薰衣草化學(xué)成分分析及差異標志物的識別

趙 潔，唐 軍，陳兆慧，符繼紅

(新疆大學(xué)理化測試中心，新疆 烏魯木齊 830046)

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薰衣草化學(xué)成分分析及差異標志物的識別

趙 潔，唐 軍，陳兆慧，符繼紅

(新疆大學(xué)理化測試中心，新疆 烏魯木齊 830046)

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(HS-SPME-GC/MS)聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合保留指數(shù)(RI)，建立了新疆不同品種薰衣草化學(xué)成分的快速分析方法，并采用多元統(tǒng)計分析方法對不同品種薰衣草的特征差異性標志物進行識別。選取薰衣草揮發(fā)性化合物中順-β-羅勒烯、芳樟醇、乙酸芳樟酯、萜品烯-4-醇、石竹烯和石竹烯氧化物等6個代表性成分進行方法考察，首先優(yōu)化HS-SPME萃取條件，然后運用GC/MS法分析3個品種26批薰衣草花中揮發(fā)性成分，最后采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)對數(shù)據(jù)進行處理。結(jié)果顯示：3個不同品種薰衣草樣品間的化學(xué)成分得到有效區(qū)分；篩選識別出9個不同品種薰衣草間差異顯著的化學(xué)成分標志物，薰衣草特征變量組分與差異標志物分析結(jié)果一致。這說明，SPME-GC/MS結(jié)合多元統(tǒng)計技術(shù)可以為薰衣草復(fù)雜體系的快速鑒定、差異標志物識別提供可行的方法參考。

頂空固相微萃取(HS-SPME)；氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)；薰衣草；主成分分析(PCA)；偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)

薰衣草(LavandulaangustifoliaMill)是唇型科薰衣草屬植物，為多年生亞灌木，有著悠久的種植和應(yīng)用歷史[1-2]。在我國，薰衣草的主要栽培地區(qū)為新疆伊犁，其種植面積約占全國薰衣草種植面積的95%，是世界三大薰衣草基地之一。薰衣草香味濃郁而柔和，無毒副作用，被廣泛用于香水、護膚品、洗發(fā)液等多種日用品中。此外，薰衣草還是一種傳統(tǒng)的維吾爾族藥材，用于治療風(fēng)寒感冒、濕痹關(guān)節(jié)痛、頭疼頭暈等疾病，還可治療皮炎和濕疹等皮膚病[3-5]。但不同品種薰衣草的化學(xué)組成及含量具有一定的差異性，使其藥效及品質(zhì)不同，直接影響市場價格和應(yīng)用范圍。

薰衣草花中的揮發(fā)性成分決定了薰衣草的品質(zhì)。目前對揮發(fā)性成分的提取方法主要有水蒸氣提取法和超臨界CO2提取法，二者都存在樣品用量大、費時及提取成本高等缺點。頂空固相微萃取(HS-SPME)是集采樣、萃取及富集于一體的樣品前處理技術(shù)，具有提取速度快、不使用溶劑、樣品用量少等優(yōu)點，在天然產(chǎn)物揮發(fā)性成分分析中得到了普遍應(yīng)用。近年來，隨著薰衣草應(yīng)用范圍的擴大，在薰衣草的栽培技術(shù)，精油的提取、應(yīng)用及化學(xué)成分分析等方面已開展了廣泛的研究[6-10]，但對新疆不同品種薰衣草揮發(fā)性成分的整體變化和顯著差異性標志物成分的研究則鮮見報道。

薰衣草精油的化學(xué)成分復(fù)雜，如何從大量信息中提取有用的數(shù)據(jù)是一個難點，而多元統(tǒng)計分析技術(shù)可以很好地解決數(shù)據(jù)復(fù)雜的問題[11-13]。本研究擬采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(HS-SPME-GC/MS)技術(shù)結(jié)合保留指數(shù)(RI)法對新疆3個品種26批薰衣草中揮發(fā)性成分進行快速提取與鑒定，并通過主成分分析(PCA)和偏最小二乘法(PLS-DA)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以實現(xiàn)不同品種薰衣草特征差異性標志物的區(qū)分，從而為薰衣草化學(xué)成分的快速鑒定和品質(zhì)控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890B GC-5977A MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Aglient公司產(chǎn)品；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；57330-U手動固相微萃取裝置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維、20 mL玻璃樣品瓶(配有PTFE/硅膠墊片的螺紋瓶蓋)：均為美國Supelco公司產(chǎn)品；XA型粉碎機：江蘇姜堰市分析儀器廠產(chǎn)品。

