甘露糖對免疫性肝損傷小鼠的保護作用

譚建揚,宋夢楠,丁 虹,李曉斐

(武漢大學(xué)藥學(xué)院,湖北武漢 430072)

?

甘露糖對免疫性肝損傷小鼠的保護作用

譚建揚,宋夢楠,丁 虹,李曉斐

(武漢大學(xué)藥學(xué)院,湖北武漢 430072)

目的:研究甘露糖對卡介苗與脂多糖(Bacillus Calmette-Guérin,BCG/lipopolysaccharides,LPS)誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷的保護作用及作用機制。方法:將小鼠隨機分成正常組、模型組、甘露糖低劑量組(20 mg/kg)、甘露糖高劑量組(100 mg/kg),采取BCG聯(lián)合LPS誘導(dǎo)小鼠肝損傷。取肝臟、脾臟、胸腺,測定臟器指數(shù)。用試劑盒的方法分別檢測各組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)活力,丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、細胞白介素(interleukin-β,IL-β)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)與過氧化氫酶(catalase,CAT)活力,并取肝組織病理切片觀察。結(jié)果:與模型組相比,甘露糖可以顯著降低脾臟、胸腺指數(shù)、血清ALT、AST活性以及顯著提高TNF-α、IL-β、MDA、NO含量(p<0.05)和SOD、CAT活力(p<0.05)。其中甘露糖高劑量組(100 mg/kg)保護免疫性肝損傷的效果更好,趨近于正常組。結(jié)論:甘露糖對BCG/LPS誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷有很好的保護作用。

甘露糖,甘露糖受體,免疫性肝損傷,卡介苗,脂多糖,保肝

我國作為肝炎發(fā)生率高的國家,數(shù)據(jù)調(diào)查顯示,全球約20億人曾感染過HBV,其中3.5億人為慢性HBV感染者[1],大部分患者的肝有纖維化或硬化的趨勢,其中少部分甚至?xí)D(zhuǎn)變?yōu)楦伟2]。機體的異常免疫應(yīng)答是肝細胞損傷的重要原因[3,4],且免疫復(fù)合物又是引起肝外損傷的主要因素,因此免疫反應(yīng)在肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

甘露糖是目前僅有的一種用于臨床上的糖質(zhì)營養(yǎng)素[5]。它廣泛的分布機體的神經(jīng)、肝[6]、睪丸、視網(wǎng)膜和腸。甘露糖能被機體直接用于糖蛋白的合成,有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、增加傷口愈合、抗發(fā)炎等生理作用。此外也有相關(guān)文獻報道,甘露糖可以抑制巨噬細胞的炎癥,保護脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷[7]。甘露糖受體屬于C型凝集素超家族[8],它可以與特定的糖類分子相結(jié)合,從而揮發(fā)識別病原體、遞呈抗原、保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用[9-10]。本研究采用的BCG/LPS聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷模型,其在病理變化和病理生理機制上與人類肝炎相似[10,14],主要表現(xiàn)為巨噬細胞、枯否細胞大量聚集在肝臟并致敏[15]。致敏的巨噬細胞進一步被LPS激活而釋放包括氧自由基、NO、白介素等細胞毒性介質(zhì),從而激活了凋亡通路、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激等生物效應(yīng)導(dǎo)致肝細胞損傷[16-17]?；谝陨峡紤],本研究利用BCG/LPS致小鼠肝損傷模型[11-12],探討了甘露糖對免疫性肝損傷的保護作用及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘露糖 鄭州鄭亞化工產(chǎn)品有限公司,純度99%;40只昆明種HM小鼠 體重(20±2) g,雌性,購自湖北省實驗動物研究中心,動物合格證號:42000600010207;卡介苗 衛(wèi)生部上海生物箭晶研究所;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST),丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、細胞白介素(interleukin-β,IL-β)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒 南京建成生物工程研究所;脂多糖 美國Sigma公司。

UV-102-02FW紫外可見分光光度計 日本島津公司;2032自動柱層析儀 瑞典LKB公司;XK/1216半自動生化分析儀 四川旭康醫(yī)療電器有限公司;HPIAS系列高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng) 華海醫(yī)療信息技術(shù)股份有限公司。

表2 小鼠肝、脾臟、胸腺指數(shù)(n=10)

