)和沉淀。然后將6倍體積的乙醚溶劑快速傾倒和沖散甲醇溶液，并形成沉淀；之后抽濾收集沉淀、甲醇溶解、濃縮、6倍體積乙酸乙酯沉淀、抽濾收集沉淀。樣品純度從2.22%提升至9.08%，收率為99.80%。甲酸甲酯因其較高的成本和較大的毒性不予采用。溶劑沉淀法作為酸化沉淀和甲醇浸提之后，精制步驟之前提升樣品純度和質(zhì)量的預(yù)處理工藝，簡(jiǎn)單、快速、有效，期間所用溶劑均可回收再利用。

表2 溶劑沉淀法試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of solvent precipitation test

表3 鹽析試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Recovery rate of salting out

2.1.4 鹽析工藝

選擇工業(yè)應(yīng)用中常用的硫酸銨進(jìn)行鹽析試驗(yàn)[35]。配制120 mg/L純度分別為0.15%、40.01%、75.53%和87.51%的BM脂肽的水溶液 (試驗(yàn)對(duì)象同2.1.1)，按照243、390和561 g/L的添加量，使硫酸銨的飽和度分別達(dá)到40%、60%和80% (室溫，25 ℃)。不同于酸化沉淀，硫酸銨鹽析工藝不受樣品純度的影響，可以在飽和度40%-80%之間將BM脂肽類(lèi)化合物完全從水溶液中析出并沉淀。結(jié)果詳見(jiàn)表3。

但是經(jīng)由鹽析法獲得的BM脂肽類(lèi)化合物的沉淀物，會(huì)被難揮發(fā)的硫酸銨嚴(yán)重污染，結(jié)合脂肽類(lèi)化合物的表面活性，很難采用有機(jī)溶劑浸提的方法使脂肽與硫酸銨簡(jiǎn)單分開(kāi)，需要后續(xù)步驟進(jìn)行分離和處理 (2.1.6硅膠柱層析及2.1.7大孔樹(shù)脂吸附工藝)。此外，雖然工業(yè)級(jí)硫酸銨價(jià)格低廉，但要使1 t發(fā)酵液的飽和度提升至40%仍需使用243 kg硫酸銨，而且發(fā)酵液的體積有所上升，增加了后續(xù)處理的難度，經(jīng)濟(jì)性遠(yuǎn)不及酸化沉淀。

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，鹽析法可在BM脂肽類(lèi)化合物純度>40%的純化過(guò)程中間階段，從水溶液中高效提取BM脂肽類(lèi)化合物。此時(shí)酸化沉淀法無(wú)法有效地將BM脂肽類(lèi)化合物從水溶液中分離和提取，而水溶液的處理量遠(yuǎn)小于發(fā)酵液體積，于是硫酸銨鹽析法較為經(jīng)濟(jì)可行，并規(guī)避了易于起泡且耗時(shí)耗能的水溶液蒸發(fā)濃縮。但鹽析法需要后續(xù)步驟除去硫酸銨污染物，因此在BM脂肽純化階段后期，慎用鹽析法。

2.1.5 萃取工藝

萃取工藝試驗(yàn)中，極性較低的溶劑，如乙酸乙酯和二氯甲烷，均不能萃取BM脂肽，而正丁醇萃取BM脂肽的分配系數(shù)僅為1.20，同體積正丁醇需要萃取3次才能保證收率>90%。而當(dāng)BM脂肽的水溶液濃度大于1.0 g/L時(shí)，正丁醇和水呈現(xiàn)互溶的情況而無(wú)法分層和萃取。如直接稀釋BM脂肽的水溶液 (BM濃度＜300 mg/L) 進(jìn)行正丁醇萃取，減壓蒸發(fā)正丁醇的工作量較大。因此使用正丁醇直接萃取BM脂肽類(lèi)化合物，并不可行。

