西藏蟾蜍皮膚的組織學(xué)觀(guān)察

高鳳娟，李丕鵬，王譯唱，陸宇燕

(沈陽(yáng)師范大學(xué)兩棲爬行動(dòng)物研究所，遼寧省生物進(jìn)化與生物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110034)

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西藏蟾蜍皮膚的組織學(xué)觀(guān)察

高鳳娟，李丕鵬，王譯唱，陸宇燕*

(沈陽(yáng)師范大學(xué)兩棲爬行動(dòng)物研究所，遼寧省生物進(jìn)化與生物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110034)

為了解西藏蟾蜍Bufotibetanus與其高海拔生活環(huán)境的適應(yīng)性，采用常規(guī)石蠟切片和蘇木精-伊紅染色方法，對(duì)西藏蟾蜍雌雄性頭部、軀干和四肢的背、腹側(cè)皮膚顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀(guān)察、測(cè)量和比較。結(jié)果顯示皮膚的基本結(jié)構(gòu)與已報(bào)道的無(wú)尾兩棲類(lèi)相似，由表皮和真皮組成。表皮較薄，由5～8層細(xì)胞構(gòu)成，由外到內(nèi)分為角質(zhì)層、中間層和基底層。真皮較厚，分為疏松層和致密層。各部位大多表現(xiàn)為背側(cè)皮膚厚度大于腹側(cè)，相應(yīng)部位大多為雌性大于雄性。皮膚厚度的變化在一定程度上與西藏蟾蜍運(yùn)動(dòng)方式和繁殖期間抱對(duì)行為相適應(yīng)。皮膚腺體分粘液腺和顆粒腺2種。色素細(xì)胞主要分布在疏松層近表皮處，但在表皮和腺體周?chē)部梢?jiàn)色素細(xì)胞的不連續(xù)分布。皮膚中毛細(xì)血管極其豐富，不僅在表皮下幾乎成連續(xù)分布，而且在腺體周?chē)灿忻芗植肌Ｎ鞑伢蛤芷つw結(jié)構(gòu)明顯表現(xiàn)出與生活環(huán)境中強(qiáng)紫外輻射和缺氧環(huán)境相適應(yīng)的特點(diǎn)。

西藏蟾蜍；皮膚；顯微結(jié)構(gòu)

兩棲動(dòng)物皮膚是機(jī)體與其生活環(huán)境之間的第一道防線(xiàn)，不僅在呼吸、防御等方面有重要作用，而且對(duì)生活環(huán)境也具有極強(qiáng)的適應(yīng)性和敏感性(Toledo & Jared，1995；Zugetal.，2001)。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)無(wú)尾兩棲類(lèi)皮膚結(jié)構(gòu)進(jìn)行了廣泛的研究(梁剛，王瓊霞，2004；劉滿(mǎn)櫻等，2007；林文達(dá)等，2008；林文達(dá),朱靜,2009；李洋等，2009)，但對(duì)蟾蜍屬Bufo物種皮膚的研究，僅見(jiàn)于中華蟾蜍B.gararizans和花背蟾蜍B.raddei(耿欣蓮，1959；向德超等，1993；張賢芳等，2002；吳文英等，2011a)。上述研究顯示無(wú)尾兩棲類(lèi)由于生活環(huán)境和所處生理狀態(tài)不同，在皮膚組織學(xué)結(jié)構(gòu)上均呈現(xiàn)出明顯的變化。

西藏蟾蜍B.tibetanus隸屬于無(wú)尾目Anura蟾蜍科Bufonidae蟾蜍屬,主要分布于四川、青海、西藏和云南等地海拔3 200～4 300 m的高原草地(費(fèi)梁等，2010)。國(guó)內(nèi)已有學(xué)者分別對(duì)西藏蟾蜍的消化道組織學(xué)結(jié)構(gòu)和線(xiàn)粒體COⅠ及Cytb基因序列進(jìn)行了研究(吳銀霞等，2011；曾麟等，2011)，但西藏蟾蜍皮膚的組織學(xué)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)報(bào)道。本研究以組織學(xué)方法觀(guān)察西藏蟾蜍皮膚的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，探究其皮膚結(jié)構(gòu)與環(huán)境的適應(yīng)性，旨在豐富兩棲類(lèi)皮膚形態(tài)機(jī)能學(xué)的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

