刺五加多糖對(duì)免疫應(yīng)激斷奶仔豬血漿D-乳酸水平和腹瀉狀況的影響

韓　杰，張一然，張　飛，邊連全

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧　沈陽(yáng)　110866）

刺五加多糖對(duì)免疫應(yīng)激斷奶仔豬血漿D-乳酸水平和腹瀉狀況的影響

韓杰，張一然，張飛，邊連全?

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866）

本試驗(yàn)旨在探討飼糧添加刺五加多糖（ASPS）對(duì)免疫應(yīng)激斷奶仔豬腹瀉的影響。試驗(yàn)采用2×2因素設(shè)計(jì)，將64頭28日齡斷奶、平均體重為7.22±0.46 kg仔豬隨機(jī)分為4組。第1、2組飼喂基礎(chǔ)飼糧，第3、4組添加800 mg/kg ASPS的飼糧，試驗(yàn)第7天，1、3組仔豬注射生理鹽水，2、4組仔豬注射等量脂多糖（LPS），試驗(yàn)期14 d。結(jié)果表明，ASPS使仔豬腹瀉率、腹瀉指數(shù)和腹瀉頻率分別降低了71.64%（P＜0.05）、78.33%（P＜0.05）和57.83%（P＜0.05），同時(shí)使血漿D-乳酸降低了16.37%（P＜0.05）。LPS和ASPS兩者之間具有互作效應(yīng)。由此可見(jiàn)，在本試驗(yàn)條件下，800 mg/kg ASPS能顯著降低免疫應(yīng)激仔豬腹瀉發(fā)病率和發(fā)病程度，該作用與ASPS降低腸黏膜通透性有關(guān)。

刺五加多糖；仔豬；免疫應(yīng)激；腹瀉

斷奶仔豬腹瀉是養(yǎng)豬生產(chǎn)中最常見(jiàn)的復(fù)雜應(yīng)激綜合征，尤其當(dāng)仔豬遭受環(huán)境病原菌侵襲發(fā)生免疫應(yīng)激時(shí)腹瀉現(xiàn)象更為嚴(yán)重[1]。我國(guó)仔豬斷奶后2周內(nèi)的腹瀉率高達(dá)30%～100%[2]。腹瀉不僅導(dǎo)致仔豬飼料效率降低，使仔豬生長(zhǎng)發(fā)育遲緩或停滯成為“僵豬”，還能造成機(jī)體抵抗力減弱而容易繼發(fā)感染其他疾病而死亡，嚴(yán)重降低養(yǎng)豬生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。刺五加的水提物活性成分之一的刺五加多糖（ASPS）具有抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[3]。課題組前期研究表明飼糧添加ASPS能改善斷奶仔豬生長(zhǎng)性能，降低腹瀉率，增強(qiáng)免疫功能[4]，但ASPS對(duì)免疫應(yīng)激仔豬腹瀉的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以脂多糖（LPS）誘導(dǎo)建立免疫應(yīng)激模型，研究ASPS對(duì)免疫應(yīng)激仔豬腹瀉和血漿D-乳酸的影響，旨在為應(yīng)用ASPS防治仔豬腹瀉提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料和飼糧ASPS利用水提醇沉工藝從刺五加根中提取，苯酚-硫酸法測(cè)得多糖純度為92.7%。LPS為大腸桿菌血清型（Sigma，055∶B5），臨用時(shí)配制。基礎(chǔ)飼糧參照NRC（1998）仔豬營(yíng)養(yǎng)需要配制的粉狀飼料，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table1　Composition and nutrient levels of the basa l diet（air-d ry basis）

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)、試驗(yàn)動(dòng)物及管理試驗(yàn)采用2×2因素設(shè)計(jì)，即飼糧處理（添加或不添加ASPS）和免疫應(yīng)激處理（注射LPS或等量生理鹽水），試驗(yàn)期14 d。將64頭28日齡斷奶、平均體重為7.22± 0.46 kg的“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交斷奶仔豬隨機(jī)分為4組，每組4個(gè)重復(fù)。第1、2組飼喂基礎(chǔ)飼糧，第3、4組飼喂添加800 mg/kg ASPS的飼糧，試驗(yàn)第7天，1、3組仔豬腹腔注射100μg/kg BW生理鹽水，2、4組注射等量LPS。試驗(yàn)第14天，仔豬前腔靜脈采血，3 500 r/min離心10 min分離血漿，-20℃保存待測(cè)。

