馬鈴薯中立枯絲核菌代謝產物及生物活性研究

張慧秀,龍海濤,孫 艷,牛紅艷,蒲陸梅,邱慧珍

(1.甘肅農業(yè)大學理學院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅農業(yè)大學農業(yè)資源化學與應用研究所,甘肅蘭州 730070;3.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070;4.甘肅農業(yè)大學資源與環(huán)境學院,甘肅蘭州 730070)

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馬鈴薯中立枯絲核菌代謝產物及生物活性研究

張慧秀,龍海濤,孫 艷,牛紅艷,蒲陸梅,邱慧珍

(1.甘肅農業(yè)大學理學院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅農業(yè)大學農業(yè)資源化學與應用研究所,甘肅蘭州 730070;3.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070;4.甘肅農業(yè)大學資源與環(huán)境學院,甘肅蘭州 730070)

研究了馬鈴薯中立枯絲核菌的代謝產物。首先利用不同的有機溶劑萃取立枯絲核菌培養(yǎng)濾液并測定各組分生物活性,其次結合薄層色譜(TLC)與硅膠柱層析兩種色譜分析方法對有毒性組分進行了分離純化,最后利用紫外吸收光譜、紅外吸收光譜和氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)等方法對立枯絲核菌毒素做了分析鑒定。結果表明:乙酸乙酯提取物的毒性顯著高于氯仿提取物。硅膠柱層析中分離得到5個立枯絲核菌分離物(I1、I2、I3、I4、I5)。紫外吸收數據表明,I1在198.5 nm處有最大吸光度;紅外光譜表明,I1中有-CH2(2927.41、2856.06 cm-1)、C=O(1735.62 cm-1)、C=C(1635.34 cm-1)、-CH3(1417.42 cm-1)、-C-O(1263.1、1128.2 cm-1)等基團存在;GC-MS分析結果表明,I1中的主要物質有磷酸三丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯和(甲氧基甲基)三苯基氯化磷幾種物質。

馬鈴薯,立枯絲核菌,代謝產物,生物活性

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)作為全球四大重要糧食作物之一,具有產量高、易栽培和營養(yǎng)豐富等特點,有“地下面包”之稱,在中國逐漸成為增收的優(yōu)勢農作物,具有廣闊的發(fā)展前景[1-2]。然而,馬鈴薯土傳病害日趨嚴重,馬鈴薯黑痣病是主要的土傳病害之一[3-5]。馬鈴薯黑痣病又稱為立枯絲核菌病、莖基腐病、絲核菌潰瘍病、黑色粗皮病[6]。黑痣病的病原菌為立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn),屬于半知菌亞門真菌。立枯絲核菌在致病和培養(yǎng)過程中都會產生毒素,毒素接種引起的癥狀與病原菌直接侵染引起的癥狀一致,是病菌致病的關鍵因子[7-8]。立枯絲核菌主要侵染馬鈴薯的幼芽、莖基部和塊莖。黑痣病對馬鈴薯的產量和品質有著重要的影響,嚴重阻礙馬鈴薯產業(yè)的發(fā)展[9]。

目前,國內外對馬鈴薯黑痣病的研究主要集中于對其生物、化學防治及對寄主抗病性利用等方面,通過科學的田間農藝措施[10],使用化學藥劑[11]和生物防菌劑[12-13]進行生長期預防和控制,或者利用生物因子或非生物因子[14-17]誘導馬鈴薯塊莖對立枯絲核菌的抗性等相關方面報道較多,而對于立枯絲核菌代謝產物的成分及結構等相關方面的研究相對較少[6]。本研究結合兩種色譜分析方法,將立枯絲核菌產生的植物性毒素分離、純化;通過紫外吸收光譜、紅外吸收光譜和GC-MS等儀器分析方法鑒定立枯絲核菌毒素,為研究馬鈴薯黑痣病的預防與控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

立枯絲核菌 由甘肅農業(yè)大學資源與環(huán)境學院生態(tài)實驗室提供;馬鈴薯塊莖 由甘肅農業(yè)大學甘肅省干旱生境作物學重點實驗室提供;小麥 實驗室培育;碳酸氫鈉 分析純,天津市大茂化學試劑廠;鹽酸、乙酸乙酯、石油醚、苯、乙醚、氯仿、丙酮 分析純,天津市福晨化學試劑廠;甲醇 分析純,北京化工廠;薄層層析硅膠GF-254 化學純、柱層層析硅膠 試劑級 青島裕明源硅膠試劑廠。

