82種中草藥對(duì)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌的抑菌活性研究

梁志凌，馬艷平，馬江耀，郝 樂(lè)，劉振興，柯 浩

（ 廣東省農(nóng)科院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/ 廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

82種中草藥對(duì)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌的抑菌活性研究

梁志凌，馬艷平，馬江耀，郝 樂(lè)，劉振興，柯 浩

（ 廣東省農(nóng)科院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/ 廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

采用瓊脂擴(kuò)散法的牛津杯法，測(cè)定82種中草藥水提物對(duì)羅非魚(yú)（Tilapia sp.）無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）的體外抑菌活性，并采用紙片法選擇幾種活性較強(qiáng)的中草藥水提物對(duì)無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，黃連、五倍子、紅藤、大蒜、北五味子、夏枯草、艾葉、蘇木、三棵針、紫蘇、土槿皮、老鶴草、石榴皮、大黃、丹參、魚(yú)腥草、虎杖、赤芍、車(chē)前草、田基黃20種中草藥水提物對(duì)無(wú)乳鏈球菌表現(xiàn)出明顯的體外抑菌活性，其中黃連、五倍子的體外抑菌效果最顯著；中草藥聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，五倍子與大黃、艾葉、丹參、蘇木、北五味子、紅藤、石榴皮、虎杖、黃連表現(xiàn)為協(xié)同作用；黃連與大黃、丹參、蘇木、紅藤表現(xiàn)為協(xié)同作用，與艾葉、北五味子、石榴皮表現(xiàn)為拮抗作用；三棵針與大黃、丹參、蘇木、紅藤、石榴皮、黃連、夏枯草、五倍子表現(xiàn)為協(xié)同作用，與艾葉、北五味子、虎杖表現(xiàn)為拮抗作用。

中草藥；羅非魚(yú)；無(wú)乳鏈球菌；聯(lián)合藥敏試驗(yàn)；抑菌活性

羅非魚(yú)是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦的養(yǎng)殖品種，被世界各地廣泛引種與養(yǎng)殖［1］。我國(guó)的環(huán)境和氣候條件適合羅非魚(yú)生產(chǎn)，這些有利條件使我國(guó)成為羅非魚(yú)養(yǎng)殖的主要國(guó)家之一［2］，羅非魚(yú)養(yǎng)殖已成為我國(guó)南方地區(qū)的支柱性產(chǎn)業(yè)［3］，我國(guó)也成為世界上最大的羅非魚(yú)生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)。近年來(lái)隨著羅非魚(yú)的養(yǎng)殖密度增大、養(yǎng)殖環(huán)境惡化，病害頻發(fā)成為制約我國(guó)羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素，其中無(wú)乳鏈球菌引起的細(xì)菌性疾病近年有加劇趨勢(shì)，已成為羅非魚(yú)的重要病原，對(duì)羅非魚(yú)養(yǎng)殖造成重大損失［3］。鏈球菌可利用宿主巨噬細(xì)胞逃避抗生素類(lèi)藥物對(duì)其殺害［4］，長(zhǎng)期使用抗生素藥物導(dǎo)致現(xiàn)有羅非魚(yú)源病原菌分離株對(duì)許多允許使用的抗生素耐藥性增強(qiáng)，導(dǎo)致利用抗生素防治鏈球菌病的效果不太理想，造成羅非魚(yú)細(xì)菌病的治療困難，此外考慮到食品安全及環(huán)境保護(hù)問(wèn)題，臨床上迫切需要尋找綠色安全有效的抗生素替代品以減少抗生素使用，最終實(shí)現(xiàn)有效防治羅非魚(yú)細(xì)菌病的目標(biāo)。中草藥是純天然的藥物，具有多功能多靶點(diǎn)作用、不易引起病菌耐藥性以及無(wú)藥物殘留等優(yōu)點(diǎn)，目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害防控的應(yīng)用中越來(lái)越受到重視。本研究分析了黃連、五倍子、紅藤等82種中草藥水提物對(duì)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌的體外抑菌作用，以期為鏈球菌病害的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃連、五倍子、紅藤等82種中草藥由廣州市萬(wàn)怡大藥房提供。

無(wú)乳鏈球菌為廣東省農(nóng)科院動(dòng)物衛(wèi)生研究所從廣東省廣州市增城市某羅非魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)患病羅非魚(yú)中分離、鑒定并保存。