1.3指標(biāo)測(cè)定

1.3.1血漿 D-乳酸的測(cè)定采用改良酶學(xué)分光光度法測(cè)定血漿含量D-乳酸：取待測(cè)血漿0.25 mL分別加入4.6 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）與碳酸鹽緩沖液的混合溶液1.5 mL、50μL D-乳酸脫氫酶，混勻后37℃水浴30 min?？瞻坠芗尤胝麴s水，分光光度計(jì)測(cè)OD340nm值。同時(shí)將D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同濃度后，在與上述待測(cè)血漿相同處理?xiàng)l件下測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液OD340nm值，作D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線并求回歸方程。將血漿OD340nm值代入回歸方程計(jì)算血漿D-乳酸含量。

1.3.2腹瀉程度的觀察與計(jì)算于試驗(yàn)第7天注射LPS后至第14天，每天9∶00～16∶00觀察仔豬的腹瀉頭數(shù)及腹瀉程度，仔豬腹瀉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

腹瀉率/%=試驗(yàn)期腹瀉仔豬頭數(shù)/試驗(yàn)仔豬總頭數(shù)×100

腹瀉指數(shù)/分=試驗(yàn)期每日糞便評(píng)分之和/試驗(yàn)仔豬總頭數(shù)

腹瀉頻率/%=∑[（腹瀉仔豬頭數(shù)×仔豬腹瀉天數(shù)）/（試驗(yàn)仔豬總頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù)）]×100

表2　仔豬腹瀉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab le2　Pig let diarrhea score standard

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后，采用SPSS 16.0軟件的GLM程序進(jìn)行兩因素方差分析。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)確定為差異顯著。

2　結(jié)果

2.1A A S S P P S S對(duì)免疫應(yīng)激仔豬腹瀉的影響結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　刺五加多糖對(duì)免疫應(yīng)激斷奶仔豬腹瀉的影響Table3　The effect of dietary ASPS on diarrhea of LPS-challenged weanling pigs

由表3可知，LPS免疫應(yīng)激使斷奶仔豬腹瀉率提高了130%（P＜0.05），腹瀉指數(shù)和腹瀉頻率也分別提高了129.9%（P＜0.05）和77.76%（P＜0.05）。飼喂800 mg/kg ASPS使斷奶仔豬腹瀉率、腹瀉指數(shù)和腹瀉頻率分別降低了71.64%（P＜0.05）、78.33%（P＜0.05）和57.83%（P＜0.05）；LPS和ASPS兩者之間存在互作效應(yīng)，即添加ASPS能緩解LPS應(yīng)激引起的仔豬腹瀉率、腹瀉指數(shù)和腹瀉頻率的增加（P＜0.05）。

2.2A A S S P P S S對(duì)免疫應(yīng)激仔豬血漿D D--乳酸含量的影響結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　刺五加多糖對(duì)免疫應(yīng)激斷奶仔豬血漿D-乳酸含量的影響Tab le4　The e ffect of dietary ASPS on p lasm a D-lactate of LPS-challenged weanling pigs　μg/L

由表4可知，LPS免疫應(yīng)激使斷奶仔豬血漿D-乳酸含量提高了29.57%（P＜0.05）；飼喂800 mg/kg ASPS使仔豬血漿D-乳酸降低了16.37%（P＜0.05）；LPS和ASPS兩者之間存在互作效應(yīng)，即添加ASPS能緩解LPS應(yīng)激引起的仔豬血漿D-乳酸的提高（P＜0.05）。

3　討論

LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌壁的大分子成分，在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)免疫學(xué)研究中，注射LPS是建立動(dòng)物免疫應(yīng)激模型的主要方式[5]。本試驗(yàn)注射LPS的仔豬出現(xiàn)了嚴(yán)重腹瀉、嗜睡、發(fā)燒等癥狀，證明了本試驗(yàn)仔豬的免疫應(yīng)激模型構(gòu)建是成功的。

腹瀉率可以反映仔豬腹瀉的發(fā)病率，而腹瀉頻率和腹瀉指數(shù)能反映仔豬腹瀉的嚴(yán)重程度。通過(guò)對(duì)這3項(xiàng)指標(biāo)的觀察，可全面反映仔豬的腹瀉狀況。項(xiàng)目組前期研究已經(jīng)表明，飼糧添加800 mg/kg ASPS能顯著降低斷奶仔豬的腹瀉率，本試驗(yàn)與前期試驗(yàn)結(jié)果相一致[4]。另外，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激的免疫應(yīng)激仔豬腹瀉發(fā)病率和腹瀉程度較未發(fā)生免疫應(yīng)激的仔豬表現(xiàn)得更為嚴(yán)重，而飼糧添加800 mg/kg ASPS對(duì)仔豬腹瀉發(fā)病率和腹瀉程度均有較大程度的改善。很多研究已經(jīng)表明腸黏膜損傷與腹瀉有密切的關(guān)系。提示ASPS降低斷奶仔豬腹瀉的作用與緩解腸黏膜損傷有關(guān)。