旋轉蒸發(fā)器RE-2000B 上海亞榮生化儀器廠;手提式紫外分析儀WFH-204 上海精科實業(yè)有限公司;pH計PHS-3C-01 上海三信儀表廠;電子天平BS 224S 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;高速冷凍離心機sigma 3K15 北京五州東方科技發(fā)展有限公司。

1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯瓊脂蔗糖培養(yǎng)基(PSA):馬鈴薯,200 g;蔗糖,20 g;瓊脂,15 g;蒸餾水,1000 mL;pH7.0。馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基(PSB):馬鈴薯,200 g;蔗糖,20 g;蒸餾水,1000 mL;pH7.0。理查德培養(yǎng)基:KNO3,10 g;KH2P04,5 g;MgSO4·7H2O,2.5 g;Fe2(SO4)3,0.02 g;蔗糖,50 g;蒸餾水1000 mL;pH7.0。

1.3 實驗方法

1.3.1 立枯絲核菌的培養(yǎng) 立枯絲核菌的培養(yǎng)方法參考文獻[18-19]并稍作修改。將立枯絲核菌于25 ℃下在PSA上恒溫培養(yǎng)7 d,把直徑為6 cm的菌絲頭從PSA培養(yǎng)基中轉移至裝有50 mL PSB的150 mL燒瓶中,將此培養(yǎng)液于28 ℃下在旋轉振蕩器(180 r/min)中培養(yǎng)2 d后,于4 ℃儲存。將四個菌絲體組從PSB培養(yǎng)基中轉移至一個裝有200 mL理查德培養(yǎng)基的500 mL燒瓶中,然后將培養(yǎng)基置于28 ℃下恒溫培養(yǎng)15～20 d,每天人工振蕩一次。立枯絲核菌培養(yǎng)液經過冷凍離心(5000 r/min)得到培養(yǎng)濾液。

1.3.2 培養(yǎng)濾液中可溶性化合物的提取 提取按照文獻[18]所描述的方法。40 ℃下將50 mL的培養(yǎng)濾液真空濃縮至原體積的一半,向培養(yǎng)濾液中分別加入等體積的甲醇和丙酮,于4 ℃儲存過夜,離心10 min(8500 r/min),收集沉淀物,50 ℃下將上清液蒸發(fā)至干得到殘余物。用25 mL的乙醚、乙酸乙酯、苯和氯仿將50 mL培養(yǎng)濾液分別萃取三次。將有機相和水相部分都在50 ℃蒸干,得到殘余物。將所得沉淀和殘余物分別溶于50 mL無菌蒸餾水中,其生物活性運用莖潰瘍實驗進行評估。用生長在理查德培養(yǎng)基上的立枯絲核菌培養(yǎng)濾液作為對照。

1.3.3 莖潰瘍實驗的測定 莖壞死實驗方法參考文獻[20-21],通過馬鈴薯塊莖(青薯2號)的病害程度反映未處理的立枯絲核菌培養(yǎng)濾液和處理組提取物的生物活性。健康的馬鈴薯塊莖先用自來水洗凈,然后用蒸餾水沖洗,再用70%乙醇消毒。用一個無菌的4 mm軟木鉆孔機從馬鈴薯塊莖上移除馬鈴薯塊,將0.2 mL溶液施加到馬鈴薯塊莖孔中,放回馬鈴薯組織塊,用燭蠟密封。在干凈的鍋底放置一層2 cm厚的蒸汽消毒砂,將種子的芽朝上放置在每個容器的中心。添加足夠的沙子,確保芽被額外覆蓋2 cm厚的土層。培養(yǎng)12 d后,洗滌植株,評估莖潰瘍發(fā)生率和嚴重程度,并和對照組比較。每組實驗重復5次。評估如下:0=無損害或無病變存在;1=輕微損傷(一個至幾個的病變大小小于5 mm);2=中度損傷(病變大小超過5 mm和一些環(huán)剝);3=嚴重損壞(大的病變范圍和環(huán)剝或大部分莖出現死亡);4=所有莖全部死亡。

