細胞核內(nèi)β-連環(huán)素表達水平在胃癌中的臨床研究

高振武，翟彌彌，焦 鑫，張國友，葛 亮，王 玉，王圣剛

細胞核內(nèi)β-連環(huán)素表達水平在胃癌中的臨床研究

高振武1，翟彌彌2，焦 鑫3，張國友3，葛 亮3，王 玉1，王圣剛3

目的：探討細胞核內(nèi)β-連環(huán)素表達水平與胃癌臨床病理因素的關(guān)系。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測77例胃癌組織及30例癌旁組織細胞核中β-連環(huán)素表達水平，分析其與腫瘤組織浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度、臨床分期的關(guān)系。以無病生存時間（DFS）和總生存時間(OS)為評價指標(biāo)，探討β-連環(huán)素與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系；ROC曲線衡量β-連環(huán)素在評估胃癌患者預(yù)后中的價值。結(jié)果：胃癌腫瘤組織細胞核內(nèi)β-連環(huán)素的表達水平與年齡、性別無關(guān)（P＞0.05），與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、TNM分期以及腫瘤的分化程度有關(guān)。Kaplan-Meier生存曲線顯示：腫瘤組織細胞核內(nèi)β-連環(huán)素陰性表達者DFS(26月)和OS(38月)優(yōu)于陽性表達者DFS（18月）和OS（24月）（P＜0.05）；COX多因素分析:細胞核內(nèi)β-連環(huán)素的表達可以作為胃癌患者OS獨立預(yù)后因素（HR=0.87，95%CI：0.54～2.34，P=0.03）；ROC曲線顯示，β-連環(huán)素在評估胃癌患者預(yù)后中具有中等價值（曲線下面積為0.82）。結(jié)論:胃癌組織細胞核內(nèi)β-連環(huán)素表達水平與胃癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度呈正相關(guān)性，與腫瘤的分化程度呈負相關(guān)性，可能是胃癌患者預(yù)后較差的標(biāo)志物。

β-連環(huán)素；胃癌；免疫組化；預(yù)后；細胞核

胃癌在我國的發(fā)病率逐年增高，在所有惡性腫瘤中的發(fā)病率和死亡率排名第一[1]。由于其高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率，術(shù)后輔助化療在其整個治療系統(tǒng)中具有重要的地位[2-4]。β-連環(huán)素是具有介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞黏附的多功能蛋白，作為Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路樞紐中的重要組成部分，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用[5]。國內(nèi)和國外[6]學(xué)者對β-連環(huán)素和腫瘤之間的關(guān)系進行了研究，大多數(shù)學(xué)者認為β-連環(huán)素與腫瘤的發(fā)生呈正相關(guān)。本研究利用免疫組化SP法檢測胃癌組織細胞核內(nèi)β-連環(huán)素的表達水平，研究胃癌患者細胞核內(nèi)β-連環(huán)素的表達水平與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取經(jīng)濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2008年1月―2010年1月病理檢查確診胃癌(取自病理科存檔蠟塊)77例標(biāo)本和30例癌旁組織。77例均行遠端胃癌根治術(shù)，術(shù)前未經(jīng)放療、化療。術(shù)后Ⅱ、Ⅲ期患者均經(jīng)過6個周期的化療（奧沙利鉑、替吉奧）。男50例，女27例；年齡 42～76歲（平均59.1歲）。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例。按組織學(xué)分級分組，低分化16例，中分化17例，高分化44例。按NCCN（2015年）指南TNM分期系統(tǒng)行分期，Ⅰ期28例，Ⅱ期25例，Ⅲ期24例。

1.2 試劑及儀器設(shè)備 β-連環(huán)素鼠抗人多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，二抗Sunpoly-HⅡ聚合物檢測試劑盒購自上海太陽生物技術(shù)有限公司，SP免疫組化試劑盒、ZLI-9032濃縮型DAB顯色試劑盒、DAB顯色增強劑均購自北京中杉生物科技有限公司，山羊血清購自天津市灝洋生物制品科技有限公司。倒置顯微鏡（日本Olympus公司），Image-Pro Plus圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司），Dh-cg300圖像分析系統(tǒng)（中國大恒集團有限公司）。

1.3 檢測方法 免疫組織化學(xué)SP法檢測β-連環(huán)素在胃癌組織細胞核中的表達。將病理組織標(biāo)本的石蠟塊連續(xù)切片，脫臘處理，在0.01 mol/L的枸櫞酸鹽緩沖溶液中高溫高壓進行抗原修復(fù)。按SP三步法免疫組化染色試劑盒說明書提供的實驗步驟進行操作。