LPS誘導(dǎo)仔豬發(fā)生免疫應(yīng)激時(shí)，由于促炎性細(xì)胞因子大量釋放可使腸黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變，破壞細(xì)胞間的緊密連接，導(dǎo)致腸黏膜通透性增高，從而引起腹瀉。動(dòng)物腸道內(nèi)的D-乳酸由胃腸道固有細(xì)菌產(chǎn)生，且哺乳動(dòng)物體內(nèi)沒(méi)有快速代謝D-乳酸的酶系統(tǒng)。當(dāng)腸道發(fā)生損傷致腸黏膜絨毛頂端上皮脫落，腸上皮緊密連接損傷導(dǎo)致腸黏膜通透性增加時(shí)，腸道中細(xì)菌產(chǎn)生的大量D-乳酸通過(guò)受損黏膜進(jìn)入血液，使血漿 D-乳酸水平升高。故監(jiān)測(cè)血漿D-乳酸水平可及時(shí)反映腸黏膜損害程度和通透性變化[6]。本試驗(yàn)研究顯示LPS免疫應(yīng)激仔豬血漿D-乳酸含量顯著增加，提示免疫應(yīng)激能損傷仔豬的腸黏膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸道通透性增加。而飼糧添加ASPS能顯著降低血漿D-乳酸含量，提示ASPS對(duì)免疫應(yīng)激仔豬腸黏膜損傷具有緩解作用。但有關(guān)ASPS緩解免疫應(yīng)激仔豬腹瀉的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

4　結(jié)論

免疫應(yīng)激斷奶仔豬腹瀉發(fā)病率和發(fā)病程度較未發(fā)生免疫應(yīng)激的斷奶仔豬更為嚴(yán)重。在本試驗(yàn)條件下，飼糧添加800 mg/kg ASPS能顯著降低免疫應(yīng)激仔豬腹瀉發(fā)病率和發(fā)病程度，該作用與降低腸黏膜的通透性有關(guān)。

[1]盧亞萍，杜杰.斷奶仔豬腹瀉原因分析及防治[J].動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)，2005，12：15-16.

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[3]林秋葉.刺五加水提物抗炎作用及其機(jī)制研究[D].大連：大連理工大學(xué)，2007.

[4]韓杰，邊連全，劉顯軍，等.刺五加多糖對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和免疫指標(biāo)的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2012，24（11）：2203-2209.

[5]Lai C H,Yin J D,Li D F,et al.Conjugated linoleic acid at tenuates the production and gene expression of proinf lammatory cytokines in weaned pigs chal lenged with lipopolysaccharide[J].J Nut ri,2005,135∶239-244.

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Effects of Dietary Acanthopanax senticosus Polysaccharide on Diarrhea and D-lactate in Plasma of Challenged Weanling Pig

Han Jie,Zhang Yiran,Zhang Fei,Bian Lianquan*
（Col lege of Animal Husbandry and Veterinary,Shenyang Agricul tural University,LiaoningShenyang110866）

The experiment was conducted to evaluate the ef fect of dietary acanthopanax senticosus polysaccharide(ASPS)on diar rhea and d-lactate in plasma of weanl ing pigs chal lenged with Escherichia col i l ipopolysaccharide(LPS).A total of 64 bar rows(Duroc×Large White×Landrace,28 days of age,initial weight of 7.22±0.46 kg)in a 2×2 factorial experiment were randomly al lotted to four dietary treatments with 4 repl ications and 4 pigs per pen.Pigs in 1 and 2 groups were fed with 0 mg/kg ASPS,and 3,4 groups were fed with 800 mg/kg ASPS.On d 7,pigs in 2 and 4 groups were injected with LPS and the other groups were given equivalent amount of sal ine.The resul ts of 14-d experiment showed that compared with cont rol group,dietary ASPS decreased the diarrhea ratio,diarrhea index and diar rhea f requency by 71.64%(P＜0.05),78.33%(P＜0.05)and 57.83% (P＜0.05)respectively.Fur thermore,ASPS supplementation reduced D-lactate in plasma by 16.73%(P＜0.05).In addition,coactions were observed between ASPS and LPS on these indicators.It is concluded that 800 mg/kg dietary ASPS can reduce incidence of diar rhea,which is related with the decreased mucosal Intestinal permeabil ity.

Acanthopanax senticosus polysaccharide;Weanl ing pigs;Immune chal lenge;Diar rhea

S828.5

B

1672-9692(2016)01-0018-05

2015-11-02

韓杰（1978-），女，博士，講師，研究方向?yàn)樨i動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料。

邊連全（1955-），男，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)樨i動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料。

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD28B01-02），2014遼寧省博士科研啟動(dòng)基金計(jì)劃項(xiàng)目（20141061）。