將測定的實驗數據進行最小顯著性差異(LSD)比較,當p<0.05時,意味著差異顯著。

1.3.4 立枯絲核菌代謝產物的分離及純化 立枯絲核菌代謝產物的分離及純化方法參照文獻[18]并做修改。用12 mol/L HCl調培養(yǎng)液的pH=2.5,取立枯絲核菌培養(yǎng)濾液100 mL,用等體積的乙酸乙酯溶液萃取3次,合并萃取液。在40 ℃下將萃取液濃縮至較小體積,用等體積的1% NaHCO3溶液洗滌三次。將水層用12 mol/L HCl調pH=2.5,用乙酸乙酯溶液萃取3次,合并萃取液,將合并的萃取液在45 ℃下蒸干,得到殘余物。將所得殘余物溶于5 mL甲醇中做TLC分析。制備分析薄層色譜板時,用熒光硅膠GF-254涂層,在乙酸乙酯∶石油醚(1∶1～20∶1,v/v)溶劑體系中點樣,在254 nm紫外光下標記F點,計算Rf值。選擇在薄層色譜板上能產生清晰而獨立點的溶劑體系,作為在硅膠柱中純化粗毒素的洗脫劑。

將5 mL粗毒素過15 mm×500 mm硅膠(200～300目)柱,該硅膠柱在105 ℃下活化并與石油醚預平衡,將粗毒素從硅膠柱頂端加入,用不同梯度的洗脫液洗脫。梯度洗脫液依次為:100%石油醚;石油醚∶乙酸乙酯=10∶1;石油醚∶乙酸乙酯=3∶1;石油醚∶乙酸乙酯=1∶1;100%乙酸乙酯;100%甲醇。洗脫的速度是0.25 mL/min,收集洗脫液于樣品瓶中,得到純化的毒素。將所得分離物在包含乙酸乙酯∶石油醚(1∶1～20∶1,v/v)的溶劑體系中點樣,在254 nm紫外光下標記F點,并計算Rf值。

1.3.5 立枯絲核菌毒素的生物活性測定 將純化的毒素在熒光硅膠GF-254薄層板上進行TLC分析,在紫外光(254 nm)下顯色的樣品進行生物活性評估。

立枯絲核菌毒素生物活性測定采用分離葉鞘生物測定[19]。將分離得到的毒素于45 ℃蒸干,稱重。將已知重量的毒素溶解到無菌蒸餾水中,配制200 μg/mL的溶液。在小麥3葉期,分離同一葉位的10個葉片,在葉片軸外的表面用消毒針輕輕地刺使其輕微受傷,將20 μL毒素溶液施加到傷口部位,置于實驗室條件下培養(yǎng)5 d,觀察病斑大小。每個實驗重復三次,用無菌蒸餾水處理的葉子作為對照。

1.3.6 立枯絲核菌代謝產物的鑒定

1.3.6.1 立枯絲核菌代謝產物的紫外全波長掃描 將分離得到的毒素在45 ℃下蒸干,溶解到甲醇中,對其進行紫外全波長掃描,純甲醇溶液作為參比液。

1.3.6.2 立枯絲核菌代謝產物的紅外光譜分析 采用KBr壓片法,將立枯絲核菌分離物I1在45 ℃下蒸干,用傅里葉變換紅外光譜儀對其進行紅外光譜掃描。

1.3.6.3 立枯絲核菌代謝產物的GC-MS分析 氣相色譜條件:氣相色譜和質譜型號分別為6890N GC system和5973 Mass selective,色譜柱型號為OV1701(0.25 mm×0.25 μm×60 m),溫度梯度為80～270 ℃,以15 ℃/min升溫至270 ℃保持10 min,載氣為氦氣(純度>99.999%),流速為1.0 mL/min,分流進樣:60∶1。

質譜條件:電離方式為EI,離子源溫度230 ℃;四級桿溫度150 ℃;接口溫度280 ℃;轟擊電壓為70 eV,掃描范圍為15～550 amu(m/z)。

應用標準圖庫(NIST05)通過計算機檢索系統(tǒng)進行物質的鑒定。

1.4 數據處理

采用SPSS Statistics 19.0和 Microcal Origin 7.5軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 立枯絲核菌的培養(yǎng)

立枯絲核菌在PSA培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)3 d和7 d后,發(fā)現隨著培養(yǎng)時間的增長,菌絲體顏色隨之發(fā)生變化。當立枯絲核菌培養(yǎng)3 d時,菌絲體的顏色是近似白色;而培養(yǎng)到7 d時菌絲體的顏色變?yōu)樯詈稚?/p>

