限食條件下下丘腦神經(jīng)肽基因表達(dá)量對(duì)中緬樹鼩體質(zhì)量調(diào)節(jié)的影響

朱萬龍, 陳金龍, 葉芳艷, 左木林, 張浩

(1.云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明650500；2.昆明市海口林場(chǎng)，昆明650114)

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限食條件下下丘腦神經(jīng)肽基因表達(dá)量對(duì)中緬樹鼩體質(zhì)量調(diào)節(jié)的影響

朱萬龍1*, 陳金龍2, 葉芳艷1, 左木林1, 張浩1

(1.云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明650500；2.昆明市?？诹謭?chǎng)，昆明650114)

為闡明中緬樹鼩Tupaiabelangeri下丘腦神經(jīng)肽基因表達(dá)量在限食條件下的體質(zhì)量調(diào)節(jié)作用，本研究測(cè)定了限食(正常攝食量的80%)條件下中緬樹鼩的體質(zhì)量、體脂含量、血清瘦素濃度以及神經(jīng)肽Y(NPY)、刺鼠相關(guān)蛋白(AgRP)、阿片促黑色素原(POMC)和可卡因-安他非明轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)肽(CART)表達(dá)量。結(jié)果表明：限食極顯著降低中緬樹鼩的體質(zhì)量和體脂含量(P<0.01)。對(duì)照組和限食組的血清瘦素濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，血清瘦素濃度與體脂含量呈正相關(guān)。下丘腦神經(jīng)肽基因NPY、AgRP、POMC和CART表達(dá)量差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。以上結(jié)果表明限食可以降低中緬樹鼩的體質(zhì)量、體脂含量和血清瘦素濃度，調(diào)整下丘腦神經(jīng)肽基因表達(dá)量。瘦素通過調(diào)節(jié)NPY/AgRP和POMC/CART表達(dá)量來調(diào)節(jié)中緬樹鼩的體質(zhì)量。

食物限制；下丘腦神經(jīng)肽；中緬樹鼩

生理和行為的可塑性對(duì)小型哺乳動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境變化起著重要的作用(Vezina & Williams，2003)。已有研究表明：在長時(shí)間尺度上，動(dòng)物器官的形態(tài)和功能與持續(xù)耗能有關(guān)，而在短時(shí)間尺度上與動(dòng)物的有氧運(yùn)動(dòng)能力有關(guān)(Speakman & McQueenie，1996；Derting & Austin，1998)。在不可預(yù)測(cè)的自然環(huán)境中，食物資源的可利用性對(duì)于動(dòng)物的生存至關(guān)重要(Liang & Zhang，2006)，動(dòng)物在環(huán)境改變(包括食物資源的改變)的條件下會(huì)調(diào)整自身的體質(zhì)量、食物攝入量和能量支出，但是最近的研究表明食物攝入量對(duì)動(dòng)物的體質(zhì)量和能量平衡的影響是不一致的(Zhao & Cao，2009)，如食物限制可以降低大鼠的體質(zhì)量(Sucajtys-Szulcetal.，2008)，但對(duì)小鼠的體質(zhì)量卻沒有影響(Hambly & Speakman，2005)，因此，在短時(shí)間尺度上研究食物資源的改變對(duì)于動(dòng)物能量穩(wěn)態(tài)的可塑性并不清楚。