在實(shí)際生產(chǎn)中，萃取法多與鹽析法相結(jié)合，從水溶液中完全提取BM脂肽。在處理含有有機(jī)溶劑的BM脂肽的水溶液時(shí)，如2.1.7中含有BM脂肽的50%乙醇洗脫液，其中的乙醇經(jīng)減壓蒸發(fā)回收之后仍難以完全除盡，此時(shí)使用鹽析法，會(huì)在液面析出較薄的“乙醇油層”，BM脂肽沉淀析出后完全溶解于該油層之中，無(wú)法通過(guò)離心和過(guò)濾獲得，且該油層體積小而粘度大，直接使用分液漏斗收集油層，操作過(guò)程中的物料損失難以避免。此時(shí)添加正丁醇使油層變厚、粘度變低，操作大為簡(jiǎn)便，再經(jīng)分液漏斗收集及多次正丁醇萃取與洗滌器皿，獲得鹽析沉淀物的正丁醇溶液，如此鹽析法經(jīng)由萃取工藝變得可行，BM脂肽的收率可達(dá)100%，且此時(shí)正丁醇用量較少，其不易起泡的特性便于蒸發(fā)和濃縮。但由于脂肽的表面活性，正丁醇萃取劑中會(huì)含有大量水分和硫酸銨，因此依靠萃取法分離脂肽和硫酸銨污染物 (詳見(jiàn)2.1.4) 并不可行。

2.1.6 硅膠柱層析工藝

硅膠柱層析是常用的精制工藝。受到表面活性的干擾，脂肽類(lèi)化合物、填料、試劑和雜質(zhì)之間相互的選擇性和分子間作用力較為復(fù)雜，難以明確。因此，硅膠填料和流動(dòng)相溶劑的選擇，需從具有代表性的候選材料中進(jìn)行篩選。硅膠柱填料選擇分離純化效果較好的200-300目硅膠。溶劑選擇方面，Snyder[36]根據(jù)質(zhì)子受體參數(shù)、質(zhì)子給予參數(shù)和強(qiáng)偶極參數(shù)的比例，將常用的80多種溶劑分成9個(gè)大類(lèi)：Ⅰ-Ⅴ、Ⅵa、Ⅵb、Ⅶ和Ⅷ。洗脫劑選擇常用的甲醇 (Ⅱ)，排除成本較高毒性過(guò)大的乙腈 (Ⅲ)和四氫呋喃(Ⅵb)。而稀釋洗脫劑所用的底劑，則選擇5種不同類(lèi)別的代表性溶劑進(jìn)行試驗(yàn)和篩選：氯仿(Ⅷ)、二氯甲烷 (Ⅴ)、乙酸乙酯 (Ⅵa)、乙醚 (Ⅰ)和苯 (Ⅶ)。并且，比較不同純化階段的BM脂肽樣品對(duì)硅膠柱層析和流動(dòng)相選擇的影響，建立可行的硅膠柱層析單元工藝。

硅膠柱層析試驗(yàn)的結(jié)果表明：硅膠柱無(wú)論使用何種流動(dòng)相均不能使2.22%純度的甲醇浸提樣品的純度有所提升，試驗(yàn)中的硅膠填料無(wú)法吸附脂肽樣品致使BM脂肽被過(guò)早洗脫，因此從脂肽樣品中除去部分低極性雜質(zhì)的溶劑沉淀法的預(yù)處理步驟是必要的；但當(dāng)樣品純度有所提升，如經(jīng)過(guò)溶劑沉淀處理的9.08%純度的樣品，甲醇/乙酸乙酯 (Ⅱ/Ⅵa) 和甲醇/乙醚 (Ⅱ/Ⅰ)流動(dòng)相可有效提升BM脂肽樣品的純度至20.86%和20.92%，而氯仿 (Ⅷ)、二氯甲烷 (Ⅴ)和苯 (Ⅶ) 仍不能有效提升樣品純度，該結(jié)果和2.1.3溶劑沉淀法的試驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似；當(dāng)原料的純度提升至40%之后，各類(lèi)底劑均可有效提升脂肽類(lèi)化合物的純度至70%，如之前無(wú)效的氯仿(Ⅷ)、二氯甲烷 (Ⅴ) 和苯 (Ⅶ)，在50%-70%梯度之間可完全洗脫BM脂肽類(lèi)化合物，并將樣品純度分別提升至75.53%、75.49%和70.43%，且純化效果優(yōu)于或相當(dāng)于乙酸乙酯 (Ⅵa) 的69.68%，但遜色于乙醚 (Ⅰ) 的78.36%。硅膠柱層析工藝的試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表4。