1.4 結(jié)果判定 免疫組化產(chǎn)物陽性呈淺黃色-棕褐色細顆粒狀，半定量方法判定并進行評分。每例切片隨機觀察8個高倍視野（×400），每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞所占的百分比。按陽性細胞所占的百分比評分：0分為陽性細胞數(shù)＜5%，1分為陽性細胞5%～24%，2分為陽性細胞25%～49%，3分為陽性細胞50%～74%，4分為陽性細胞≥75%。按染色強度評分：0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。兩項相加后分為4級，0～1分為﹙－﹚，2分為﹙＋﹚，3～4分為﹙＋＋﹚，＞5分為﹙＋＋＋﹚，﹙＋～＋＋＋﹚均為陽性[7]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組樣本率的比較采用獨立樣本2×2列聯(lián)表資料的χ2檢驗，多個獨立樣本率的比較采用獨立樣本R×C列聯(lián)表資料的χ2檢驗。采用Ka?plan-Meier生存曲線進行生存分析評價，Log rank檢驗進行生存率的比較。影響生存期的相關(guān)因素分析采用COX多因素回歸分析法。ROC曲線進行準(zhǔn)確性檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-連環(huán)素在胃癌組織細胞核內(nèi)的表達 β-連環(huán)素在胃癌組織細胞核中表達豐富，呈棕黃色至棕褐色表達，癌旁組織細胞核內(nèi)表達水平較少（P＜0.001）。見表1。胃癌組織細胞核內(nèi)β-連環(huán)素的表達水平與患者的年齡、性別無關(guān)（P＞0.05），與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、浸潤深度、分化程度有關(guān)（P＜0.05）。見表2。胃癌的分期越晚，分化程度越低，細胞核內(nèi)β-連環(huán)素的表達水平越高。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者胃癌組織中β-連環(huán)素的表達水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。T3、T4期胃癌患者β-連環(huán)素的表達水平明顯高于T1、T2期。見圖1。

2.2 胃癌組織細胞核內(nèi)β-連環(huán)素的表達與預(yù)后的關(guān)系 對77例患者進行隨訪，總體生存時間（OS）從手術(shù)開始到死亡或隨訪結(jié)束，無病生存時間（DFS）從手術(shù)開始到出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，隨訪時間為50個月。Kaplan-Meier生存曲線顯示，β-連環(huán)素陽性表達的胃癌患者的中位生存時間為26月，陰性表達者中位生存時間為18月，Log rank檢驗提示組織細胞核內(nèi)β-連環(huán)素陰性表達者(38月)的OS優(yōu)于陽性表達者(24月)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。COX單因素回歸分析結(jié)果顯示：胃癌患者的性別、年齡與術(shù)后DFS（P值分別為0.48、0.69）和OS（P值分別為0.80、0.54）無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；腫瘤的浸潤深度、組織分化與胃癌患者術(shù)后DFS（P值分別為＜0.05、＜0.05、0.001）和OS（P值分別為＜0.05、＜0.05、0.003）相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。COX多因素回歸分析結(jié)果顯示：β-連環(huán)素陽性表達與DFS無關(guān)（HR=0.56，95%CI：0.45～3.12，P=0.06），不能作為胃癌患者的獨立預(yù)后因素，β-連環(huán)素陽性表達與OS相關(guān)（HR=0.87，95%CI：0.54～2.34，P=0.03），可能是胃癌患者的獨立預(yù)后因素。見圖2、3。

表1 胃癌組織和癌旁組織細胞核內(nèi)β-連環(huán)素表達水平

表2 細胞核內(nèi)β-連環(huán)素的表達水平與胃癌臨床病理因素的關(guān)系

圖1 細胞核內(nèi)β-連環(huán)素表達

圖2 細胞核內(nèi)β-連環(huán)素表達與無病生存率的關(guān)系

圖3 細胞核內(nèi)β-連環(huán)素表達與總生存率的關(guān)系

2.3 胃癌組織細胞核內(nèi)β-連環(huán)素的表達在評估預(yù)后中的價值 評估β-連環(huán)素在預(yù)測胃癌患者預(yù)后中的價值曲線如圖4，ROC曲線下面積為0.82。提示其在評估胃癌患者預(yù)后中具有中等價值。靈敏度為78.2%，特異度為81.6%，最優(yōu)截斷值為β-連環(huán)素的陽性表達大于5分。