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠免疫性肝損傷模型的建立 將40只小鼠隨機分成4個組(各組體重?zé)o顯著差異),分別為正常組、BCG/LPS肝損傷模型組、甘露糖低劑量組(20 mg/kg)、甘露糖高劑量組(100 mg/kg),每組10只。造模第1 d[13],模型組、甘露糖高、低劑量組小鼠均通過尾靜脈注射BCG2.5 mg/0.2 mL只致敏,正常組小鼠注射等量的生理鹽水。3 h后,甘露糖高、低劑量組分別灌胃甘露糖20、100 mg/kg bw,正常組、模型組灌胃等量生理鹽水,連續(xù)給藥15 d,最后1次給甘露糖后,除正常組外,各組經(jīng)尾靜脈注射LPS 7.5 μg/0.2 mL/只,誘導(dǎo)小鼠肝損傷(甘露糖對小鼠體重?zé)o顯著影響)。

1.2.2 肝臟、脾臟、胸腺指數(shù)的測定 將小鼠經(jīng)尾注射LPS 16 h后,采用眼眶取血的方法采集血液。完成采血后立即處死小鼠,并解剖取出其肝臟、脾臟、胸腺于4 ℃生理鹽水中洗凈,待濾紙拭干后,于天平稱重,記錄,并按以下公式計算肝臟、脾臟、胸腺指數(shù)。

1.2.3 生化指標(biāo)檢測 將采集的血液進行分離,取其血清,按照試劑盒說明書分別測定血清中的ALT、AST活力。取肝臟右葉組織,剔除結(jié)締組織,于4 ℃生理鹽水中洗凈,濾紙拭干后,按1∶9(W/V)的生理鹽水比例制備肝勻漿[7],遵照試劑盒使用說明書的方法,分別測定肝組織中MDA、NO、TNF-α、IL-β的含量及SOD、CAT活力。

1.2.4 組織病理學(xué)檢查 取肝臟左葉組織于10%中性福爾馬林中固定。制備病理切片并用HE染色后,于光鏡下對肝組織切片的組織病理學(xué)變化進行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露糖對BCG/LPS致肝損傷小鼠體重的影響

小鼠隨機分組時,模型組和正常組,甘露糖高、低劑量組與模型組之間體重均無顯著性差異。連續(xù)給予甘露糖15 d后,與模型組比較,甘露糖低劑量組體重顯著減低((p<0.01),甘露糖高劑量組體重?zé)o顯著性差異,表明甘露糖高劑量可能有利于維持體重的正常。

表1 小鼠體重(n=10)

注:與正常組相比,#p<0.05,##p<0.01;與模型組相比,*p<0.05,**p<0.01;表2～表6。

2.2 甘露糖對BCG/LPS致肝損傷小鼠肝臟、脾臟、胸腺指數(shù)的影響

表2中實驗數(shù)據(jù)顯示,與正常組相比,免疫性肝損傷模型組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著提高(p<0.05),說明造模成功。與模型組相比,甘露糖高、低劑量組均可抑制三者的升高,并顯示出效果逐漸增強的趨勢,特別是甘露糖高劑量組能夠顯著減低脾臟和胸腺指數(shù)(p<0.05)。

2.3 甘露糖對BCG/LPS致肝損傷小鼠血清中ALT、AST活性的影響

表3中實驗數(shù)據(jù)顯示,模型組的小鼠血清中ALT活性顯著地高于正常對照組(p<0.05),AST活性極顯著高于正常對照(p<0.01),說明造模成功。與模型組相比,甘露糖高劑量組ALT、AST活性下降均達顯著水平(p<0.05),且數(shù)值接近正常組的水平;甘露糖低劑量組ALT活性也下降到顯著水平(p<0.05),AST活性呈幅度下降。

表3 小鼠血清中ALT、AST的活性(n=10)

2.4 甘露糖對BCG/LPS致肝損傷小鼠血清中MDA、NO含量和SOD、CAT活性的影響

由表4、5可知,正常組與模型組的MDA、NO含量和SOD、CAT活性差異顯著(p<0.01～0.05),進一步說明本實驗的造模成功。高劑量甘露糖組MDA含量較模型組存在極顯著差異(p<0.01)。同時,SOD、CAT活性呈現(xiàn)顯著上升且趨近正常組水平,NO含量顯著下降(p<0.05)。低劑量甘露糖組對BCG/LPS致肝損傷小鼠血清中的MDA含量和SOD、CAT活力均無改善現(xiàn)象。

表4 小鼠血清中MDA、NO的含量(n=10)

表5 小鼠血清中SOD、CAT的活力(n=10)

2.5 甘露糖對血清中TNF-α和IL-β含量的影響

表6中實驗數(shù)據(jù)顯示,與正常組相比,免疫性肝損傷模型組的TNF-α、IL-β的含量均極顯著提高(p<0.01),說明造模成功。與模型組相比,甘露糖高低劑量組均可降低二者的含量,并隨濃度的增加而增強,特別是甘露糖高劑量組能夠顯著減低TNF-α、IL-β的含量(p<0.05)。