結(jié)合2.1.3溶劑沉淀工藝中沉淀劑的篩選結(jié)果和2.1.6硅膠柱層析工藝中底劑的篩選結(jié)果，可得出初步結(jié)論：使用有機(jī)溶劑處理BM脂肽樣品，在甲醇 (Ⅱ) 作為BM脂肽主要溶解試劑和洗脫劑的前提下，Ⅰ類(lèi)和Ⅵa類(lèi)試劑適合于提升粗提物的純度；而Ⅰ類(lèi)、Ⅴ類(lèi)和Ⅷ類(lèi)試劑適合于純化階段中后期進(jìn)一步提升脂肽類(lèi)化合物的純度。Ⅶ類(lèi)試劑效果不佳，而Ⅲ類(lèi)、Ⅳ類(lèi)和Ⅵb類(lèi)中的大多數(shù)常用試劑極性較大，不適合作為底劑，而作為溶解試劑和洗脫劑，經(jīng)濟(jì)性和實(shí)用性均不及甲醇 (Ⅱ)。

乙醚 (Ⅰ) 是所用試驗(yàn)溶劑中純化效果最好的底劑，但因沸點(diǎn)過(guò)低、易于揮發(fā)和爆炸性等問(wèn)題而不能實(shí)際應(yīng)用；二氯甲烷 (Ⅴ) 因其過(guò)低的沸點(diǎn)以及過(guò)于易揮發(fā)的缺點(diǎn)，實(shí)際應(yīng)用和溶劑回收較為困難；苯 (Ⅶ) 的效果不佳，而且考慮到毒性不予應(yīng)用。

表4 硅膠柱層析效果Table 4 Purification effect of silica gel column chromatography

綜合上述結(jié)果和因素，硅膠柱層析工藝可用于BM脂肽類(lèi)化合物預(yù)處理之后的精制工作，處理9.08%純度的有機(jī)溶劑沉淀樣品時(shí)，按2.4 g BM/kg硅膠填料的處理能力裝柱，甲醇/乙酸乙酯為流動(dòng)相，在35%-80%梯度之間洗脫全部BM脂肽，提升BM脂肽的純度至20.86%，收率96.30%；純化40.01%純度的大孔樹(shù)脂處理樣品時(shí)，使用甲醇/氯仿流動(dòng)相，按7.2 g BM/kg硅膠填料的處理能力裝柱，在50%-70%梯度之間洗脫全部BM脂肽，BM脂肽的純度提升至75.53%，收率95.50%。

2.1.7 大孔樹(shù)脂吸附工藝

近年來(lái)大孔樹(shù)脂在工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域有較快的發(fā)展，有多種不同骨架種類(lèi)的大孔樹(shù)脂填料可供選擇[35]。本次研究選擇極性相對(duì)較低而且較為常用的聚苯乙烯-二乙烯苯骨架大孔樹(shù)脂和聚甲基丙烯酸酯骨架大孔樹(shù)脂作為研究對(duì)象，使用BM脂肽的硅膠柱純化樣品 (純度20.86%)，對(duì)包括XAD 7HP、HZ806、HZ807、HZ816和HZ818在內(nèi)的5種大孔樹(shù)脂的吸附能力、解吸能力和穩(wěn)定性進(jìn)行比較，流動(dòng)相為乙醇/水。聚甲基丙烯酸酯骨架的XAD 7HP、HZ806和HZ807具有良好的吸附能力、解吸能力以及穩(wěn)定性，優(yōu)于聚苯乙烯-二乙烯苯骨架的HZ816和HZ818 (圖1)。結(jié)合成本因素，本次工藝選擇的填料為HZ806大孔樹(shù)脂。

脂肽的水溶液在濃縮時(shí)存在乳化和起泡問(wèn)題，因此要盡量減小大孔樹(shù)脂吸附處理之后水溶液的體積。HZ806大孔樹(shù)脂處理不同純化階段的BM脂肽樣品的工藝均表現(xiàn)一致：純水上樣、25%乙醇除雜，及50%乙醇洗脫BM脂肽。50%乙醇完全洗脫BM脂肽需要4.0 BV (床層體積) 的流動(dòng)相，而開(kāi)始的0.9 BV的“死體積”流動(dòng)相中未檢測(cè)出BM脂肽類(lèi)化合物，其后的3.1 BV的50%乙醇流動(dòng)相洗脫全部的BM脂肽，因此有1.55 BV的水分需要后續(xù)處理。由此可知，大孔樹(shù)脂單位床層體積的吸附量越大，同樣1.55 BV水分中所含的BM脂肽就越多，則單位數(shù)量的BM脂肽所產(chǎn)生的水分就越少，后續(xù)處理就越容易。