THB培養(yǎng)基：酵母浸出物3 g/L，胰蛋白胨20 g/L，牛肉浸膏5 g/L，葡萄糖2 g/L，Na2CO32.5 g/L，NaCl 2 g/L，Na2HPO40.4 g/L，瓊脂粉15 g/L，pH7.2～7.4。THB液體培養(yǎng)基：THB培養(yǎng)基不加瓊脂粉。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 中草藥水提液的制備 稱(chēng)取中草藥50 g，加純水約500 mL浸泡1 h后置于加熱板上溫火煮沸1 h，12層紗布過(guò)濾；如上反復(fù)煎煮3次，收集濾液。濾液用濾紙過(guò)濾后濃縮成含生藥1 g/mL的提取液，于121℃滅菌 15 min，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。大蒜提取液制備?］：取市售大蒜去皮搗碎，加入適量蒸餾水，擠壓過(guò)濾，制成含生蒜1 g/mL的大蒜提取液。

1.2.2 病原菌菌懸液的制備 將無(wú)乳鏈球菌菌株在THB培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng)24 h，用THB液體培養(yǎng)基沖洗，在28℃條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)20 h，稀釋為5×107cfu/mL的菌懸液，備用。

1.2.3 抑菌活性的測(cè)定 采用瓊脂擴(kuò)散法的牛津杯法［6］，取直徑90 mm，高16～17 mm的玻璃培養(yǎng)皿，注入加熱融化的THB培養(yǎng)基20 mL，使其在碟底均勻攤布，置于水平臺(tái)面上使其凝固，制成THB培養(yǎng)基平板備用。吸取0.1 mL菌懸液，置于THB培養(yǎng)基并涂布均勻。在每個(gè)平板以等距離均勻放置牛津杯3個(gè)。吸取中藥藥液0.3 mL注入牛津杯內(nèi)，將加滿(mǎn)藥液的平板置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑大小，每種藥液在不同平板上重復(fù)3次，取其平均值；另以無(wú)菌水作為空白對(duì)照。以抑菌圈直徑表示抑菌活性，抑菌圈直徑≥15 mm表示抑菌活性較強(qiáng)，＜15 mm表示抑菌活性較弱。

1.2.4 中草藥水提物聯(lián)合藥敏試驗(yàn)［7］于培養(yǎng)皿內(nèi)加入預(yù)熱融化的THB培養(yǎng)基，均勻攤布，置于水平臺(tái)面上使其凝固，制成THB培養(yǎng)基平板備用。吸取0.1 mL菌懸液，置于THB平板培養(yǎng)基并涂布均勻。將兩種含中藥紙片貼于平板上，兩片之間相距以2～3 mm為宜，置于28℃孵育過(guò)夜，取出觀察結(jié)果。根據(jù)呈現(xiàn)的抑菌圖形，結(jié)果判定“協(xié)同”、“相加”、“無(wú)關(guān)”或者“拮抗”作用。本次分別以五倍子、黃連、三棵針為主藥，測(cè)定主藥與其他中藥對(duì)無(wú)乳鏈球菌的聯(lián)合藥敏。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥水提物的體外抑菌活性

82種中草藥水提物對(duì)無(wú)乳鏈球菌的體外抑菌活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可見(jiàn)，黃連、五倍子、大蒜、北五味子、夏枯草、艾葉、蘇木、三棵針、紫蘇、土槿皮、石榴皮、老鶴草、魚(yú)腥草、虎杖、赤芍和車(chē)前草等16種中草藥水提物對(duì)無(wú)乳鏈球菌的抑菌圈達(dá)到15 mm以上，有較強(qiáng)的體外抑菌活性，其抑菌活性由強(qiáng)至弱順序?yàn)辄S連＞五倍子＞大蒜＞北五味子＞夏枯草、艾葉＞蘇木＞三棵針、紫蘇、土槿皮＞石榴皮、老鶴草＞魚(yú)腥草＞虎杖、赤芍、車(chē)前草，其中黃連、五倍子的體外抑菌效果尤為顯著，抑菌圈達(dá)到35 mm以上；田基黃、香薷、桑寄生、馬齒莧、厚樸、山豆根和敗醬草等7種中草藥水提物對(duì)無(wú)乳鏈球菌產(chǎn)生抑菌圈，但抑菌圈直徑小于15 mm，呈微弱的抑菌活性；其余中草藥水提物對(duì)無(wú)乳鏈球菌沒(méi)有呈現(xiàn)抑菌圈，無(wú)抑菌活性。