C5～C24正構(gòu)烷烴標準品：上海化學(xué)試劑有限公司一廠產(chǎn)品；實驗所用薰衣草為2015年采摘的盛花期的法國藍、H-701和C-197(2)，3個品種共26批，采摘地點為大量種植薰衣草的新疆伊犁生產(chǎn)建設(shè)兵團65團、69團和70團。

1.2 薰衣草樣品處理與進樣

將薰衣草花粉碎，過20目篩，存放于4 ℃冰箱中，備用；實驗時，準確稱取20 mg冷藏的薰衣草樣品于20 mL頂空瓶中，將其置于55 ℃水浴鍋內(nèi)平衡30 min后，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭進行固相微萃取，靜態(tài)頂空萃取30 min；萃取完成后，將纖維頭插入到氣相色譜儀進樣口解吸30 s。

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：HP-INNOWax毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.5 μm)；升溫程序：40 ℃保持1 min，以3 ℃/min升至220 ℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持1 min；載氣(He)流速1.0 mL/min；分流比10∶1。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z30～500。

1.4 保留指數(shù)的測定

取C5～C24正構(gòu)烷烴標準品，在與樣品相同的分析條件下測定正構(gòu)烷烴的保留時間，并計算化合物的保留指數(shù)RI。通過譜庫檢索、化合物保留指數(shù)的計算值與NIST數(shù)據(jù)庫在相同色譜柱HP-INNOWax上的RI文獻檢索值的對比，對薰衣草花樣品中的揮發(fā)性組分進行定性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPME萃取條件的優(yōu)化

本實驗采用單變量的方法對法國藍A14樣品的萃取溫度、萃取時間和解吸時間等參數(shù)進行優(yōu)化。優(yōu)化過程中選取薰衣草揮發(fā)性化合物中具有不同沸點和不同含量的順-β-羅勒烯、芳樟醇、乙酸芳樟酯、萜品烯-4-醇、石竹烯和石竹烯氧化物等6個代表性化合物的色譜峰面積作為評價標準，實驗平行3次，計算平均值和標準偏差。另外，萃取纖維涂層的極性也直接影響萃取方法的靈敏性和選擇性。根據(jù)文獻[14-16]，選擇DVB/CAR/PDMS纖維頭萃取薰衣草揮發(fā)性化合物。

2.1.1 萃取溫度的選擇 溫度對萃取過程具有雙重影響。溫度升高有助于分析物從樣品基質(zhì)中釋放出來，但如果溫度持續(xù)上升會降低分析物在涂層和樣品中的分配系數(shù)，降低萃取纖維吸附分析物的能力。因此，選擇合適的溫度是確保最佳萃取效率的關(guān)鍵。本實驗對不同萃取溫度(40、55、70、80和90 ℃)下目標化合物的萃取效率進行研究，結(jié)果示于圖1。可以看出，除順-β-羅勒烯和石竹烯氧化物外，其余化合物的萃取效率都在55 ℃時達到最大值，之后，隨溫度升高萃取效率下降，因此選擇55 ℃為最佳萃取溫度。

注：1.順-β-羅勒烯；2.芳樟醇；3.乙酸芳樟酯；4.萜品烯-4-醇；5.石竹烯；6.石竹烯氧化物

注：同圖1的注釋

2.1.2 萃取時間的選擇 萃取時間是頂空固相微萃取過程的一個重要參數(shù)。對不同萃取時間(20、30、50、70和90 min)下目標化合物的萃取效率進行考察，結(jié)果示于圖2?？梢钥闯?，除順-β-羅勒烯和石竹烯氧化物在90 min時獲得最大萃取效率外，其余化合物在20～90 min內(nèi)的萃取效率變化不大。經(jīng)綜合考慮，選擇30 min為樣品的最佳萃取時間。

2.1.3 解析時間的選擇 在氣相色譜進樣口解吸時，若解吸時間過短可能導(dǎo)致解吸不完全。實驗考察了250 ℃解析溫度下，不同解析時間(10、20、30、60和120 s)對分析物萃取效率的影響，結(jié)果示于圖3?？梢钥闯?，6個目標化合物均在30 s時達到充分解析，且隨著解析時間的延長萃取效率稍許下降。因此，選擇30 s為最佳解析時間。

注：同圖1的注釋

2.2 樣品測定

采用GC/MS法對26批薰衣草花樣品進行分析，各成分質(zhì)譜圖經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，并結(jié)合保留指數(shù)RI，確定了薰衣草精油中的43個化學(xué)成分，結(jié)果列于表1。應(yīng)用峰面積歸一法確定薰衣草樣品中化學(xué)成分的相對百分含量，結(jié)果列于表2，其中，樣品A、B和C分別為薰衣草品種法國藍、H-701和C-197(2)。薰衣草揮發(fā)性成分主要以萜烯氧化物類化合物為主，分別為芳樟醇、乙酸芳樟酯、乙酸薰衣草酯、萜品烯-4-醇和石竹烯氧化物。其中，芳樟醇(含量>10%)和乙酸芳樟酯(含量>24%)是含量最高的2個化合物，并且被認為其含量越高薰衣草的品質(zhì)越好。薰衣草揮發(fā)性化合物中還含有較多的順-β-羅勒烯、α-檀香烯、石竹烯和順-β-法呢烯等烯烴類化合物，且不同品種薰衣草中化學(xué)成分種類和含量存在一定的差異。

