UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)結(jié)合診斷離子方法快速分析連錢草中黃酮類化合物

李 偉，馮育林，黎田兒，吳 歡，李 艷，鐘國躍，吳 蓓，何明珍

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330006；2.江西省南昌市食品藥品檢驗所，江西 南昌 330029)

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UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)結(jié)合診斷離子方法快速分析連錢草中黃酮類化合物

李 偉1，馮育林1，黎田兒1，吳 歡1，李 艷1，鐘國躍1，吳 蓓2，何明珍1

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330006；2.江西省南昌市食品藥品檢驗所，江西 南昌 330029)

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)技術(shù)結(jié)合診斷離子法快速分析連錢草中黃酮類化合物。采用信息依賴型的掃描(IDA)模式，在電噴霧負(fù)離子模式下分析黃酮標(biāo)準(zhǔn)化合物的裂解規(guī)律及特征碎片離子信息，并以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征碎片離子作為診斷離子，全面鑒別連錢草中的黃酮類成分。在連錢草中共鑒別出35個黃酮類化合物，其中有25個化合物為在該植物中首次發(fā)現(xiàn)；除白楊素、芹菜素、毛蕊異黃酮、木犀草素、山奈酚、槲皮素外，其他化合物均以黃酮苷的形式存在。該方法可為連錢草的質(zhì)量控制及藥效學(xué)研究提供技術(shù)支持。

超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)；診斷離子；連錢草；黃酮

連錢草又名活血丹、透骨消，為唇形科多年生草本植物活血丹(Glechomalongituba(Nakai)Kupr.)的干燥地上部分[1]，是貴州、云南等地苗族習(xí)用藥材[2]，除西北地區(qū)外，在全國各地均有分布[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，連錢草對金黃色葡萄球菌極度敏感，對痢疾桿菌、綠膿桿菌和傷寒桿菌中度敏感，具有抗炎、抑菌、降血糖、降膽固醇等藥理活性[4-6]。連錢草中含有揮發(fā)油[7]、有機酸類[8]、萜類[9-10]和黃酮類[11-12]化學(xué)成分，目前已報道了大波斯菊苷、蘆丁、槲皮素、芹菜素、木犀草素、木犀草苷等黃酮類化合物，但仍有許多未知的黃酮類成分未見報道。為了明確連錢草的藥效活性物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，有必要全面分析連錢草的化學(xué)成分。

確定中藥材中未知化學(xué)成分常用的方法是對藥材進行提取分離純化，得到化合物單體成分后，進行核磁共振波譜解析，進而得到化合物準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)信息。雖然該方法的準(zhǔn)確性高，但試劑消耗量大、過程繁瑣、耗時較長，且不能滿足痕量分析的要求。近年來，超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)技術(shù)結(jié)合了超高效液相色譜的分離能力和高分辨質(zhì)譜的高靈敏度和高精確度，能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜體系中化學(xué)成分的高通量分析[13-17]，在中藥復(fù)雜成分定性分析方面得到廣泛應(yīng)用[18-19]。UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)依賴性型掃描模式(IDA)能夠得到化合物高質(zhì)量精度的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜信息。根據(jù)化合物的一級質(zhì)譜信息確定化合物的分子式，從Chemspider等數(shù)據(jù)庫中篩選出候選化合物[20]；根據(jù)化合物的二級質(zhì)譜信息進一步確定化合物的母核結(jié)構(gòu)、特征官能團等，從而快速篩選或推測目標(biāo)化合物。由于具有相同結(jié)構(gòu)的化合物在質(zhì)譜中有相似的裂解規(guī)律和特征碎片，因此總結(jié)黃酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的裂解規(guī)律，并以其特征碎片離子作為診斷離子，有利于黃酮類未知化合物的質(zhì)譜解析。

本實驗將采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)，以具有代表性的黃酮標(biāo)準(zhǔn)化合物裂解規(guī)律和特征碎片離子為診斷信息，結(jié)合SciFinder、Chemspider、Massbank數(shù)據(jù)庫的在線檢索功能，全面解析連錢草中的黃酮類化合物，希望為連錢草的質(zhì)量控制提供技術(shù)支持，同時為其藥效學(xué)研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器

TripleTOF?5600高分辨質(zhì)譜儀：美國AB Sciex公司產(chǎn)品，配有Analyst TF1.6和Peakview1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；LC-30AD超高效液相色譜儀：日本島津公司產(chǎn)品；KQ250DB型數(shù)控超聲波清洗器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2 材料及試劑

