SGT1正調(diào)控橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病性

戎 偉，梅雙雙

（1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南 海口 570228；2.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院，海南 ?？?570228）

SGT1正調(diào)控橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病性

戎 偉1，梅雙雙2

（1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南 ?？?570228；2.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院，海南 海口 570228）

通過在擬南芥野生型Col-0和突變體sgt1b、eds1上接種橡膠樹白粉菌Oidium heveae HN1106，分析了白粉菌細(xì)胞進(jìn)入率、葉片發(fā)病癥狀、菌絲生長狀態(tài)、細(xì)胞死亡和活性氧產(chǎn)生等表型。結(jié)果表明，與野生型Col-0相比，橡膠樹白粉菌在擬南芥sgt1b上激發(fā)的早期抗病性、后期抗病性以及抗病反應(yīng)部分降低，暗示著SGT1在穩(wěn)定識別橡膠樹白粉菌的抗性蛋白方面發(fā)揮著非常重要的作用。

橡膠樹白粉菌；擬南芥；SGT1；抗病性

SGT1 （Suppressor of G-Two Allele of Skp1）是與著絲粒裝配和蛋白泛素化有關(guān)的基因，最早在酵母中被發(fā)現(xiàn)［4］，在模式植物擬南芥和煙草以及大麥等許多植物中都有發(fā)現(xiàn)，且大多數(shù)植物包括SGT1a和 SGT1b兩個基因。通過在煙草或擬南芥中進(jìn)行基因沉默、突變和過表達(dá)等試驗表明，SGT1與植物抗性基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)密切相關(guān)［5-11］。SGT1基因沉默或突變會導(dǎo)致一些抗性基因表達(dá)下調(diào)以及介導(dǎo)的抗性反應(yīng)消失［6］。反之，SGT1基因超表達(dá)會增強植株的抗病能力［8］。最近研究發(fā)現(xiàn)，SGT1、RAR1作為HSP90的分子伴侶蛋白，三者在植物體內(nèi)相互作用，對R蛋白的積累與穩(wěn)定性具有重要作用［12-13］。

作為HSP90的伴侶蛋白，RAR1參與了橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病性［3］，但SGT1是否具有RAR1相同的功能目前仍然未知。由于sgt1a和 sgt1b雙突變體擬南芥是致死的表型，因此本研究選擇了sgt1b單突變體，通過在擬南芥野生型Col-0、突變體sgt1b和eds1上接種橡膠樹白粉菌Oidium heveae HN1106，進(jìn)行了白粉菌細(xì)胞進(jìn)入率、菌絲生長抗性、葉片發(fā)病癥狀、細(xì)胞死亡、活性氧產(chǎn)生及致病相關(guān)基因PR1 （Pathogenesis-related gene 1）表達(dá)等表型分析，發(fā)現(xiàn)SGT1b 參與了橡膠樹白粉菌激活的抗病性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物材料：橡膠樹73397，擬南芥野生型Col-0，擬南芥突變體eds1［14］，擬南芥突變體sgt1b［15］。

供試菌株：橡膠樹白粉菌Oidium heveae HN1106［3］。

1.2 試驗方法

1.2.1 SGT1基因參與擬南芥對橡膠樹白粉菌的早期抗性分析 （1）白粉菌細(xì)胞進(jìn)入率計算：利用接種箱接種橡膠樹白粉菌，接種1 d后，剪取葉片置于脫色液（乙醇 20 mL，苯酚 10 mL，H2O 10 mL，乳酸 10 mL）中脫色過夜。將葉片于染色液（考馬斯亮藍(lán) G250，0.6% 乙醇溶液）中染色30 s，顯微鏡觀察，計數(shù)擬南芥葉片上含有1根芽管和2根芽管的白粉菌孢子數(shù)目［3］，計算白粉菌細(xì)胞進(jìn)入率。

（2）菌絲生長長度分析：接種橡膠樹白粉菌2 d后，剪取葉片置于脫色液中脫色過夜。將葉片于考馬斯亮藍(lán)染色液中染色30 s，顯微鏡觀察，利用MIE 3.1軟件分析菌絲生長長度［3］。

1.2.2 SGT1基因參與擬南芥對橡膠樹白粉菌的后期抗性分析 （1）葉片發(fā)病癥狀觀察：接種橡膠樹白粉菌10 d后，觀察葉片發(fā)病癥狀，拍照。

（2）菌絲生長狀態(tài)觀察：接種橡膠樹白粉菌10 d后，剪取葉片置于脫色液中脫色過夜。將葉片在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色30 s，顯微鏡觀察菌絲生長狀態(tài)。