西藏蟾蜍于2009年10月采自西藏自治區(qū)察隅縣，成體3對(duì)，10%福爾馬林溶液固定。在頭背側(cè)兩眼間、頭腹側(cè)相對(duì)背側(cè)處取同等面積的皮膚，軀干部半側(cè)環(huán)剝皮膚，在前肢肱骨和后肢股骨中段環(huán)剝皮膚，耳后腺整體取下。常規(guī)石蠟切片，厚度7 μm，蘇木精-伊紅(HE)染色。

利用Olympus BX-50顯微鏡觀(guān)察、拍照，利用Image-Pro Express 6.0測(cè)量皮膚各層厚度(每塊皮膚隨機(jī)選取9個(gè)位點(diǎn)測(cè)量)；測(cè)量切面中腺體橫切面積和表皮下毛細(xì)血管長(zhǎng)度，統(tǒng)計(jì)材料中腺體個(gè)數(shù)，計(jì)算各個(gè)部位的腺體數(shù)量密度和毛細(xì)血管相對(duì)長(zhǎng)度。腺體數(shù)量密度=腺體個(gè)數(shù)/(腺體平均直徑×材料平均長(zhǎng)度)(單位：個(gè)/mm2)(李洋等，2009)。毛細(xì)血管相對(duì)長(zhǎng)度=毛細(xì)血管管徑之和(mm)/皮膚總長(zhǎng)度(mm)(陸宇燕等，2004)。利用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析。描述性統(tǒng)計(jì)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

西藏蟾蜍皮膚組織學(xué)結(jié)構(gòu)與已報(bào)道的無(wú)尾兩棲類(lèi)皮膚基本相同(圖版Ⅰ：1～9)，均由表皮層和真皮層構(gòu)成，在真皮疏松層中分布著大量的粘液腺和漿液腺。以軀干為例描述。

2.1 表皮

表皮為復(fù)層上皮組織，一般由4～8層細(xì)胞構(gòu)成。由于兩棲類(lèi)皮膚細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征不像哺乳類(lèi)那樣明確，因此，暫且將細(xì)胞類(lèi)型劃分為3類(lèi)，即從外向內(nèi)依次為角質(zhì)層、中間層(包含了哺乳類(lèi)的顆粒細(xì)胞層和棘細(xì)胞層)和基底層(圖版 Ⅰ：6)。

角質(zhì)層一般由1～2層細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞大多呈扁平狀，在皮膚疣粒處也有部分細(xì)胞呈大的空泡狀(圖版Ⅰ：3)。HE染色可見(jiàn)胞質(zhì)淡染，細(xì)胞界限模糊。胞核梭形，深染，位于細(xì)胞近底部，個(gè)別胞核出現(xiàn)明顯的空泡。

中間層由2～3層細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞界限清晰，細(xì)胞大小由內(nèi)到外逐漸變小，形態(tài)由矮柱狀逐漸變?yōu)闄E圓形。胞質(zhì)染色由深至淺，胞核形狀由圓形逐漸變成梭形。在皮膚疣粒處此層細(xì)胞觀(guān)察到的最多層數(shù)可達(dá)6層，此處中間層細(xì)胞之間在油鏡下可見(jiàn)清晰的鑲嵌連接(圖版Ⅰ：8～9)。胞核圓形，可見(jiàn)核仁。此層細(xì)胞中還可見(jiàn)“瓶狀細(xì)胞”(圖版Ⅰ：7)，穿插分布于中間層細(xì)胞近角質(zhì)細(xì)胞層處。細(xì)胞較小，橢圓形，胞質(zhì)明顯淡染；胞核小橢圓形，深染。

基底層位于表皮最內(nèi)側(cè)，一般由1層細(xì)胞緊密排列而構(gòu)成，細(xì)胞高柱狀，界限清晰，基膜清晰可見(jiàn)。胞核柱狀，深染，胞核周?chē)械緟^(qū)。