表6 小鼠肝組織中TNF-α、IL-β的含量(n=10)

2.6 肝組織病理學(xué)檢查

由圖1可見,正常組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)完整,肝小葉、肝索結(jié)構(gòu)正常,間質(zhì)無炎細胞浸潤,細胞未見脂肪變性和玻璃樣變;模型組肝細胞局部壞死明顯,并有較多炎細胞浸潤,脂肪變性和玻璃樣變;甘露糖低劑量組存在少量炎性細胞浸潤,無明顯細胞壞死;甘露糖高劑量組,形態(tài)較為正常,僅極少量細胞有玻璃樣變。隨甘露糖劑量的增大,對肝臟的保護作用也隨之增強,其中高劑量的甘露糖對肝臟具有較好的保護作用。

圖1 甘露糖對BCG/LPS致肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響(100X)Fig.1 Effect of mannose on histopathology of liver of mouse injured by BGC+LPS

3 結(jié)論與討論

據(jù)有關(guān)研究,LPS可以誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生自由基,對肝細胞造成過氧化損傷,使得肝組織中的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和CYP450酶系遭到破壞[18]。胞膜通透性改變,會引起原細胞內(nèi)容物濃度的失衡,引發(fā)肝細胞損傷、壞死。ALT、AST是肝細胞漿內(nèi)的兩種可溶性酶,通過血清中ALT、AST含量的高低反映肝細胞損傷程度。機體細胞受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度可以通過MDA的含量高低來間接反映,機體清除氧自由基保護細胞不受損傷的能力可以以SOD活力的高低來體現(xiàn)[19]。肝細胞也可以經(jīng)特異性細胞因子及LPS協(xié)同誘導(dǎo),持續(xù)產(chǎn)生大量的NO,介導(dǎo)多種病理生理效應(yīng)。

另外閱讀文獻可知,肝損傷的模型中介導(dǎo)肝損傷的主要介質(zhì)是TNF-α,它促使如NO、IL-1、IL-6等與肝壞死有關(guān)的介質(zhì)生成,IL-1等又增強了TNF-α的肝損傷作用,所以即使少量存在TNF-α,宿主也會發(fā)生組織損傷[20]。甘露糖能抑制TNF-α和IL-βmRNA的合成和炎癥因子蛋白的釋放,且其抗炎效應(yīng)可以通過甘露糖受體(mannose receptor,MR)實現(xiàn)[8]。由此我們可以推測甘露糖對免疫性肝損傷的保護可能與MR有關(guān)。

本研究結(jié)果表明,與模型組比較,甘露糖高劑量組(100 mg/kg)對小鼠血清ALT、AST有明顯的降低作用,對肝細胞具有保護作用;也可以減少MDA和NO的含量并提高SOD、CAT的活力,說明甘露糖可直接清除體內(nèi)過剩自由基和脂質(zhì)過氧化物,或者增強SOD活力增強抗氧化作用,有效防止或減輕自由基導(dǎo)致的氧化損傷,增強免疫。通過肝臟指數(shù)與病理切片也證實了甘露糖對肝細胞的保護作用。我們也對TNF-α和IL-β的含量進行檢測以此探究甘露糖保護免疫性肝損傷的機制,實驗結(jié)果證明甘露糖高低劑量組的TNF-α和IL-β含量都明顯低于模型組。

綜上甘露糖對免疫性肝損傷小鼠具有較好的保護作用,其作用機制可能是甘露糖與MR結(jié)合后,MR參與受體介導(dǎo)的吞噬作用和內(nèi)吞作用來抑制TNF-α、IL-β的釋放,進而保護肝細胞,具體機制還需進一步探究。

[1]丁善龍,王杰,魯鳳民. 乙型肝炎研究及我國防治現(xiàn)狀[J]. 傳染病信息,2013,26(6):369-372.

[2]程啟閏,方海明,李芳群,等. 貫葉連翹提取物對小鼠急性免疫性肝損傷的保護作用[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2015,50(4):477-480.

[3]Herkel J,Schuchmann M,Tiegs G,et al. Immune-medicated liver injury[J]. J Hepatol,2005,42(6):920-923.

[4]Della Corte C,Sartorelli MR,Comparcola D,et al. Autoimmune liver diseases[J]. Minerva Pediatr,2012,64(6):595-606.

[5]魏歡平,李翠,羅罡,等. 鐵皮石斛不同階段多糖和甘露糖含量研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報,2014,20(20):29-31.