瘦素對(duì)小型哺乳動(dòng)物的能量攝入和能量支出有著重要的調(diào)節(jié)作用(Friedman & Halaas，1998)。許多研究表明瘦素與脂肪含量存在正相關(guān)關(guān)系(Zhuetal.，2011，2012)。此外，還有研究表明食物限制可以降低小型哺乳動(dòng)物的血清瘦素濃度(Klingensporetal.，2000；Rousseauetal.，2003)。下丘腦神經(jīng)肽在限食條件下對(duì)于動(dòng)物的生存也很重要。研究表明喂以高脂食物，可以使大鼠的神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)表達(dá)量和體質(zhì)量顯著增加(Toshihiro & Akio，2001)；長期的饑餓使大鼠下丘腦的NPY表達(dá)量增加(Sucajtys-Szulcetal.，2008)；哺乳期的大鼠在限食條件下較自由取食組的NPY表達(dá)量顯著增加(Abizaidetal.，1997)。長期的饑餓使得實(shí)驗(yàn)組綿羊的體質(zhì)量、體脂含量顯著下降，而刺鼠相關(guān)蛋白(agouti aelated peptide，AgRP)表達(dá)量則顯著增加，阿片促黑色素原(pro-opiomelanocortin，POMC)和可卡因-安他非明轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide，CART)表達(dá)量顯著降低(Henryetal.，2001)；在限食的條件下，肥胖型大鼠比健康型大鼠的AgRP表達(dá)量增加(Harroldetal.，1999)；同時(shí)在食物短缺的條件下，西伯利亞倉鼠Phodopussungorus會(huì)增加AgRP表達(dá)量以維持能量穩(wěn)態(tài)(Merceretal.，2000)。也有研究表明高脂食物可以顯著增加大鼠的體質(zhì)量、瘦素濃度和胰島素含量，但對(duì)POMC表達(dá)量沒有影響(Marcoetal.，2013)，而長期喂食高脂食物的大鼠，其后代的POMC表達(dá)量較對(duì)照組明顯上調(diào)(Lukaszewskietal.，2013)。此外，禁食也可以使大鼠的CART表達(dá)下降(Tianetal.，2004)。48 h的饑餓使小鼠的CART表達(dá)下降，食欲增加(Yooetal.，2011)。

中緬樹鼩Tupaiabelangeri為東洋界特有種。之前的研究表明，短期的禁食和重喂食可以改變中緬樹鼩的體質(zhì)量、瘦素濃度、產(chǎn)熱能力和相關(guān)生化指標(biāo)(Gaoetal.，2014)，中緬樹鼩的體質(zhì)量、能量代謝和下丘腦神經(jīng)肽基因表達(dá)量具有季節(jié)性變化(朱萬龍等，2014)，低溫會(huì)影響中緬樹鼩的NPY、POMC和CART表達(dá)量(張浩等，2015)。因此，本研究在以上研究基礎(chǔ)上從神經(jīng)水平來探討下丘腦神經(jīng)肽基因是如何調(diào)節(jié)限食條件下中緬樹鼩的體質(zhì)量和能量代謝，同時(shí)闡明瘦素是如何作用于下丘腦神經(jīng)肽基因。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來源

中緬樹鼩于2014年6月捕自云南省昆明市祿勸地區(qū)，捕捉后帶回云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(昆明)動(dòng)物飼養(yǎng)房單盒飼養(yǎng)，中度光照(12L∶12D)，溫度控制在25 ℃±1 ℃，自由取食和飲水。

1.2 動(dòng)物處理

所捕中緬樹鼩為非繁殖期成年個(gè)體。選取18只(10♀，8♂)隨機(jī)分為2組：對(duì)照組(n=8)，自由取食和飲水；限食組(n=10)，食物量為每日取食量的80%，自由飲水。25 ℃，12L∶12D條件下馴化4 周。第0天和第28天測(cè)定體質(zhì)量和食物攝入量，28 d后處死，測(cè)定體脂含量、下丘腦神經(jīng)肽基因表達(dá)量及血清瘦素濃度。實(shí)驗(yàn)前，對(duì)照組和限食組中緬樹鼩的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.3 體脂含量的測(cè)定

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中緬樹鼩于實(shí)驗(yàn)28 d后處死。體脂含量用索氏抽提法(SoxtecTM2043型浸提儀，福斯中國有限公司)測(cè)定(Gaoetal.，2014)。去除尸體內(nèi)臟，保留消化道上的脂肪，置于烘箱中至恒重(60 ℃)，小型粉碎機(jī)將樣品粉碎混勻，稱取2 g左右用干燥濾紙包嚴(yán)、烘干、稱重，此時(shí)的質(zhì)量記為a，放入含50%～67%體積乙醚的抽提瓶中，濾紙包的高度低于虹吸管，水浴(70 ℃)加熱、回流，乙醚回流次數(shù)控制在每小時(shí)120～150滴，回流時(shí)間約5 h，抽提完畢，取出的濾紙烘干、稱重，此時(shí)的質(zhì)量記為b。樣品中的體脂含量=a-b。