HZ806大孔樹(shù)脂處理不同純度BM脂肽樣品的結(jié)果詳見(jiàn)圖2。當(dāng)BM脂肽樣品純度僅為2.22%時(shí) (酸化沉淀的甲醇浸膏)，雖然大孔樹(shù)脂將樣品的純度提升至17.50%，但吸附能力僅為0.33 g BM/L床層體積，后續(xù)需要處理的水分高達(dá)4.70 L/g BM，不利于生產(chǎn)；而當(dāng)BM脂肽樣品純度上升至20.86%時(shí) (硅膠柱處理樣品)，大孔樹(shù)脂處理效果有了顯著改善，純度上升至40.01%，吸附能力上升至4.58 g BM/L床層體積，所需處理的水分減少至0.34 L/g BM，減壓蒸發(fā)回收大部分乙醇之后，將2.1.4鹽析法和2.1.5萃取法相結(jié)合，規(guī)避脂肽水溶液的蒸發(fā)濃縮和起泡問(wèn)題的同時(shí)提取BM脂肽，收率96.02% (污染樣品的硫酸銨由后續(xù)硅膠柱層析和大孔樹(shù)脂吸附法去除)；而當(dāng)樣品純度上升至75.53%時(shí) (第二次硅膠柱處理的樣品)，大孔樹(shù)脂吸附法可將樣品純度提升至87.51%，吸附能力高達(dá)12.1 g BM/L床層體積，所需處理的水分僅為0.13 L/g BM，收率97.31%。

最后0.13 L/g BM的水溶液，可使用HZ806大孔樹(shù)脂再次吸附樣品，使用水溶液上樣，再用95%工業(yè)乙醇洗脫BM脂肽，乙醇洗脫階段棄去先流出的0.9 BV的水溶液，再收集2.0 BV乙醇即可，對(duì)乙醇的減壓濃縮過(guò)程可回避BM脂肽水溶液的起泡問(wèn)題；如水溶液體積較小，也可以與正丁醇混合，正丁醇能抑制起泡，且與水共沸方便減壓濃縮；如連續(xù)生產(chǎn)過(guò)程中，也可以保證BM脂肽不被降解的前提下，使用電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱60 ℃緩慢烘干，也無(wú)乳化起泡問(wèn)題。通過(guò)上述方法，在獲得最終純化樣品的同時(shí)，完全規(guī)避脂肽水溶液的蒸發(fā)濃縮過(guò)程中嚴(yán)重的乳化起泡等問(wèn)題。

圖1 大孔樹(shù)脂吸附能力、解吸能力和穩(wěn)定性比較Fig. 1 Absorption capacities, desorption ratios and reproducibilities of macroporous absorption resins.

圖2 HZ806大孔樹(shù)脂吸附工藝的吸附能力、待處理水溶液體積和純化效果Fig. 2 Absorption capacities, water evaporation volumes, and purification effects of different BM samples treated with HZ806 macroporous absorption resin.

2.2 單元工藝的組合及中試規(guī)模純化工藝的建立

以保持目標(biāo)脂肽類(lèi)化合物高收率為前提，嚴(yán)格履行循序漸進(jìn)減少雜質(zhì)的原則方針，選擇成熟的可放大單元工藝進(jìn)行研究和組合 (詳見(jiàn)2.1)，并最終建立一套經(jīng)濟(jì)、實(shí)用，可放大的海洋芽孢桿菌源脂肽類(lèi)化合物的中試規(guī)模純化工藝。工藝流程詳見(jiàn)圖3。

圖3 BM脂肽類(lèi)化合物中試規(guī)模純化工藝Fig. 3 Production process for pilot-scale purification of BM series lipopeptides.

圖3所示的BM脂肽類(lèi)化合物中試規(guī)模純化工藝流程，其中的數(shù)據(jù)為處理原料純度最低的第1、2批次甲醇浸提的2.22%純度樣品的過(guò)程數(shù)據(jù)，最終獲得純度87.51%的脂肽樣品 (樣品的HPLC檢測(cè)圖譜詳見(jiàn)圖4)，總收率81.73%；如采用第3-5批次的甲醇浸提樣品，其純度優(yōu)于之前第1、2批次的樣品，該批次樣品經(jīng)中試規(guī)模純化工藝處理后的純度達(dá)到100% (樣品的HPLC檢測(cè)圖譜詳見(jiàn)圖5)；至第6-8批次，雖然浸提量?jī)H占總數(shù)的13.33%，但在硅膠柱第二次處理階段即已形成純品，且由于步驟減少，總收率也有一定的提升，為83.99%。