[6]郭林娜,高恒宇,何苗,等. 甘露糖受體在肝細胞癌中的表達及意義[J]. 世界華人消化雜志,2016,24(1):37-43.

[7]徐旋里. 甘露糖對急性肺損傷的保護作用及其通過甘露糖受體抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥[D]. 杭州:浙江大學(xué),2008.

[8]張培,周建英,徐旋里. 甘露糖受體與臨床相關(guān)性研究進展[J]. 國際病理科學(xué)與臨床雜志,2013,33(4):361-364. DOI:

10.3969/j.issn.1673-2588.2013.04.017

[9]劉小玲,曾令兵. 甘露糖受體結(jié)構(gòu)、功能、表達和應(yīng)用研究的新進展[J]. 水產(chǎn)學(xué)雜志,2013,26(1)54-59.

[10]Wang GS,Liu GT. Role of nitric oxide in immunological liver damage in mice[J]. Biochem pharmacol,1995,49(9):1277-81.

[11]Zhang NN,Huang NY,Zhou XK,et al. Protective effects of IL-4 on Bacillus Calmette-Guerin and lipopolysaccharide induced immunological liver injury in mice[J]. Inflamm Res,2012,61(1):17-26.

[12]Jiang C,Jiao Y,Chen X,et al. Preliminary characterization and potential hepatoprotective effect of polysaccharides from Cipangopaludina chinensis[J].Food Chem Toxicol,2013,59():18-25.

[13]石燕玲,何慧,張勝. 靈芝肽對免疫性肝損傷小鼠的保護作用[J]. 食品科學(xué),2008,29(6):415-418.

[14]王根生,劉耕陶. 一氧化氮在小鼠肝損傷中的作用[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志,1996,76(3):203-6.

[15]Ferluga J,Allison AC. Role of mononuclear infiltrating cells in pathogenesis of hepatitis[J]. Lancet,1978,312(8090):610-611.

[16]Calvo JR,Reiter RJ,Garcia JJ. Characterization of the protective effects of metalonin and related indoles against alpha-naphthyl isothiocyanate-induced liver injury in rats[J]. J Cell Biochem,2001,80(4):461-470.

[17]李天一,汪麗佩,吳國琳. 黃芪多糖對免疫性肝損傷小鼠免疫調(diào)節(jié)的影響[J]. 中國中醫(yī)急癥 2014,23(1):25-27.

[18]Nicoletti F,Beltrami B,et al. Protection from concanavalin A(Con A)-induced T cell-dependent hepatic lesions and modulation of cytokine release in mice by sodium fusidate[J]. Clin Exp Immuol,1997,110(3):479-484.

[19]陳方軍,李俊,王佳佳. 玉屏風(fēng)多糖對小鼠化學(xué)性肝損傷的影響[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2011,46(1):49-52.

[20]李晶媛,李樹臣,楊維良. TNF-α誘導(dǎo)肝細胞凋亡機制的回顧與展望[J]. 世界華人消化雜志,2007,15(6):606-611.

Hepatoprotective effects of mannose on immunological liver injury in mice

TAN Jian-yang,SONG Meng-nan,DING Hong*,LI Xiao-fei*

(School of Pharmaceutical Science,Wuhan University,Wuhan 430072,China)

Objective:The hepatoprotective effects of mannose and possible mechanism were researched on BCG/LPS-induced immunological liver injury in mice. Method:Mice were divided into four groups,namely control,model and two mannose-treated groups. BCG and LPS were used to induce the immunity hepatic injury model of mice in the experiment. Blood,liver and organs were sampled for detection of biochemical and immunological index,and the pathological changes of liver. Results:The index of liver,spleen and thymus,ALT/AST activities in serum and NO/MDA/TNF-α/IL-βlever in serum from the mannose group significantly lower than model group’s. Mannose significantly reduces of SOD and CAT activity in liver(p<0.05). The dose of 100 mg/kg bw mannose hepatoprotective had the best effectand the index was close to blank group. Conclusion:Mannose has hepatoprotective effects against BCG/LPS-induced liver damage in mice.

mannose;mannose receptor;immunological liver damage;Bacillus Calmette-Guérin(BCG);lipopolysaccharides(LPS);hepatoprotective effect

2016-03-11

譚建揚(1994-)，男，本科,研究方向：藥理毒理學(xué)，E-mail：2013302290006@whu.edu.cn。

*通訊作者:丁虹(1964-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail：dinghong1106@whu.edu.cn。

TS201.4

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000

李曉斐(1993-)，女，碩士，研究方向：藥理毒理學(xué)，E-mail：13080664601@163.com。