1.2.3 SGT1基因參與橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病反應(yīng)分析 （1）葉片細(xì)胞死亡觀察：接種橡膠樹白粉菌10 d后，剪取葉片置于Trypan blue染色液（乙醇20 mL，苯酚10 mL，H2O 10 mL，乳酸溶液10 mL，Trypan blue 10 mg）中，染色100℃ 2 min后倒掉染料，加入脫色液（水合三氯乙醛12.5 g，H2O 10 mL）脫色過夜。顯微鏡下觀察細(xì)胞死亡狀態(tài)［16］。

（2）活性氧產(chǎn)生觀察：接種橡膠樹白粉菌10 d后，剪取葉片置于DAB染液（1 mg/mL二氨基聯(lián)苯胺，pH 3.8）染色12 h，清水洗去多余染料，置于95%乙醇脫色過夜。顯微鏡下觀察活性氧產(chǎn)生情況［17］。

（3）擬南芥RNA提取和PR1基因表達(dá)檢測：剪取葉片置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮，反復(fù)研磨3次。加入1 mL Invitrogen Trizol溶液，隨后加入200 μL三氯甲烷抽提蛋白。經(jīng)異丙醇沉淀后，加入DEPC H2O 50 μL。DNA酶37℃消化1 h，氯仿抽提，無水乙醇沉淀，DEPC H2O溶解備用。利用Invitrogen RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒II進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。Real-time PCR反應(yīng)體系：

SYBR?Premix Ex TaqⅡ 10 μL，20 μmol/L PCR Forward Primer 0.2 μL，20 μmol/L PCR Reverse Primer 0.2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板5 μL，ddH2O 4.2 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性 95℃ 30 s；變性95℃5 s、退火延伸62℃ 40 s，40個循環(huán)［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 SGT1基因參與擬南芥對橡膠樹白粉菌的早期抗性分析

圖1 擬南芥對橡膠樹白粉菌的細(xì)胞進(jìn)入抗性和菌絲生長抗性部分依賴于SGT1基因

為了檢測SGT1基因是否參與了擬南芥對橡膠樹白粉菌的早期抗性，分析了橡膠樹白粉菌在擬南芥上的細(xì)胞進(jìn)入率與菌絲生長長度。接種1 d后，結(jié)果表明，sgt1b突變體的白粉菌細(xì)胞進(jìn)入率顯著高于野生型Col-0（圖1A），但低于eds1突變體白粉菌細(xì)胞進(jìn)入率。接種2 d后發(fā)現(xiàn)，野生型Col-0菌絲長度為50 μm左右，sgt1b突變體菌絲長度為130 μm左右，是野生型植物的2倍多，差異達(dá)極顯著，eds1突變體菌絲長度為230 μm左右（圖1B）。綜上結(jié)果表明，SGT1基因參與了擬南芥對橡膠樹白粉菌的早期抗性。

2.2 SGT1基因參與擬南芥對橡膠樹白粉菌的后期抗性分析

為了檢測SGT1基因是否參與了擬南芥對橡膠樹白粉菌的后期抗性，我們對葉片發(fā)黃表型和菌絲生長狀態(tài)進(jìn)行觀察。對野生型植物Col-0、突變體sgt1b和突變體eds1接種橡膠樹白粉菌10 d后，發(fā)現(xiàn)橡膠樹白粉菌在野生型植物上出現(xiàn)明顯的發(fā)黃表型，eds1突變體上表現(xiàn)出典型的白粉病病斑，但在sgt1b突變體上幾乎不能看到發(fā)黃的表型（圖2A，封三），說明橡膠樹白粉菌在擬南芥突變體sgt1b上不激活發(fā)黃的表型。進(jìn)一步利用考馬斯亮藍(lán)染色的方法觀察菌絲的生長狀況。顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，野生型植物沒有形成菌絲網(wǎng)絡(luò)，在擬南芥eds1突變體上形成大量濃密的菌絲網(wǎng)絡(luò)，sgt1b突變體表現(xiàn)出稀疏的菌絲網(wǎng)絡(luò)（圖2B，封三）。綜上結(jié)果表明，SGT1基因參與了擬南芥對橡膠樹白粉菌的后期抗性。

2.3 SGT1基因參與橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病反應(yīng)分析

為了進(jìn)一步確定SGT1基因是否參與橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病反應(yīng)，我們在擬南芥上檢測了細(xì)胞死亡、活性氧產(chǎn)生以及PR1基因表達(dá)。接種橡膠樹白粉菌10 d后，通過Trypan blue染色，與野生型植物相比，發(fā)現(xiàn)橡膠樹白粉菌在sgt1b突變體上激活的細(xì)胞死亡明顯減少（圖3A，封三）。通過DAB染色，發(fā)現(xiàn)sgt1b和eds1突變體上的活性氧產(chǎn)生與野生型植物相比大大降低（圖3B，封三）。熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果表明，橡膠樹白粉菌在sgt1b突變體上激發(fā)的PR1基因表達(dá)也顯著下降（圖3C，封三）。綜上結(jié)果表明，SGT1基因參與橡膠樹