1.4 血清瘦素濃度測(cè)定

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中緬樹鼩于實(shí)驗(yàn)28 d后處死取血，4 ℃靜置1 h后于4 ℃ 4 000 r·min-1離心30 min，取上層血清置于-80 ℃超低溫冰箱保存。血清瘦素濃度采用瘦素放射免疫分析試劑盒(美國Linco公司)進(jìn)行測(cè)定(朱萬龍等，2014)。

1.5 下丘腦神經(jīng)肽表達(dá)量測(cè)定

中緬樹鼩的下丘腦總RNA參照高純總RNA快速抽提試劑盒(BioTeke Co.)提供的方法進(jìn)行提取與純化。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的純度和完整性。提取和純化的RNA置于-80 ℃保存。cDNA第一鏈的合成以下丘腦總RNA為模板，oligo(dT)18為反轉(zhuǎn)錄引物，按照M-MLV Frist Strand Kit試劑盒(Invitrogen Co.)方法進(jìn)行。反應(yīng)體系為：RNA模板8 μL，10 mM dNTP 1 μL，Oligo(dT) 1 μL，0.1 M DTT 2 μL，5×第一鏈合成緩沖液4 μL，M-MLV 1 μL，RNase ddH2O 3 μL，總反應(yīng)體系20 μL。反應(yīng)完畢后，-20 ℃保存。NPY、AgRP、POMC、CART基因cDNA核心序列擴(kuò)增的引物參照朱萬龍等(2014)。

以上述cDNA第一鏈為模板進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)體系總體積25 μL，其中模板DNA (10 ng·μL-1) 1 μL，25 mmol·L-1MgCl22 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶(4 U·μL-1) 0.5 μL，ddH2O 16 μL，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，54 ℃～56 ℃退火60 s，72 ℃ 延伸90 s，37個(gè)循環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

采用ABI-7000TM熒光定量PCR(FQ-PCR)儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)擴(kuò)增模板cDNA，并檢測(cè)熒光信號(hào)。FQ-PCR反應(yīng)體系總體積20 μL，其中模板1.8 μL，KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2×) 10 μL，上、下游引物(200 nM)各0.4 μL，Rox Low 0.4 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，30個(gè)循環(huán)；熔解曲線階段95 ℃變性15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s。

采用比較CT值法(2-ΔΔCT法)計(jì)算相對(duì)定量，公式為：①改變的倍數(shù)(fold-change)=2-ΔΔCT；②ΔΔCT=(CT靶基因-CT內(nèi)參)處理組-(CT靶基因-CT內(nèi)參)未處理組。對(duì)于對(duì)照組樣本，ΔΔCT=0，2-△△CT=1，對(duì)于實(shí)驗(yàn)組樣本，如果2-△△CT>1，說明該基因表達(dá)量增加，如果2-△△CT<1，則說明該基因表達(dá)量下降。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，符合參數(shù)檢驗(yàn)條件。不同性別中緬樹鼩的生理指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，合并所有數(shù)據(jù)。體質(zhì)量、體脂含量、血清瘦素濃度和下丘腦表達(dá)量的組間差異均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。血清瘦素濃度與體脂含量的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量和體脂含量

實(shí)驗(yàn)前對(duì)照組和限食組中緬樹鼩體質(zhì)量分別為121.35 g±2.21 g和122.03 g±2.17 g，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1,16=-0.124，P>0.05)。28 d后，2組體質(zhì)量差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1,16=4.21，P<0.01，圖1)，限食組的體質(zhì)量較對(duì)照組降低了16.94%。2組的體脂含量在28 d后差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1,16=3.56，P<0.01，圖2)，對(duì)照組和限食組中緬樹鼩體脂含量分別為6.54 g±0.58 g和3.24 g±0.26 g，限食組的體脂含量較對(duì)照組降低了50.46%。

圖1 限食條件下中緬樹鼩的體質(zhì)量變化

*P<0.05,**P<0.01; 下同; the same below.