2.3 PCA分析

采用主成分分析(PCA)法對26批薰衣草樣品品種的差異及樣品與揮發(fā)性化合物的相關(guān)性進行分析。以薰衣草樣品的GC/MS數(shù)據(jù)為研究對象，用43個色譜峰的面積百分含量構(gòu)建主成分分析數(shù)據(jù)矩陣，對所構(gòu)建數(shù)據(jù)標準化處理后進行PCA分析。結(jié)果表明，第一主成分(PC1)方差為56.3%，第二主成分(PC2)方差為17.4%，前2個累積方差貢獻率為73.7%，所以前2個主成分可以代表原數(shù)據(jù)的主要信息。主成分分析結(jié)果示于圖4。由主成分PC1和PC2得分分布圖(圖4a)可見，薰衣草樣品被明顯分為3個區(qū)域，說明這3個品種的化學(xué)成分存在明顯的差異。主成分分布圖(圖4a)和變量載荷圖(圖4b)在分布和趨勢上具有一致性和可比性。經(jīng)過對比分析，根據(jù)品種不同，薰衣草樣品可分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個類別。其中，Ⅰ類主要包括法國藍樣品A1～A17，特征變量組分主要為石竹烯氧化物和乙酸薰衣草酯；Ⅱ類主要包括H-701樣品B1、B2和B3，特征變量組分主要為乙酸芳樟酯和石竹烯；Ⅲ類包括C-197(2)樣品C1～C6，特征變量組分主要為芳樟醇、萜品烯-4-醇、順-β-羅勒烯和順-β-法呢烯。

2.4 PLS-DA分析

采用PLS-DA法分析薰衣草不同品種之間的差異變量，即差異標志物成分。以常用變量載荷評價參數(shù)(VIP)值來描述變量的貢獻程度，當(dāng)VIP>1即認為存在潛在的差異化學(xué)成分。對法國藍和H-701樣品進行PLS-DA聚類分析，結(jié)果示于圖5a，模型驗證結(jié)果(R2Y=0.900，Q2=0.861)顯示其可靠有效；PLS-DA的VIP得分圖示于圖5b，其中，VIP>1的化合物共有4個，分別為乙酸薰衣草酯、乙酸芳樟酯、石竹烯和吉瑪烯D。對法國藍和C-197(2)樣品進行PLS-DA聚類分析，結(jié)果示于圖6a，模型驗證結(jié)果(R2Y=0.901，Q2=0.862)顯示其可靠有效；PLS-DA的VIP得分圖示于圖6b，VIP>1的化合物共有7個，分別為乙酸薰衣草酯、芳樟醇、萜品烯-4-醇、順-β-羅勒烯、順-β-法呢烯、乙酸芳樟酯和石竹烯氧化物。對H-701和C-197(2) 樣品進行PLS-DA聚類分析，結(jié)果示于圖7a，模型驗證結(jié)果(R2Y=0.971，Q2=0.936)證明其可靠程度較高；PLS-DA的VIP得分圖示于圖7b，VIP>1的化合物共有9個，分別為芳樟醇、石竹烯、順-β-法呢烯、乙酸芳樟酯、乙酸薰衣草酯、吉瑪烯D、順-β-羅勒烯、萜品烯-4-醇和石竹烯氧化物。3個不同品種薰衣草之間具有9個潛在的差異標志物成分，數(shù)據(jù)分析結(jié)果與PCA不同品種的特征變量組分分析結(jié)果一致，2種多元統(tǒng)計技術(shù)的分析結(jié)果可互相驗證。其中，共有的差異性標志物為乙酸薰衣草酯和乙酸芳樟酯，乙酸薰衣草酯在法國藍中的相對百分含量最高，并且是法國藍的特征變量組分；乙酸芳樟酯在H-701中的相對百分含量最高，同時是H-701的特征變量組分。

表1 薰衣草揮發(fā)性化學(xué)成分

注：文獻值為HP-INNOWax色譜柱上的保留指數(shù)