連錢草藥材：購于貴州，經(jīng)江西省南昌市食品藥品檢驗所主管藥師吳蓓鑒定為唇形科活血丹(Glechomalongituba(Nakai)Kupr.)干燥地上部分；木犀草素(批號：111520-200504)、木犀草苷(批號：111720-201408)、山萘酚(批號：110861-200808)、紫云英苷(批號：110080-201307)、槲皮素(批號：111538-201105)、蘆丁(批號：100080-201409)對照品：購自中國食品藥品檢驗所；甲醇、乙腈(色譜純)：美國Fisher公司產(chǎn)品；甲酸(色譜純)：美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；蒸餾水：屈臣氏集團產(chǎn)品；其余試劑均為分析純。

1.3 供試品溶液的制備

取1 g連錢草藥材粉末(過3號藥篩)，加入50 mL 60%甲醇，超聲30 min，用0.45 μm濾膜過濾，濾液稀釋100倍，過0.22 μm微孔濾膜，待測；用甲醇稀釋對照品溶液，配制成濃度為100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 實驗方法

1.4.1 色譜條件 Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1mm×1.7 μm)；柱溫30 ℃，體積流量0.4 mL/min；進樣量2 μL；流動相：1‰甲酸水溶液(A相)-乙腈(B相)；B相比例隨時間變化為0～30 min、10%～20%B，30～70 min、20%～50%B，70～90 min、保持50%B相不變。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子掃描模式，噴霧電壓-4 500 V，溫度600 ℃，氣簾氣壓力1.72×105Pa，霧化氣(GS1)和輔助氣(GS2)壓力均為3.45×105Pa，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 200，數(shù)據(jù)采集時間90 min，母離子觸發(fā)的子離子掃描方式(TOF/MS-IDA-MS2)，去簇電壓-100 V，碰撞能量-40 eV，碰撞能量疊加10 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜裂解規(guī)律研究

按1.4.2節(jié)條件分別將6個黃酮類對照品溶液經(jīng)進樣針注入質(zhì)譜儀中，采集數(shù)據(jù)并得到二級碎片離子后，總結(jié)黃酮類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的裂解規(guī)律和特征碎片離子信息。6個黃酮類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式示于圖1，二級質(zhì)譜圖示于圖2。

2.1.1 黃酮苷元裂解規(guī)律及特征碎片離子

木犀草素，分子式為C15H10O6，母離子為[M—H]-m/z285.041 2。在二級質(zhì)譜中，可以生成一系列的碎片離子，其中m/z241.049 9(C14H9O4-)比母離子少44 u，為木犀草素母核C環(huán)失去羰基后再失去氧原子的碎片離子；木犀草素母核發(fā)生RDA裂解，分別生成m/z151.003 8(C7H3O4-)和m/z133.029 5(C8H5O2-)碎片離子，其中m/z133.029 5由B環(huán)和C環(huán)上的殘基組成，其豐度遠大于m/z151.003 8。

圖1 6個黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)式

注：a.木犀草素；b.木犀草苷；c.山奈酚；d.紫云英苷；e.槲皮素；f.蘆丁

槲皮素，分子式為C15H10O7，母離子[M—H]-m/z301.036 6。二級碎片離子m/z273.040 3(C14H9O6-)為C環(huán)上脫CO生成；m/z178.999 3(C8H3O5-)為槲皮素失去B環(huán)后再失去CH的碎片離子；m/z151.003 7為槲皮素RDA裂解形成的碎片離子。

綜上所述，黃酮類化合物在質(zhì)譜中容易失去C環(huán)中的羰基(-28 u)和氧原子(-16 u)，且易發(fā)生RDA裂解生成m/z151.003 8碎片離子。其中，在具有黃酮醇結(jié)構(gòu)的化合物中，m/z301.036 6、178.999 3可視為槲皮素母核的診斷離子，m/z285.040 1、255.028 8可視為山奈酚母核的診斷離子。

2.1.2 黃酮苷裂解規(guī)律及特征碎片離子

木犀草苷，分子式為C21H20O11，母離子[M—H]-m/z447.088 1，葡萄糖基在A環(huán)的7位羥基上，二級碎片離子中，出現(xiàn)了明顯的苷元母核離子m/z285.040 3(C15H9O6-)和m/z284.031 1(C15H8O6·-)。根據(jù)有機化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律和氮規(guī)則可知，當(dāng)化合物不含或含偶數(shù)個氮原子時，化合物的相對分子質(zhì)量為偶數(shù)，其[M—H]-峰的質(zhì)荷比一般為奇數(shù)，但在質(zhì)譜中均裂形成的奇電子離子質(zhì)荷比卻為偶數(shù)。m/z284.031 1(C15H8O6·-)為葡萄糖均裂方式形成的碎片離子，其豐度小于異裂方式脫去葡萄糖后的碎片離子m/z285.040 3；m/z284.031 1(C15H8O6·-)可繼續(xù)脫去C環(huán)羰基生成m/z256.037 3(C14H8O5·-)；此外，還發(fā)現(xiàn)了黃酮母核RDA裂解碎片m/z151.006 2。