2.2 中草藥水提物聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

采用瓊脂擴(kuò)散紙片法選擇幾種活性較強(qiáng)的中草藥水提物對(duì)無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。根據(jù)呈現(xiàn)的抑菌圖形，瓊脂擴(kuò)散紙片法一般出現(xiàn)協(xié)同作用、相加作用、無(wú)關(guān)作用和拮抗作用4種結(jié)果。協(xié)同作用有3種情況：（1）甲、乙兩藥均有抑菌活性，兩者又能聯(lián)合增效，抑菌圈交界角平直；（2）甲藥無(wú)抑菌活性，乙藥的抑菌圈向甲藥擴(kuò)大；（3）甲、乙兩藥均無(wú)抑菌活性，但兩藥之間出現(xiàn)抑菌區(qū)域。本試驗(yàn)為第1種情況。相加作用甲、乙兩藥的抑菌圈相連，交界角呈現(xiàn)鈍圓形。無(wú)關(guān)作用也有3種情況：（1）甲、乙兩藥均無(wú)抑菌活性，無(wú)抑菌圈；（2）甲藥無(wú)抑菌活性，乙藥有抑菌活性，圖形表現(xiàn)為甲藥無(wú)抑菌圈，乙藥呈現(xiàn)完整抑菌圈；（3）甲、乙兩藥均有抑菌活性，兩藥抑菌圈交角處呈尖銳形狀。本試驗(yàn)為第3種情況。拮抗作用有2種情況：（1）甲藥無(wú)抑菌活性，乙藥有抑菌活性，甲藥對(duì)乙藥抑菌圈呈切割形狀；（2）甲、乙兩藥均有抑菌活性，兩藥抑菌圈向相反方向偏移。本試驗(yàn)為第2種情況。

試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，五倍子與大黃、艾葉、丹參、蘇木、北五味子、紅藤、石榴皮、黃連、虎杖表現(xiàn)為協(xié)同作用；黃連與大黃、紅藤、蘇木、丹參表現(xiàn)為協(xié)同作用，與石榴皮、艾葉、北五味子表現(xiàn)為拮抗作用；三棵針與大黃、丹參、蘇木、紅藤、石榴皮、黃連、夏枯草、五倍子表現(xiàn)為協(xié)同作用，與艾葉、北五味子、虎杖表現(xiàn)為拮抗作用。

3 結(jié)論與討論

由于中藥藥液的抑菌活性較弱，紙片吸載的中藥量過(guò)少，抑菌圈往往太小，難以達(dá)到測(cè)量要求，因此一般較少采用紙片法。本試驗(yàn)選用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行試驗(yàn)，牛津杯內(nèi)加滿(mǎn)藥液可以保證充分滲透，試驗(yàn)結(jié)果抑菌圈相對(duì)大些。此外，某些中草藥水提液含有膠質(zhì)，造成不同的藥液粘度不同，導(dǎo)致加入牛津杯里的藥液在瓊脂培養(yǎng)基上的擴(kuò)散速度有差異，在一定程度上影響抑菌圈的大小。本試驗(yàn)供試藥液均采用中藥傳統(tǒng)的煎煮法提取，這一方法適用于有效成分能溶于水，且對(duì)濕、熱均穩(wěn)定的藥材。這一方法提取的成分比較復(fù)雜，除有效成分外，提取液往往含雜質(zhì)較多，且有少量脂溶性物質(zhì)溶出；另外某些不溶于水的成分含量低，高溫煎煮也致使揮發(fā)性物質(zhì)丟失，因此可能導(dǎo)致藥液中有效成分損失較多、有效成分提取不完全等問(wèn)題［8］，對(duì)中藥的抑菌試驗(yàn)結(jié)果有一定影響。

本研究對(duì)82種中草藥的抗無(wú)乳鏈球菌活性進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分中草藥對(duì)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌具有明顯的體外抑制活性，其中黃連、五倍子表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制活性。黃連的抗菌成分主要是黃連堿，五倍子含有大量鞣質(zhì)，可以與生物體的蛋白質(zhì)、核酸、多糖及生物堿結(jié)合產(chǎn)生沉淀作用，影響細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)和代謝，從而表現(xiàn)出顯著的抗菌作用［9］。大蒜中的大蒜素能與巰基酶競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制菌體代謝酶的活性，通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化等作用損傷菌體的膜系統(tǒng)，影響菌體生長(zhǎng)的大環(huán)境［10］。北五味子的主要有效成分為木脂素類(lèi)化合物，具有抗菌、抗氧化等功效［11］。夏枯草水提物含有豐富的三萜類(lèi)、甾體類(lèi)、黃酮類(lèi)等化學(xué)成分，有一定的抑菌作用［12］。三棵針主要通過(guò)喹啉類(lèi)生物堿如黃連素發(fā)揮抗菌作用［13］。石榴皮含有石榴皮多酚，是發(fā)揮抗菌作用的主要成分［14］。魚(yú)腥草多種成分亦具有抗菌作用，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)相符［15］。其他中草藥的有效成分和作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