表2 26批薰衣草樣品特征峰面積的相對百分含量

注：a.主成分分布圖；b.變量載荷圖

注：圖b中VIP>1的4種化合物依次為乙酸薰衣草酯、乙酸芳樟酯、石竹烯和吉瑪烯D

注：樣品A、B和C分別代表薰衣草品種法國藍、H-701和C-197(2)；*表示省略A5～A17和C3～C5樣品數(shù)據(jù)；—表示未檢出

注：圖b中VIP>1的7種化合物依次為乙酸薰衣草酯、芳樟醇、萜品烯-4-醇、順-β-羅勒烯、順-β-法呢烯、乙酸芳樟酯和石竹烯氧化物

注：圖b中VIP>1的9種化合物依次為芳樟醇、石竹烯、順-β-法呢烯、乙酸芳樟酯、乙酸薰衣草酯、吉瑪烯D、順-β-羅勒烯、萜品烯-4-醇和石竹烯氧化物

3 結(jié)論

建立了HS-SPME與GC/MS聯(lián)用分析薰衣草中揮發(fā)性成分的方法，并結(jié)合多元統(tǒng)計分析技術(shù)快速識別不同品種薰衣草花中差異標志物。采用該方法對3個品種26批新疆薰衣草樣品進行了系統(tǒng)地研究。萃取條件優(yōu)化過程中所選用的順-β-羅勒烯、芳樟醇、乙酸芳樟酯、萜品烯-4-醇、石竹烯和石竹烯氧化物等6個具有代表性的化合物既是薰衣草樣品的主要特征變量組分，又是差異標志物成分，使得建立的樣品提取方法更具代表性和準確性。利用GC/MS結(jié)合保留指數(shù)RI進行定性分析，可以提高薰衣草揮發(fā)性化合物定性結(jié)果的準確性。采用PCA和PLS-DA技術(shù)對GC/MS數(shù)據(jù)進行分析，3個不同品種薰衣草樣品被明顯的分為3個區(qū)域，不同品種薰衣草間得到9個差異化學(xué)成分，特征變量組分與差異標志物分析結(jié)果一致。結(jié)果表明，SPME-GC/MS結(jié)合多元統(tǒng)計技術(shù)可以對薰衣草復(fù)雜體系實現(xiàn)快速分析、識別差異標志物成分。該方法具有樣品用量少、靈敏度高、不需使用溶劑等優(yōu)點，可為天然產(chǎn)物中揮發(fā)性成分的快速分析提供方法參考。

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Identification of Chemical Constituents and Discrimination Markers in Lavender by HS-SPME-GC/MS

ZHAO Jie, TANG Jun, CHEN Zhao-hui, FU Ji-hong

(CenterforPhysicalandChemicalAnalysis,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

The lavender has been widely used in food, aromatherapy, fragrant and pharmaceutical industries due to its unique chemical composition which confers both aromatic and biological activities. A method was established to fast identify the chemical constituents by phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC/MS) and provided the basis for distinction of the different species by analyzing the remarkably different chemical components in the lavender. Based on the peak areas ofcis-β-ocimene, linalool, linalyl acetate, terpinen-4-ol, caryophyllene and caryophyllene oxide, three parameters (temperature, time of extraction and desorption time) of headspace solid-phase micro-extraction (HS-SPME) were optimized, resulting in the best extraction condition including extraction temperature of 55 ℃, extraction time of 30 min and desorption time of 30 s. Twenty-six volatile oil samples collected in Xinjiang which belong to three different lavender species were analyzed by GC/MS．Principal component analysis (PCA) and partial least-squares discriminant analysis (PLS-DA) were used to analyze the aroma profiles of the lavender. The results show that the chemical compositions in lavender from different species are clearly distinguished. Kinds of 9 chemical compositions, such as linalool, caryophyllene,cis-β-farnesene, linalyl acetate, lavandulyl acetate, germacrene D,cis-β-ocimene, terpinen-4-ol and caryophyllene oxide, which are indentified as discrimination markers. This study can provide the basis for rapidly qualitative analysis of constituents and quantity control of the lavender.

headspace solid-phase micro-extraction (HS-SPME); gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS); lavender; principal component analysis (PCA); partial least-squares discriminant analysis (PLS-DA)

2016-01-08;

2016-01-27

國家自然科學(xué)基金(21565024)；新疆高校科研計劃科學(xué)研究重點項目(XJEDU2012I14)；新疆大學(xué)博士科研啟動基金(BS120135)資助

趙 潔(1990—)，女(漢族)，山東人，碩士研究生，分析化學(xué)專業(yè)。E-mail: zjxjdx@163.com

符繼紅(1977—)，女(漢族)，新疆人，副教授，從事天然產(chǎn)物研究。E-mail: fjh.518@163.com

時間：2016-07-05；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160705.1221.016.html

O657.63

A

1004-2997(2016)06-0517-09

10.7538/zpxb.youxian.2016.0030