綜上所述，在與黃酮苷元相同的碰撞能量下，黃酮苷中的基峰常為脫掉糖基后的苷元碎片。在黃酮醇類化合物的糖基中，中性碎片的丟失方式與苷鍵的位置有關(guān)[21-22]：若與苷鍵連接的糖為單糖，苷鍵位于A環(huán)酚羥基時，脫糖基常以異裂方式為主，生成質(zhì)荷比為奇數(shù)的奇電子離子峰；當(dāng)苷鍵位于C環(huán)醇羥基時，脫糖基常以均裂方式為主，生成質(zhì)荷比為偶數(shù)的偶電子離子峰。苷元碎片離子的豐度大小可以作為判斷苷元結(jié)構(gòu)及糖基位置的重要診斷依據(jù)[23]，但當(dāng)與苷鍵連接的糖為雙糖或多糖時，情況比較復(fù)雜[24]。常見的黃酮類化合物的診斷離子信息情況列于表1。

2.2 連錢草中黃酮類化合物的確認(rèn)

按1.4節(jié)條件進樣，采集連錢草樣品數(shù)據(jù)，使用Peakview1.2軟件分析，共鑒別出35個黃酮類化合物，其中有25個化合物為在該植物中首次發(fā)現(xiàn)，連錢草樣品的總離子流圖示于圖3，鑒別結(jié)果列于表2。由于黃酮類化合物具有相同的母核，在質(zhì)譜中具有相似的裂解規(guī)律，本實驗選取具有代表性的化合物2、6、18、28、29、33、34，闡述其詳細的解析過程。

化合物2：保留時間43.59 min，根據(jù)母離子[M—H]-m/z269.046 1，可得到化合物的分子式為C15H10O5。該化合物的母離子質(zhì)荷比比木犀草素小16 u，且豐度最強的碎片離子m/z117.035 2(C8H5O-)也比木犀草素基峰碎片離子m/z133.029 5(C8H5O2-)小16 u，由此推測該化合物比木犀草素少1個羥基；在其二級碎片離子中，發(fā)現(xiàn)了黃酮RDA裂解碎片m/z151.003 0(C7H3O4-)，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為芹菜素，其二級質(zhì)譜圖及裂解途徑示于圖4。

表1 常見黃酮類化合物的診斷離子

圖3 UPLC/Q-TOF-MS分析連錢草的總離子流圖

表2 連錢草中黃酮類化合物的鑒別結(jié)果

Table 2 Identification results of flavonoids compounds fromGlechomalongituba(Nakai) kupr

序號tR/min分子式母離子(m/z)誤差/×10-6二級碎片離子(m/z)推斷結(jié)果117.82C21H20O10431.09840.8268.0381,240.0474,211.0433,151.0049大波斯菊苷243.53C15H10O5269.0453-0.9227.0346,183.0445,149.0245,117.0356,107.0144芹菜素325.02C21H20O11447.0932-0.2285.0403,256.0373,151.0062木犀草素-7-O-葡萄糖苷418.55C27H30O16609.14864.1301.0365,300.0280,271.0253,255.0305蘆丁537.67C15H10O7301.03571.3151.0027,121.0299,107.0126槲皮素6*40.25C27H30O15593.15414.9533.1225,503.1189,473.1070,383.0800,353.1070夏佛托苷7*12.84C26H28O14563.14422.6473.1089,443.1047,383.0806,353.0662異夏佛托苷825.02C21H20O11447.0932-0.2285.0403,227.0390,151.0062木犀草苷9*44.57C15H10O6285.04060.5255.0288,239.0350,227.0339,211.0344,185.0609,171.0446山柰酚10*1.14C15H10O4253.0500-2.5209.0666,143.0502,119.0480白楊素1119.42C27H26O17621.11142.7351.0581,269.0455,193.0361海常素12*30.16C21H18O11445.07790.6269.0455,225.0552黃芩苷13*10.29C27H26O18637.10884.5351.0586,285.0417,193.0365,175.0252,113.0241木犀草素-3',7-二-O-葡糖醛酸14*10.29C27H26O18637.10883.7461.0764,285.0415,257.0439木犀草素-3',7-二-O-葡糖苷酸15*32.45C24H22O14533.09594.2489.1066,447.0965,327.0512,285.0410木犀草素-7-O-6″-丙二?；咸烟擒?627.92C21H18O12461.07254285.0418,284.0328,255.0288,239.0350,227.0339山柰酚-3-葡萄糖醛酸甙