2.2 真皮

真皮位于表皮之下，由疏松層和致密層構(gòu)成，兩層之間界限不清晰(圖版Ⅰ：1～2)。

2.2.1 疏松層 由疏松結(jié)締組織構(gòu)成，緊貼于表皮之下。其中分布有大量的皮膚腺體、膠原纖維、毛細(xì)血管和神經(jīng)末稍。腺體大小不同和分布的不均勻?qū)е铝舜藢雍穸鹊拿黠@差異。疏松層中膠原纖維交錯(cuò)排列不甚規(guī)則，HE染色呈淺紅色。疏松層與表皮交界面呈波浪狀，背側(cè)皮膚起伏程度較大，而腹側(cè)較小。表皮細(xì)胞基膜內(nèi)側(cè)分布有大量毛細(xì)血管和血竇，未見(jiàn)突入表皮層內(nèi)。毛細(xì)血管周?chē)捌鋬?nèi)側(cè)分布有豐富的色素細(xì)胞，由其大量的突起交織而成明顯的網(wǎng)狀，突起可繼續(xù)向內(nèi)延伸包繞腺泡達(dá)疏松層與致密層的交界處。體背側(cè)表皮中可見(jiàn)色素細(xì)胞及其分支的存在，個(gè)別區(qū)域除基底細(xì)胞層清晰可見(jiàn)外，幾乎被色素細(xì)胞所覆蓋(圖版Ⅰ：4)。

2.2.2 致密層 主要由膠原纖維組成，排列緊密，呈平行波浪狀彎曲伸展,可見(jiàn)梭形核的成纖維細(xì)胞分布其間。其中有一些由梭形細(xì)胞聚集而成的條索狀結(jié)構(gòu)，垂直于表皮方向，外側(cè)與表皮基膜相連通，最內(nèi)側(cè)與淋巴竇壁層相連。這個(gè)條索狀結(jié)構(gòu)將致密層劃分為若干“小節(jié)”，相互關(guān)聯(lián)，保證了致密層的整體性。致密層中還有小動(dòng)脈和小靜脈的分布。

雌、雄性西藏蟾蜍各部位皮膚各層厚度的測(cè)量見(jiàn)表1。從數(shù)值上看，雌、雄性頭部背側(cè)皮膚在皮膚總厚度、表皮厚度和真皮厚度方面均呈現(xiàn)出雌性略大于雄性，但兩性之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腹側(cè)則相反，且在皮膚總厚度和真皮厚度方面，兩性之間差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。頭部背側(cè)真皮致密層厚度：雌性大于雄性(前者是后者的178.8%)，頭部腹側(cè)卻為雌性小于雄性，上述兩者間差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。頭部背腹側(cè)真皮疏松層厚度均為雄性大于雌性，但僅在頭腹側(cè)兩性之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

在西藏蟾蜍個(gè)體頭部背、腹側(cè)皮膚厚度的比較中可見(jiàn)，除表皮層背、腹兩側(cè)厚度非常接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雄性致密層厚度為腹側(cè)大于背側(cè)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余比較項(xiàng)均為背側(cè)厚度大于腹側(cè)，且除雄性皮膚總厚度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)外，其他背、腹側(cè)間差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

軀干 西藏蟾蜍雌雄兩性間的軀干背、腹側(cè)皮膚各對(duì)比項(xiàng)中，除腹側(cè)疏松層(P>0.05)外，其他均為雌性大于雄性，且差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。雄性個(gè)體軀干背、腹側(cè)皮膚總厚度和真皮厚度均為背側(cè)略大于腹側(cè)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。真皮中，致密層厚度為背側(cè)大于腹側(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表皮和疏松層厚度為背側(cè)小于腹側(cè)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。雌性個(gè)體軀干背、腹側(cè)皮膚在總厚度和真皮厚度上為背側(cè)明顯大于腹側(cè)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而表皮厚度為腹側(cè)大于背側(cè)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。真皮的疏松層和致密層厚度均為背側(cè)大于腹側(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)或有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

前肢 西藏蟾蜍雌雄兩性前肢背側(cè)皮膚總厚度、表皮厚度和真皮厚度均為雌性大于雄性，雌性真皮厚度是雄性的1.31倍，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。真皮層中，疏松層厚度為雌性大于雄性(P<0.05)，致密層厚度為兩性基本相同(P>0.05)。腹側(cè)皮膚總厚度較接近(P>0.05)，表皮層厚度為雄性大于雌性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；真皮層厚度為雌性大于雄性，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。真皮層中的疏松層和致密層厚度雖然均為雌性大于雄性，但兩性間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