2.2 立枯絲核菌代謝產物的提取及生物活性測定

將馬鈴薯塊莖接種培養(yǎng)12 d后,不同處理組溶液的植物毒性見表1。從表1中的數據可以看出,生長于理查德培養(yǎng)基上的立枯絲核菌培養(yǎng)濾液具有毒性;向培養(yǎng)濾液中加入甲醇、丙酮或乙醚后,只在水相部分檢測到毒性;而加入乙酸乙酯、苯或氯仿后,在水相和溶劑部分都檢測到毒性。由于乙酸乙酯與氯仿提取物的毒性主要存在于溶劑部分,且乙酸乙酯提取物的毒性顯著高于苯和氯仿提取物的毒性,所以本研究中選用乙酸乙酯從培養(yǎng)濾液中提取毒素,該毒素用乙酸乙酯萃取后,結合兩種層析步驟進行純化。

表1 立枯絲核菌培養(yǎng)濾液粗提物的植物毒性

注:莖潰瘍實驗0:無損害或無病變存在;1:輕微損傷(一個至幾個的病變大小小于5 mm);2:中度損傷(病變大小超過5 mm和一些環(huán)剝);3:嚴重損壞(大的病變范圍和環(huán)剝或大部分莖出現死亡);4:所有莖全部死亡。同列不同小寫字母代表數據差異顯著(p<0.05);LSD,最小顯著性差異。

2.3 立枯絲核菌代謝產物的分離及純化

為了獲得足夠多的生物活性化合物,將立枯絲核菌的菌絲體生長在一升理查德液體培養(yǎng)基中15～20 d。培養(yǎng)濾液用乙酸乙酯萃取后,濃縮乙酸乙酯萃取液得到一種淡黃色的粉末。將乙酸乙酯萃取液旋轉蒸發(fā)后,得到黃色的代謝產物,將其用TLC分析后,在薄層色譜板上點板,發(fā)現在石油醚/乙酸乙酯=1∶3(v/v)溶劑中,在紫外光(254 nm)下看見一個斑點,其Rf值為0.5。改變溶劑的極性,進行硅膠柱色譜分析。在硅膠柱層析中選擇5個片段進行收集,得到5個分離物I1、I2、I3、I4、I5。將5個分離物在用熒光硅膠GF-254涂層的硅膠板上點樣,在254 nm紫外光下可以看見獨立清晰的斑點,其Rf值見表2。

表2 五個立枯絲核菌分離物的薄層色譜分析結果

2.4 立枯絲核菌代謝產物的生物活性測定

在小麥葉片傷口施加立枯絲核菌分離物I1,培養(yǎng)7 d后,葉片傷口發(fā)現病變,傷口出現黃色現象;培養(yǎng)9 d后,傷口開始腐爛,并出現水珠;而用蒸餾水處理的對照組葉片傷口沒有發(fā)現病變。由分離葉鞘生物測定結果可以看出分離物I1能引起小麥葉片發(fā)生病變。

2.5 立枯絲核菌代謝產物的鑒定

2.5.1 立枯絲核菌代謝產物的紫外全波長掃描 立枯絲核菌分離物I1在甲醇中的紫外吸收光譜見圖1。從圖1中可以看出,分離物I1在甲醇中的最大吸光度在198.5 nm波長處。

圖1 立枯絲核菌分離物I1的紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of Rhizoctonia solani isolate I1

2.5.2 立枯絲核菌代謝產物的紅外光譜掃描 立枯絲核菌分離物I1的紅外光譜見圖2,從圖2可以看出,波數2927.41 cm-1和2856.06 cm-1處出現-CH2伸縮振動吸收峰,波數1735.62 cm-1出現了C=O(酯類)的伸縮振動吸收峰,波數1635.34 cm-1處出現的是C=C(苯)的伸縮振動吸收峰,波數1417.42 cm-1處出現-CH3彎曲振動吸收峰,波數1263.1 cm-1和1128.2 cm-1處屬于-C-O的伸縮振動吸收峰。從這些特征吸收峰可以推斷出I1是含有苯基的酯類物質。

圖2 立枯絲核菌分離物I1的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of the Rhizoctonia solani isolate I1