圖 2 限食條件下中緬樹鼩的體脂含量變化

2.2 血清瘦素濃度和下丘腦表達(dá)量

2組中緬樹鼩的血清瘦素濃度在28 d后差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1,16=2.13，P<0.05，圖3)，限食組較對(duì)照組降低了32.61%。瘦素濃度與體脂含量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.54，P<0.05)。限食條件下，2組中緬樹鼩下丘腦神經(jīng)肽基因NPY、AgRP、POMC和CART表達(dá)量差異均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(NPY：t1,16=-4.32，P<0.01；AgRP：t1,16=-6.03，P<0.01；POMC：t1,16=2.95，P<0.01；CART：t1,16=2.61，P<0.01，圖4)。

圖3 限食條件下中緬樹鼩的血清瘦素濃度變化

圖4 限食條件下中緬樹鼩的下丘腦神經(jīng)肽基因的表達(dá)量變化

3 討論

在不同食物數(shù)量或質(zhì)量的馴化條件下，小型哺乳動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)顯著的體質(zhì)量變化(Zhang & Wang，2008)。研究表明體質(zhì)量的改變程度受食物限制程度的影響：如果限食程度較小，動(dòng)物可以維持能量穩(wěn)態(tài)和體質(zhì)量平衡，這主要是通過增加消化道吸收能力，調(diào)整產(chǎn)熱和降低活動(dòng)行為；相反，如果限食程度較大，動(dòng)物就不能維持能量穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致體質(zhì)量下降(Sucajtys-Szulcetal.，2008)。在本研究中，中緬樹鼩的體質(zhì)量在限食組顯著降低，這與昆明小鼠的研究結(jié)果一致(Zhaoetal.，2009)。限食對(duì)中緬樹鼩的體脂含量影響差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明中緬樹鼩在限食條件下需要?jiǎng)訂T脂肪去彌補(bǔ)食物不足導(dǎo)致的產(chǎn)熱。在限食條件下中緬樹鼩的體質(zhì)量和體脂含量降低的程度高于溫度馴化實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果(張浩等，2015)，而與季節(jié)性馴化的結(jié)果相似(朱萬龍等，2014)，說明中緬樹鼩在野外對(duì)于食物的敏感性高于溫度，這可能和其分布有關(guān)：中緬樹鼩主要棲息在熱帶亞熱帶地區(qū)，環(huán)境溫度較高，因此對(duì)溫度的敏感度低。

瘦素在小型哺乳動(dòng)物體質(zhì)量調(diào)節(jié)中有重要作用(Abelendaetal.，2003)?！爸|(zhì)理論”認(rèn)為血清瘦素水平可以反映體脂含量(Schneideretal.，2000)。本研究結(jié)果表明瘦素濃度和體脂含量呈正相關(guān)，支持瘦素可以作為一個(gè)脂類信號(hào)分子(Zhao & Wang，2006)。下丘腦神經(jīng)肽基因作為調(diào)節(jié)體質(zhì)量的影響因素，其中NPY和AgRP為促食類神經(jīng)肽，其表達(dá)量的增加使動(dòng)物食欲增加，從而增加食物攝入量，導(dǎo)致體質(zhì)量增加，相反，POMC和CART為厭食類神經(jīng)肽，其表達(dá)量的增加會(huì)降低動(dòng)物食欲，使食物攝入量減少，體質(zhì)量下降。之前的研究表明：不同的食物質(zhì)量和數(shù)量可以改變大鼠的NPY表達(dá)量和體質(zhì)量(Toshihiro & Akio，2001；Sucajtys-Szulcetal.，2008)；在限食條件下，哺乳期的大鼠較自由取食組的NPY表達(dá)量顯著增加(Abizaidetal.，1997)。長期限食使動(dòng)物的體質(zhì)量、體脂含量顯著下降，而AgRP表達(dá)量則增加，POMC和CART的表達(dá)量顯著降低(Henryetal.，2001)；在食物限制的條件下，大鼠和西伯利亞倉鼠的AgRP表達(dá)量也會(huì)增加(Harroldetal.，1999；Merceretal.，2000)。但也有研究表明高脂食物可以顯著增加大鼠的體質(zhì)量、瘦素濃度，但對(duì)POMC表達(dá)量的影響差異不顯著(Marcoetal.，2013)，而長期喂食高脂食物的大鼠，它們的后代POMC表達(dá)量較對(duì)照組的顯著上調(diào)(Lukaszewskietal.，2013)。此外，禁食也可使大鼠和小鼠的CART表達(dá)下降(Tianetal.，2004；Yooetal.，2011)。本研究結(jié)果表明：限食條件下中緬樹鼩的下丘腦神經(jīng)肽基因表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明中緬樹鼩在限食環(huán)境下，通過增加NPY和AgRP表達(dá)量增加食欲，降低產(chǎn)熱，從而維持生存。在限食條件下，由于食物不足，POMC和CART表達(dá)量降低，有利于增加食物攝入。瘦素通過參與NPY/AgRP和POMC/CART通路調(diào)節(jié)中緬樹鼩的體質(zhì)量和能量代謝。通過比較限食條件和溫度馴化的結(jié)果(張浩等，2015)，可以看出瘦素濃度和下丘腦神經(jīng)肽基因表達(dá)量對(duì)食物的敏感性更高，這和體質(zhì)量變化趨勢(shì)一致。但考慮到瘦素和NPY、AgRP、POMC、CART四類神經(jīng)肽均和食物攝入有關(guān)，因此在野外環(huán)境條件下，中緬樹鼩受哪個(gè)因子的作用更強(qiáng)，有待于進(jìn)一步的研究。