圖4 ROC曲線評估β-連環(huán)素在胃癌患者預(yù)后中的價值

3 討論

郭康等[8]發(fā)現(xiàn)，β-連環(huán)素是WNT信號通路中的一個重要因子。WNT是腫瘤干細胞分化的重要信號通路，β-連環(huán)素表達異常可使腫瘤細胞黏附功能喪失，導(dǎo)致腫瘤細胞易于浸潤和轉(zhuǎn)移。WNT信號通路異常激活會導(dǎo)致β-連環(huán)素在細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)異常表達，激活細胞核中的基因，使細胞分裂增殖發(fā)生異常，最后發(fā)生癌變。Francis等[9]研究了β-連環(huán)素與前列腺癌的關(guān)系，提出β-連環(huán)素的超表達促進了前列腺癌的發(fā)生。Kim等[10]人的研究指出，β-連環(huán)素是Wnt信號通路中關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子，細胞核內(nèi)積累的β-連環(huán)素是激活致癌靶基因的關(guān)鍵一步。

Thakur等[11]的研究也提出，β-連環(huán)素在腫瘤的發(fā)生過程中起到促進作用。Ghahharia等[12]人的研究提出了β-連環(huán)素增加了腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。本研究中，β-連環(huán)素胃癌組織中的陽性表達率為66.2%，高于癌旁正常組織的26.7%。與上述的研究有同樣的結(jié)果。楊聚鵬等[13]人的研究與我們的研究結(jié)果相似，β-連環(huán)素胃癌中的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，并具有統(tǒng)計學(xué)意義。β-連環(huán)素表達水平與胃癌患者性別、性別無關(guān)，與分期TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移浸潤有關(guān)。表明隨著腫瘤浸潤深度，細胞核內(nèi)β-連環(huán)素陽性表達率增高。β-連環(huán)素表達陽性胃癌患者的DFS明顯低于陰性表達者。本研究發(fā)現(xiàn)，高分化胃癌、中分化胃癌、低分化胃癌中β-連環(huán)素陽性表達率分別為54.5%、70.6%、93.8%。提示隨著腫瘤分化程度的提高,細胞核內(nèi)β-連環(huán)素陽性表達率逐漸下降。此外，細胞核內(nèi)β-連環(huán)素的表達與胃癌淋巴結(jié)分期有關(guān)，隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的增加，其β-連環(huán)素的陽性表達率增加。表明β-連環(huán)素促進腫瘤通過淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移。淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移是胃癌患者不良預(yù)后的因素，淋巴結(jié)浸潤是腫瘤惡性程度高的一種臨床表現(xiàn)。Qin等[14]通過敲除胃癌細胞抑癌基因FRZB后發(fā)現(xiàn)，β-連環(huán)素的表達水平升高，增強了腫瘤的侵襲性。研究結(jié)果與我們的相同。隨著β-連環(huán)素的表達增加，腫瘤的侵襲性增強。

本研究利用免疫組化SP方法檢測癌旁組織和胃癌組織細胞核內(nèi)β-連環(huán)素的表達水平，研究組織細胞核內(nèi)β-連環(huán)素的表達水平與胃癌患者DFS的關(guān)系，胃癌預(yù)后是我們研究的重點。研究中發(fā)現(xiàn)，Kaplan-Meier生存曲線示，細胞核內(nèi)β-連環(huán)素陽性表達者的DFS明顯低于陰性表達者。COX多因素分析提示，細胞核內(nèi)β-連環(huán)素陽性表達是胃癌患者的獨立預(yù)后因素。并用ROC曲線檢測β-連環(huán)素在評估胃癌患者預(yù)后中具有中等價值，可作為胃癌患者預(yù)后不良的標(biāo)志物。綜上所述，細胞核內(nèi)β-連環(huán)素的表達水平增高和胃癌發(fā)生密切相關(guān)，β-連環(huán)素可能會成為一種腫瘤監(jiān)測蛋白，為臨床上判斷胃癌患者的預(yù)后提供依據(jù)。

目前大量腫瘤標(biāo)志物已用于臨床的診療，如甲胎蛋白[15]主要是在肝癌患者中高表達，CA199[16]在胰腺癌中高表達，但是沒有一種特異性高的腫瘤標(biāo)志物來指導(dǎo)胃癌的治療和預(yù)后，β-連環(huán)素有可能成為一種特殊的腫瘤標(biāo)志物指導(dǎo)胃癌的治療和預(yù)防。我們的研究發(fā)現(xiàn)，細胞核內(nèi)β-連環(huán)素的高表達預(yù)示胃癌患者預(yù)后不良，但需要多中心、大樣本數(shù)據(jù)的證實。

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（收稿：2015-12-26 修回：2016-06-26）