新工藝可從1 t海洋芽孢桿菌B. marinus B-9987的發(fā)酵液 (BM發(fā)酵水平120 mg/L)中提取并制備87.51%-100%純度的脂肽類(lèi)化合物樣品 (平均純度97.57%)，收率>81.73% (平均82.04%)，產(chǎn)量為百克量級(jí) (純化樣品干重100.90 g，BM凈含量98.45 g)。

圖4 87.51%純度的BM脂肽樣品的HPLC檢測(cè)圖譜Fig. 4 HPLC spectrum of BM series lipopeptides with 87.51% purity.

圖5 100%純度的BM脂肽樣品的HPLC檢測(cè)圖譜Fig. 5 HPLC spectrum of BM series lipopeptides with 100% purity.

3 討論

本次研究，首次實(shí)現(xiàn)了高純度海洋芽孢桿菌源脂肽類(lèi)化合物的百克量級(jí)的中試規(guī)模制備，可滿足樣品純度和數(shù)量要求較高的研究項(xiàng)目，如農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)[37]。無(wú)論是百克量級(jí)制備規(guī)模還是97.57%的平均樣品純度，均高于目前文獻(xiàn)所報(bào)道的最高水平：絮凝-過(guò)濾工藝的克量級(jí)制備79.5%純度表面活性素[26]，超濾法的克量級(jí)制備83%純度表面活性素[27]，以及大孔樹(shù)脂吸附法的毫克量級(jí)制備68.3%純度伊枯草菌素、77.6%純度芬薺素和91.6%純度表面活性素[25]。

新工藝采取循序漸進(jìn)去除雜質(zhì)的穩(wěn)健路線，對(duì)原料要求較低，允許天然培養(yǎng)基應(yīng)用于中游大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，且不影響后續(xù)中游發(fā)酵的優(yōu)化等研究，解決了芽孢桿菌源脂肽類(lèi)化合物中游發(fā)酵生產(chǎn)和下游大規(guī)模純化之間的矛盾，具有實(shí)際應(yīng)用和生產(chǎn)價(jià)值。而且工藝過(guò)程中規(guī)避不經(jīng)濟(jì)的大體積水溶液蒸發(fā)濃縮，解決了脂肽類(lèi)化合物水溶液濃縮過(guò)程中的乳化起泡的難題，具有更好的實(shí)用性，易于向其他芽孢桿菌源脂肽類(lèi)化合物的開(kāi)發(fā)領(lǐng)域推廣。

雜質(zhì)的多寡對(duì)脂肽類(lèi)化合物下游純化的難易有很大的影響。選擇發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，排除諸如玉米漿、花生餅粉、菜籽餅粉等農(nóng)副產(chǎn)品原料，選擇基于農(nóng)副產(chǎn)品為原材料精制加工后的天然培養(yǎng)基，如蛋白胨和酵母提取物，并與組分明確的合成培養(yǎng)基組成復(fù)合培養(yǎng)基。這類(lèi)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)較寡營(yíng)養(yǎng)的合成培養(yǎng)基更為豐富，而且雜質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量都明顯少于粗糙的農(nóng)副產(chǎn)品原料。此外，可對(duì)有益于脂肽合成的微量金屬離子進(jìn)行篩選[38-39]，提高脂肽產(chǎn)量同時(shí)對(duì)雜質(zhì)數(shù)量的影響相對(duì)較小，更有利于下游工藝的純化效果。