表1 82種中草藥水提物對(duì)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌的抑菌活性

（續(xù)表1）

表2 中草藥水提物對(duì)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

考慮到組方的需要，本研究選取五倍子、黃連、三棵針、大黃、艾葉、丹參、蘇木、北五味子、紅藤、石榴皮、虎杖和夏枯草等12種中草藥進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，五倍子與大黃、艾葉、丹參、蘇木、北五味子、紅藤、石榴皮、黃連、虎杖均表現(xiàn)為協(xié)同作用。三棵針與大黃、丹參、蘇木、紅藤、石榴皮、黃連、夏枯草、五倍子也表現(xiàn)為協(xié)同作用，作為復(fù)方中藥制劑組方的基礎(chǔ)，這為漁藥開(kāi)發(fā)綠色安全有效抗生素替代品提供了一定的參考。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Antimicrobial activities of 82 kinds of Chinese herbal medicines against the pathogen of Streptococcus from tilapia in vitro

LIANG Zhi-ling，MA Yan-ping，MA Jiang-yao，HAO Le，LIU Zhen-xing，KE hao
（ Animal Health Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/ Guangdong Open Laboratory of Veterinary Public Health/Guangdong Provincial Key Laboratory of Livestock Disease Prevention，Guangzhou 510640，China）

The antimicrobial activities of 82 Chinese herb aqueous extracts against the pathogen of Streptococcus from tilapia in vitro were screened by the agar Oxford plate diffusion system. Results demonstrated that 20 kinds of Chinese herbs could effectively inhibit the growth of S. agalactiae，Coptis chinensis and Galla chinensis had the best inhibitory effects. In the combined susceptibility test，disc agar diffusion was used to evaluate the combination effects of 12 Chinese herb aqueous extracts in vitro against the pathogen of Streptococcus from tilapia. The results showed that there was synergic effect for the combined inhibition of aqueous extracts from Galla chinensis and Rheum palmatum L. or Artemisia argyi Levl. et Vant. or Salvia miltiorrhiza or Caesalpinia sappan or Schisandra chinensis or Sargentodoxa cuneata or Punica granatum L. or Reynoutria japonica Houtt or Coptis chinensis ；synergic effect for Coptis chinensis and Rheum palmatum L. or Salvia miltiorrhiza or Caesalpinia sappan or Sargentodoxa cuneata；synergic effect for Berberis spp. and Rheum palmatum L. or Salvia miltiorrhiza or Caesalpinia sappan or Sargentodoxa cuneata or Punica

Chinese herbal medicine；Tilapia sp.；Streptococcus agalactiae；combined susceptibility test；antimicrobial activities

S948

A

1004-874X（2016）10-0128-06

2016-06-20

廣東省魚(yú)病防治專(zhuān)項(xiàng)（2014010701）；廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專(zhuān)項(xiàng)（A201601B04）

梁志凌（1970-），女，獸醫(yī)師，E-mail：snailt@126.com

柯浩（1965-），男，碩士，研究員，E-mail：keha@tom.com

梁志凌 ，馬艷平，馬江耀，等. 82種中草藥對(duì)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌的抑菌活性研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（10）：128-133.

granatum L. or Coptis chinensis or Prunella vulgaris Linn or Schisandra chinensis. But the effect of combination of aqueous extracts was inhibitory interaction between Coptis chinensis and Artemisia argyi Levl. et Vant. or Schisandra chinensis or Punica granatum L.，inhibitory interaction between Berberis spp. and Artemisia argyi Levl. et Vant. or Schisandra chinensis or Reynoutria japonica Houtt. Combination of Galla chinensis and Prunella vulgaris Linn or Berberis spp.，Coptis chinensis and Reynoutria japonica Houtt or Prunella vulgaris Linn or Galla chinensis or Berberis spp. showed indifferent interactions.