（責(zé)任編輯 李 勇 屈振亮）

統(tǒng)計學(xué)方法記述要求

統(tǒng)計學(xué)符號一律按GB 3358-1982《統(tǒng)計學(xué)名詞及符號》的有關(guān)規(guī)定，采用斜體排印。常用的符號有：(1)樣本的算術(shù)平均數(shù)(中位數(shù)仍用M)，(2)標(biāo)準(zhǔn)差用s，(3)標(biāo)準(zhǔn)誤用sx，(4)t檢驗用t，(5)F檢驗用F，(6)卡方檢驗用希文小寫χ2，(7)相關(guān)系數(shù)用r，(8)自由度用希文小寫υ，(9)概率用P。對于定量資料，應(yīng)根據(jù)所采用的設(shè)計類型、資料特點和分析目的，選用合適的統(tǒng)計學(xué)分析方法，不應(yīng)盲目套用t檢驗和單因素方差分析；對于定性資料，應(yīng)根據(jù)所采用的設(shè)計類型、定性變量的性質(zhì)和頻數(shù)所具備的條件及分析目的，選用合適的統(tǒng)計學(xué)分析方法，不應(yīng)盲目套用χ2檢驗。對于回歸分析，應(yīng)結(jié)合專業(yè)知識和散布圖，選用合適的回歸類型，不應(yīng)盲目套用簡單直線回歸分析；對具有重復(fù)實驗數(shù)據(jù)檢驗回歸分析資料，不應(yīng)簡單化處理；對于多因素、多指標(biāo)資料，要在一元分析的基礎(chǔ)上，盡可能運用多元統(tǒng)計分析方法，以便對因素之間的交互作用和多指標(biāo)之間的內(nèi)在聯(lián)系做出全面、合理的解釋和評價。統(tǒng)計學(xué)方法的記述不能籠統(tǒng)記錄為SPSS或SAS軟件，而應(yīng)寫明所用統(tǒng)計學(xué)方法的具體名稱，如：成組設(shè)計資料均數(shù)比較的t檢驗、兩因素析因設(shè)計資料的方差分析、多個均數(shù)之間兩兩比較的q檢驗等，必要時給出統(tǒng)計量的具體值（如：t=4.35，χ2= 5.33，F(xiàn)=12.09等）；在用不等式表示P值時，一般情況下選用P＞0.05、P＜0.05和P＜0.01 3種表達方式，無須再細分。當(dāng)涉及到總體參數(shù)（如總體均數(shù)、總體率等）時，在給出顯著性檢驗結(jié)果的同時，再給出95%可信區(qū)間。

The Clinical Studies of β-catenin Expression Levels in The Nucleus of Gastric Cancer

GAO Zhen-wu, ZHAI Mi-mi,JIAO Xin,et al. Department of Gastrointestinal Surgery,Weifang Medical College,Weifang (261000),China

Objective To investigate the relations between β-catenin expression level in the nuclei and the clinical pathological factors of gastric cancer. Methods Immunohistochemical SP method was used to de?tect β-catenin expression levels in gastric cancer tissue cell nucleus.The relationship between β-catenin and tu?mor infiltration depth,lymph node metastasis,tissue differential degree,clinical stages was studied.Regarding disease-free survival(DFS)and overall survival(OS)as evaluation indexes to discuss β-catenin element's rela?tionship with the prognosis of patients with gastric cancer.ROC curve was used to measure the value of β-catenin element in evaluation of the prognosis of patients with gastric cancer. Results β-catenin expres?sion level in the nuclei of gastric cancer tumor tissue was not related to age,gender(P＞0.05),but is associated with tumor infiltration depth(P＜0.01),lymph node involvement(P＜0.05),TNM staging(P＜0.05),and the differentiation degree of tumor(P＜0.05).Kaplan-Meier survival curves showed that DFS(26 months)and OS(38 months)in the patients of β-catenin negtive expression is better than DFS(18 months)and OS(24 months)in pa?tients of positive expression.Cox Multiple factors analysis showed β-catenin expression in the nuclei can be used as an independent prognostic factor in patients with gastric cancer(HR=0.87,95%CI:0.54～2.34,P= 0.03).ROC curve showed β-catenin had the same significance in evaluating the prognosis of patients with gas?tric cancer(area under the curve is 0.82). Conclusion β-catenin expression level in the nuclei of gastric can?cer was positively related to TNM staging,lymph node metastasis,and infiltration depth,but negatively to tumor differentiation degree.Its expression may be a marker of poor prognosis of patients with gastric cancer.

β-catenin；gastric cancer；immunohistochemical；the prognosis；cell nucleus

R735.2

A

1007-6948(2016)04-0331-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.04.006

1.山東省濰坊醫(yī)學(xué)院（濰坊 261000）

2.山東省濰坊市人民醫(yī)院消化內(nèi)科（濰坊 261000）

3.山東省濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科（濰坊 261000）

張國友，E-mail:jiaoxin45@sina.com