續(xù)表2

續(xù)表2

注：*表示連錢草中首次檢出的化合物

化合物6：保留時間40.25 min，根據(jù)母離子[M—H]-m/z593.151 2，可得到化合物的分子式為C27H30O15。在該化合物的二級質(zhì)譜圖中，可以發(fā)現(xiàn)比母離子小60 u(m/z533.122 5、C25H25O13-)、90 u(m/z503.118 9，C24H23O12-)、120 u(m/z473.128 9，C23H21O11-)等一系列的特征碎片離子。m/z473.107 0繼續(xù)失去90 u、120 u，分別得到m/z383.080 0(C20H15O8-)和m/z353.107 0(C19H13O7-)碎片離子，這與碳苷的裂解規(guī)律非常相似[25]，故推測該化合物可能為碳苷，且有兩分子的葡萄糖(中性丟失162.052 8 u)與苷元相連。該化合物苷元的相對分子質(zhì)量為269.048 5(C15H19O5-)，推測其可能為芹菜素的雙糖碳苷。根據(jù)這些信息，經(jīng)檢索數(shù)據(jù)庫，推斷該化合物為夏佛托苷，其二級質(zhì)譜圖及裂解途徑示于圖5。

化合物28：保留時間22.02 min，根據(jù)母離子[M—H]-m/z577.164 2，可得到化合物的分子式為C27H30O14。該化合物的特征碎片離子m/z431.100 0(C21H19O10-)和m/z285.041 0(C15H9O6-)分別為母離子依次脫去鼠李糖(中性丟失146.057 9 u)生成的碎片；m/z431.100 0豐度小于m/z430.092 5(C21H18O10·-)，表現(xiàn)出明顯的黃酮醇苷結(jié)構(gòu)特征，由此推測其有一分子的鼠李糖連接在C環(huán)羥基上；m/z285.041 0和m/z255.031 0(C14H7O5-)也顯示苷元母核為黃酮醇結(jié)構(gòu)，推測其苷元為山奈酚。根據(jù)以上信息，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為山奈苷，其二級質(zhì)譜圖及裂解途徑示于圖7。

圖4 芹菜素的二級質(zhì)譜圖(a)及其裂解途徑(b)

圖5 夏佛托苷的二級質(zhì)譜圖(a)及其裂解途徑(b)

圖6 槲皮素3-O-β-葡萄糖苷-7-O-β-葡萄糖苷酸的二級質(zhì)譜圖(a)及其裂解途徑(b)

化合物33：保留時間18.55 min，根據(jù)母離子[M—H]-m/z609.152 2，可得到化合物的分子式為C27H30O16。在特征碎片離子中，m/z463.092 1(C21H19O12-)為母離子脫去一分子鼠李糖后的碎片，繼續(xù)脫去鼠李糖得到m/z317.031 7(C15H9O8-)碎片離子；由于該化合物的2個糖基相同，無法確定糖的連接方式，但因m/z463.092 1的豐度較強，可推測2個鼠李糖連接在苷元的不同位置；m/z316.023 7(C15H8O8·-)的豐度較m/z317.031 7強，且出現(xiàn)了m/z271.025 2(C14H7O6·-)和m/z178.999 4碎片離子，表明該化合物具有槲皮素母核結(jié)構(gòu)；m/z317.031 7較槲皮素母離子[M—H]-m/z301.036 6(C15H9O7-)多16 u，說明該化合物的苷元結(jié)構(gòu)比槲皮素多1個羥基；根據(jù)A環(huán)與B環(huán)殘基形成的一系列碎片離子m/z178.999 4(C8H3O5-)、m/z163.005 3(C8H3O4-)和m/z151.002 7(C7H33-)，推測該羥基可能位于B環(huán)上。經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為楊梅素-3,7-O-二鼠李糖苷，其二級質(zhì)譜圖及裂解途徑示于圖9。

圖7 山奈苷的二級質(zhì)譜圖(a)及其裂解途徑(b)

圖8 銀鍛苷的二級質(zhì)譜圖(a)及其裂解途徑(b)