白粉菌在擬南芥上激活的抗病反應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

在植物與病原菌相互作用的過程中，植物利用自身的抗性蛋白可以識別病原菌從而激活抗病反應(yīng)，以達(dá)到抵御病原菌的侵染。在植物抗性蛋白介導(dǎo)的信號通路中，SGT1、RAR1與HSP90三者相互作用，在穩(wěn)定抗性蛋白方面發(fā)揮重要作用［8］。但SGT1與RAR1在不同的抗性蛋白介導(dǎo)的抗病反應(yīng)中，發(fā)揮的功能可能并不相同。例如，馬鈴薯晚疫病的抗性基因RB只需要SGT1，但不需要RAR1。因此，SGT1是否像RAR1參與橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病性，目前仍然未知［19］。本研究結(jié)果表明，橡膠樹白粉菌在sgt1b突變體上激發(fā)的早期抗病性、后期抗病性以及各種抗病反應(yīng)部分降低，說明SGT1在穩(wěn)定識別橡膠樹白粉菌的抗性蛋白上也發(fā)揮著重要功能。然而，識別橡膠樹白粉菌的TIR-NB-LRR類抗病基因是什么還需要進(jìn)一步研究鑒定。

值得注意的是，橡膠樹白粉菌并不能在sgt1b上形成分生孢子，意味著橡膠樹白粉菌不能在sgt1b上完成生活世代，這可能是由于識別橡膠樹白粉菌的抗性蛋白不只1個，而是多個抗性蛋白共同發(fā)揮作用，但SGT1可能只對其中的某個（些）蛋白的穩(wěn)定性發(fā)揮功能。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Positive regulation effect of SGT1 on disease resistance triggered by Oidium heveae in Arabidopsis

RONG Wei1，MEI Shuang-shuang2
（1.College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228，China；2.College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，China）

Oidium heveae is an obligate biotrophic pathogen which infects Hevea brasiliensis and causes powdery mildew disease of rubber trees. It has been reported that O. heveae HN1106 triggers the hypersensitive response in a manner that depends on the effector-triggered immunity proteins EDS1，PAD4，and RAR1 in the model plant Arabidopsis thaliana. As co-chaperones of HSP90，Arabidopsis RAR1 and SGT1 are required to stabilize some R proteins. However，it is still unknown whether SGT1 is involved in O. heveae triggered disease resistance in Arabidopsis. In this study，WT Col-0，sgt1b and eds1 mutants were inoculated with O. heveae HN1106，and the phenotypes of O. heveae cell entry ratio，plant disease symptoms，cell death，ROS production and O. heveae HN1106 hyphal growth were analyzed. These results indicated that SGT1 was required for O. heveae HN1106-triggered early stage and late stage disease resistance and defense responses.

Oidium heveae；Arabidopsis；SGT1；disease resistance

Q945.8

A

1004-874X（2016）10-0112-05

2016-07-12

國家自然科學(xué)基金（31560296）

戎偉（1978-），男，博士，講師，E-mail：rongwei13@126.com

梅雙雙（1975-），女，博士，講師，E-mail：mssrw2002@126.com

戎偉， 梅雙雙. SGT1正調(diào)控橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病性［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（10）：112-116.

橡膠樹白粉菌（Oidium heveae）是一種專性活體寄生真菌，主要侵染橡膠樹的嫩葉、嫩芽和花序，使橡膠樹產(chǎn)生白粉病，對天然橡膠的產(chǎn)量造成極大影響［1-2］。目前學(xué)者對橡膠樹和橡膠樹白粉菌二者的遺傳背景不甚了解，難以進(jìn)行遺傳操作，對兩者的互作機制了解非常少。最新研究發(fā)現(xiàn)，橡膠樹白粉菌在模式植物擬南芥上激活抗病反應(yīng)，該抗病反應(yīng)依賴于EDS1 （Enhanced Disease Susceptibility 1）、PAD4（Phytoalexin Deficient 4） 和RAR1 （Required for Mla12 Resistance） ，表明擬南芥Toll-Interleukin1 Receptor （TIR）-nucleotide binding （NB）-

leucine-rich repeat （LRR） 類抗病基因參與了橡膠樹白粉菌激活的抗病性［3］。 擬南芥遺傳背景清晰，因此，橡膠樹白粉菌與擬南芥的相互作用為將來研究橡膠樹白粉菌的致病機理提供了很好的模型。