綜上所述，中緬樹鼩在限食條件下通過降低體質(zhì)量、體脂含量和血清瘦素濃度來維持生存，下丘腦神經(jīng)肽基因NPY和AgRP表達(dá)量顯著增加，而POMC和CART表達(dá)量顯著降低。以上結(jié)果表明食物是影響中緬樹鼩體質(zhì)量調(diào)節(jié)的重要因素，瘦素在限食條件下通過調(diào)節(jié)下丘腦神經(jīng)肽基因的表達(dá)量來調(diào)節(jié)其能量穩(wěn)態(tài)。

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4.2 隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，不同混合青貯中主要微生物的數(shù)量均呈逐步減少的趨勢(shì)，發(fā)酵至第11 d時(shí)，25%的青貯飼料中乳酸菌達(dá)到最高峰；50%、75%、100%的青貯飼料中乳酸菌數(shù)量在第20 d時(shí)達(dá)到高峰。之后乳酸菌數(shù)量緩慢下降，75%的青貯飼料中乳酸菌數(shù)量下降較慢且數(shù)量最多。綜上所述，75%的青貯飼料有利于甜高粱混貯飼料的制作。

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Effects of Hypothalamic Neuropeptide Genes Expression on Body Mass Regulation ofTupaiabelangeriunder Food Restriction

ZHU Wanlong1*, CHEN Jinlong2, YE Fangyan1, ZUO Mulin1, ZHANG Hao1

(1.Key Laboratory of Ecological Adaptive Evolution and Conservation on Animals-Plants in Southwest Mountain Ecosystem of Yunnan Province Higher Institutes College, School of Life Sciences，Yunnan Normal University, Kunming 650500, China;2.Haikou Forest Farm of Kunming, Kunming 650114, China)

The aim of this study was to examine the effects of hypothalamic neuropeptide genes expression on body mass regulation ofTupaiabelangeriunder food restriction.Body mass, body fat mass, serum leptin level and the expression of hypothalamic neuropeptide genes including neuropeptide Y (NPY), agouti aelated peptide (AgRP), pro-opiomelanocortin (POMC), cocaine and amphetamine regulated transcript (CART) were measured inT.belangeri.The results showed that the body mass and body fat mass were extreme significantly decreased under food restriction (P<0.01).Significant difference of serum leptin level was observed between control group and food restriction group (P<0.05), and the variation of serum leptin levels showed a positive correlation with body fat mass (P<0.05).The expression levels of hypothalamic neuropeptide NPY, AgRP, POMC and CART were extreme significantly different between the two groups (P<0.01).All of the results suggested that food restriction could reduce body mass, body fat mass and serum leptin level, and regulate the expression of hypothalamic neuropeptide genes.Leptin may adjust body mass by regulating the expression of hypothalamic neuropeptide genes of NPY/AgRP and CART/CART inT.belangeri.

food restriction; hypothalamic neuropeptide;Tupaiabelangeri

2016-01-04 接受日期：2016-01-30 基金項(xiàng)目：國家國際科技合作項(xiàng)目(No.2014DFR31040); 十二五國家支撐計(jì)劃(No.2014BAI01B00); 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31360096); 云南師范大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目

朱萬龍(1983—), 男, 副教授, 主要從事動(dòng)物生理生態(tài)研究

*通信作者Corresponding author，E-mail：zwl_8307@163.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160002

Q427; Q95-33

A

1000-7083(2016)03-0404-05