化合物34：保留時間12.37 min，根據(jù)母離子[M—H]-m/z625.153 2，可得到化合物的分子式為C27H30O17。在特征碎片離子中，m/z479.083 5(C21H19O13-)為母離子脫去一分子鼠李糖后的碎片，m/z463.092 1(C21H19O12-)為母離子脫去一分子葡萄糖后的碎片，由此可見，葡萄糖和鼠李糖在苷元上的位置不同；由苷元的碎片離子m/z317.030 1(C15H9O8-)、m/z316.024 0(C15H8O8·-)和m/z271.019 8(C14H7O6·-)，推測該化合物的母核與化合物33相同，不同之處在于A環(huán)7位羥基上為葡萄糖。經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為楊梅素-3-O-鼠李糖苷-7-O-葡萄糖苷，其二級質(zhì)譜圖及裂解途徑示于圖10。

圖9 楊梅素-3,7-O-二鼠李糖苷的二級質(zhì)譜圖(a)、局部放大圖(b)及其裂解途徑(c)

圖10 楊梅素-3-O-鼠李糖苷-7-O-葡萄糖苷的二級質(zhì)譜圖(a)及其裂解途徑(b)

3 討論

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)分析連錢草中黃酮類化合物。由于具有相同結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物在質(zhì)譜中表現(xiàn)出相同的裂解途徑及特征碎片離子，故在采集連錢草樣品前，分析了典型的黃酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的碎片裂解途徑，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征碎片離子作為診斷信息，有利于同源未知化合物的解析。本實驗共鑒別了連錢草中35個黃酮類化合物，其中有25個化合物為在該植物中首次發(fā)現(xiàn)。除白楊素、芹菜素、毛蕊異黃酮、木犀草素、山奈酚、槲皮素外，其他化合物均以黃酮苷的形式存在。該結(jié)果可為連錢草質(zhì)量控制及藥效研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Rapid Analysis on Flavonoids inGlechomalongituba(Nakai) Kupr by UPLC-Q-TOF/MS Couple with Diagnostic Ions

LI Wei1, FENG Yu-lin1, LI Tian-er1, WU Huan1, LI Yan1,ZHONG Guo-yue1, WU Bei2, HE Ming-zhen1

(1.NationalPharmaceuticalEngineeringCenterforSolidPreparationinChineseHerbalMedicine,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006,China;2.NanchangFoodandDrugInspectionInstitute,Nanchang330029,China)

With the modernization of Chinese medicine, the development of effective quality control method for Chinese herbs is one of the key scientific problems in the future. A method of high performance liquid chromatography-time-of-fight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF/MS) couple with diagnostic ions under negative mode of ESI was developed for analyzing flavonoids inGlechomalongituba(Nakai) Kupr. An information dependent acquisition (IDA) mode was used to acquire high-precision mass spectrometric data for comprehensive profiling of constituents fromGlechomalongituba(Nakai) Kupr. Both precursor ions and corresponding fragment ions (mass deviation are less than 5×10-6) were simultaneously generated in negative mode. The precursor ions showing chemical formula could provide candidate compounds by querying the relevant database. Some database, such as Massbank, SciFinder, Chemspider, were used to quickly screen the possible compounds inGlechomalongituba(Nakai) Kupr. The characteristic groups and structure information were obtained by analyzing fragment ions, and that was very important to select out target ingredients form candidate compounds. The results show that a total of 35 flavonoids are identified, and 25 of which flavonoids are identified for the first time fromGlechomalongituba(Nakai) Kupr. In addition to chrysin, apigenin, isoflavone, luteolin, kaempferol and quercetin, all the other compounds are flavonoid glycosides. The method can provide the technical support and material basis for pharmacodynamics research and quality control ofGlechomalongituba(Nakai) Kupr.

high performance liquid chromatography-time-of-fight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF/MS); diagnostic ions;Glechomalongituba(Nakai) Kupr; flavonoids

2015-12-22;

2016-03-18

江西民族傳統(tǒng)藥現(xiàn)代科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心開放基金項目資助

李 偉(1989—)，男(漢族)，江西上饒人，碩士研究生，藥物化學(xué)專業(yè)。E-mail: liwei6308402@163.com

何明珍(1977—)，女(瑤族)，廣西恭城人，講師，從事天然藥物活性成分及體內(nèi)代謝研究。E-mail: hmz07@163.com

吳 蓓(1976—)，女(漢族)，江西南昌人，副主任藥師，從事藥學(xué)研究。E-mail: wubei8@163.com

時間：2016-07-05；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160705.1349.020.html

O657.63

A

1004-2997(2016)06-0504-13

10.7538/zpxb.youxian.2016.0028