再者，2.2中同一批次培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)品的不同批次甲醇浸提樣品，由于雜質(zhì)數(shù)量和種類(lèi)的不同，最終的純化效果也會(huì)有較大的差異。2.1.6中未經(jīng)有機(jī)溶劑沉淀法去除油性雜質(zhì) (較低極性的雜質(zhì)) 的2.22%純度的第1、2批次甲醇浸提樣品，不能被硅膠填料所吸附，是BM脂肽與油性雜質(zhì)親和性較好的體現(xiàn)。因而油性雜質(zhì)的分離較為困難，是BM脂肽分離純化最大的難點(diǎn)，經(jīng)過(guò)多個(gè)單元工藝的分離純化仍然難以完全除盡。2.1.2中甲醇浸提時(shí)的平均分配系數(shù)僅為0.11 L/kg，是脂肽與酸化沉淀中的甲醇不溶物具有親和性的表現(xiàn)。然而，油性雜質(zhì)和酸化沉淀中的甲醇不溶物之間并無(wú)親和性。這就意味著需要大量甲醇浸提多次才能從酸化沉淀中的甲醇不溶物中浸提出全部BM，而只要少量甲醇浸提1-2次即可將酸化沉淀中的油性雜質(zhì)溶解去除。利用BM脂肽和這兩類(lèi)雜質(zhì)彼此親和性不同的特點(diǎn)，通過(guò)第1、2批次甲醇浸提，以16.67%的BM脂肽被浸提的代價(jià)，將酸化沉淀中的油性雜質(zhì)浸提、溶解并除去，此時(shí)浸提樣品的餾分呈現(xiàn)油膏狀。之后甲醇浸提酸化沉淀中其余83.33%的BM脂肽時(shí)，不利于脂肽分離純化的油性雜質(zhì)明顯減少，因此第3批次之后的甲醇浸提濃縮后的餾分為“干燥”的固體物，且第1、2批次甲醇浸提也溶解并去除了大量的其他雜質(zhì)，因此第3-8批次甲醇浸提物的純度也明顯高于第1、2批次甲醇浸提物。這是同樣純化工藝，第1、2批次甲醇浸提的原料可獲得87.51%純度樣品，而第3-8批次甲醇浸提的原料能夠最終制成100%純度樣品的重要原因。酸化沉淀中的甲醇不溶物與BM脂肽的親和性，對(duì)于甲醇浸提較為不利，但是對(duì)BM脂肽的純化卻非常有利。

如未來(lái)連續(xù)發(fā)酵技術(shù)突破瓶頸，在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中獲得廣泛應(yīng)用，并且適用于脂肽類(lèi)化合物的發(fā)酵生產(chǎn)，則高成本寡營(yíng)養(yǎng)但外源雜質(zhì)較少的合成培養(yǎng)基將變得相對(duì)經(jīng)濟(jì)可行，為可放大的絮凝-過(guò)濾工藝、超濾法和大孔樹(shù)脂吸附工藝[25-27]提供足夠的脂肽原料，規(guī)模制備脂肽類(lèi)化合物純化樣品的工藝將變得更為簡(jiǎn)單而高效。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

March 29, 2016; Accepted: September 12, 2016

Pilot-scale purification of lipopeptide from marine-derived Bacillus marinus

Kangbo Gu1, Cheng Guan1, Jiahui Xu1, Shulan Li2, Yuanchan Luo1, Guomin Shen1, Daojing Zhang1, and Yuanguang Li1
1 State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China 2 Shanghai Zeyuan Marine Biotechnology Co. Ltd., Shanghai 200237, China

This research was aimed at establishing the pilot-scale purification technology of lipopeptide from marine-derived Bacillus marinus. We studied lipopeptide surfactivity interferences on scale-up unit technologies including acid precipitation, methanol extraction, solvent precipitation, salting out, extraction, silica gel column chromatography and HZ806 macroporous absorption resin column chromatography. Then, the unit technologies were combined in a certain order, to remove the impurities gradually, and to gain purified lipopeptide finally, with high recovery rate throughout the whole process. The novel pilot-scale purification technology could effectively isolate and purify lipopeptide with 87.51% to 100% purity in hectograms from 1 ton of Bacillus marinus B-9987 fermentation broth with more than 81.73% recovery rate. The first practical hectogram production of highly purified lipopeptide derived from Bacillus marinus was achieved. With this new purification method, using complex media became possible in fermentation process to reduce the fermentation cost and scale-up the purification for lipopeptide production. For practicability and economy, foaming problem resulting from massive water evaporation was avoided in this technology.

Bacillus marinus, lipopeptide, pilot-scale purification, hectogram, scale-up

Supported by: Key Technologies Research and Development Program of China (No. 2011BAE06B04-16).

s: Yuanguang Li. Tel/Fax: +86-21-64250964; E-mail: ygli@ecust.edu.cn

Daojing Zhang. Tel/Fax: +86-21-64252104; E-mail: djz@ecust.edu.cn

國(guó)家科技支撐計(jì)劃 (No. 2011BAE06B04-16) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-09-26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160926.1420.001.html