2.5.3 立枯絲核菌分離物的GC-MS分析 立枯絲核菌分離物I1的總離子流圖見圖3,對圖3中的總離子譜圖通過計算機檢索系統(tǒng)鑒定,按照相似度大于75%,峰面積大于500 000,得到立枯絲核菌代謝產物I1主要包含的物質見表3。結果表明,I1的主要物質有磷酸三丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、(甲氧基甲基)三苯基氯化磷,其中物質1與物質2可能為同分異構體。將檢測到的物質分別用其標準品進行驗證,將標準品溶解到甲醇溶液中進行GC-MS分析(其總離子流圖分別見圖4、圖5、圖6和圖7)。

圖3 立枯絲核菌分離物I1的總離子流圖Fig.3 Total ion current of Rhizoctonia solani isolate I1

圖4 磷酸三丁酯的總離子流圖Fig.4 Total ion current of tributyl phosphate

圖5 鄰苯二甲酸二異丁酯的總離子流圖Fig.5 Total ion current of diisobutyl phthalate

圖6 鄰苯二甲酸二丁酯的總離子流圖Fig.6 Total ion current of dibutyl phthalate

圖7 (甲氧基甲基)三苯基氯化磷的總離子流圖Fig.7 Total ion current of(methoxymethyl)triphenylphosphonium chloride

主要物質保留時間(min)化合物物質115 868磷酸三丁酯物質216 874磷酸三丁酯物質318 251鄰苯二甲酸二異丁酯物質418 757鄰苯二甲酸二丁酯物質519 903(甲氧基甲基)三苯基氯化磷

表4 標品GC-MS測定結果

I1包含的五種物質對應的結構式如下:

3 結論

以馬鈴薯塊莖發(fā)病程度為指標,優(yōu)化得出萃取毒素的最佳萃取劑為乙酸乙酯。通過柱色譜分離,得到5個立枯絲核菌分離物I1、I2、I3、I4、I5。分離葉鞘生物測定實驗結果表明立枯絲核菌分離物I1能使小麥葉片傷口發(fā)生病變。對I1進行紫外吸收、紅外吸收和GC-MS測定并用標準品進行驗證后,I1中的主要物質有磷酸三丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯和(甲氧基甲基)三苯基氯化磷幾種物質。

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Study on Rhizoctonia solani metabolites and biological activity in potato

ZHANG Hui-xiu1,LONG Hai-tao1,2,SUN Yan3,NIU Hong-yan1,PU Lu-mei1,2,*,QIU Hui-zhen4,*

(1.College of Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Institute of Agricultural Resources Chemistry and Application,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;3.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;4.College of Resources and Environmental Sciences,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

The Rhizoctonia solani metabolites in potato was investigated. Firstly,the culture filtrates of Rhizoctonia solani were extracted with different organic solvent and the biological activities of each fraction were examined. Then,the toxic components were purified with method of thin layer chromatography(TLC)and silica gel column chromatography. Finally,Rhizoctonia solani toxin was analyzed and identified by UV absorption spectrum,FT-IR spectra and Gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS). The results showed that the component extracted by ethyl acetate showed significantly higher toxicity than that extracted by chloroform. Five Rhizoctonia solani isolates(I1,I2,I3,I4,I5)were isolated by Silica gel column chromatography. The absorption bands of the UV spectrum suggested that I1had a higher absorption at 198.53 nm;The IR spectrum showed bands characteristic of -CH2(2927.41、2856.06 cm-1)、C=O(1735.62 cm-1)、C=C(1635.34 cm-1)、-CH3(1417.42 cm-1)and -C-O(1263.1、1128.2 cm-1)groups in I1;GC-MS analysis showed that I1mainly contains several substances of tributyl phosphate,diisobutyl phthalate,dibutyl phthalate and(methoxymethyl)triphenylphosphonium chloride.

potato;Rhizoctonia solani;metabolites;biological activity

2016-30-30

張慧秀(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：植物毒素，E-mail：18809440215@163.com。

*通訊作者:蒲陸梅(1968-)，女，博士，教授，研究方向：天然產物化學，E-mail：pulm@gsau.edu.cn。

國家自然地區(qū)科學基金項目(31360500)。

TS215

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000

邱慧珍(1961-)，女，博士，教授，研究方向：植物營養(yǎng)與根際生態(tài)調控，E-mail：hzqiu@gsau.edu.cn。