后肢 西藏蟾蜍雌雄兩性的后肢在皮膚總厚度、表皮厚度和真皮厚度以及真皮的致密層和疏松層厚度均呈現(xiàn)出雌性大于雄性，且差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。雄性個(gè)體后肢皮膚總厚度、表皮厚度和真皮厚度以及真皮中的致密層和疏松層厚度均為背側(cè)大于腹側(cè)，其中表皮厚度背、腹側(cè)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，真皮層厚度背、腹兩側(cè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。雌性個(gè)體后肢皮膚各對(duì)比項(xiàng)均為背側(cè)大于腹側(cè)，并且差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

西藏蟾蜍不同部位皮膚毛細(xì)血管的分布有著明顯差別(表1)，由皮膚切片中觀(guān)察到的毛細(xì)血管總長(zhǎng)度與皮膚總長(zhǎng)度的比值看，頭部和前肢的比值大于軀干和后肢；除雌性的前肢和軀干外，腹側(cè)比值均大于背側(cè)，除后肢背、腹兩側(cè)雌雄性比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)外，其余差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；雌雄兩性間各部分比值僅軀干腹側(cè)差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其他差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且除前肢背側(cè)外，均為雄性比值大于雌性。

2.3 皮膚腺體

西藏蟾蜍皮膚腺體可分為粘液腺和漿液腺兩大類(lèi)，均位于真皮疏松層內(nèi)。腺體分泌部由多細(xì)胞構(gòu)成圓形腺泡，導(dǎo)管部則由近立方上皮組成，并與表皮細(xì)胞相連過(guò)渡開(kāi)口于體表。

2.3.1 漿液腺 漿液腺(圖版Ⅰ：1，3，5)即顆粒腺，又稱(chēng)其為毒腺。顆粒腺細(xì)胞大多呈立方狀，細(xì)胞界限不甚清晰，胞質(zhì)呈嗜伊紅色，胞核下方常為淡染區(qū)。胞核近底部，胞核呈圓形或橢圓形，深染。當(dāng)腺腔充盈時(shí)，整個(gè)腺泡可見(jiàn)由胞核整齊排列而成圓環(huán)狀。腺泡腔中充滿(mǎn)了大小不一的分泌顆粒，顆粒呈嗜伊紅色。其中散布著數(shù)個(gè)大小不一的深伊紅色團(tuán)塊。在腺細(xì)胞的外側(cè)，可見(jiàn)1～2層穿插排列類(lèi)肌細(xì)胞。由于腺泡充盈程度不同，類(lèi)肌細(xì)胞的形態(tài)也有明顯變化，有近似扁平狀至矮柱狀。在腺泡外側(cè)還有極其豐富的毛細(xì)血管分布，基本呈環(huán)繞狀。腺泡靠近表皮處，時(shí)?？梢?jiàn)由色素細(xì)胞構(gòu)成的間斷性的色素環(huán)帶半環(huán)繞。

雌雄兩性個(gè)體各部位皮膚中顆粒腺密度(表2)均表現(xiàn)為背側(cè)大于腹側(cè)，僅雌性軀體和前肢背、腹側(cè)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他部位差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而雌雄兩性間皮膚的腺體密度除前肢背側(cè)外，其余各部位表現(xiàn)為雄性大于雌性，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

顆粒腺面積(表2) 雄性各部位均為背側(cè)大于腹側(cè)，但僅軀體背腹兩側(cè)間差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其他部位均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。雌性?xún)H在頭和軀干顆粒腺背側(cè)大于腹側(cè)，且差異分別有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)和有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。前肢和后肢顆粒腺面積與頭部和軀干部相反，表現(xiàn)為腹側(cè)大于背側(cè)，且差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。除雌性頭腹側(cè)外，其他各部位顆粒腺大小均為雌性大于雄性；背側(cè)皮膚除頭部(P<0.01)和軀干(P<0.05)外，雌雄兩性間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。雌雄兩性腹側(cè)皮膚，除頭部差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)和軀干差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)外，其他部位差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 西藏蟾蜍各部位皮膚厚度比較

注：AB表示雌雄性之間相同部位比較，CD表示個(gè)體相同部位背、腹兩側(cè)的比較，小寫(xiě)字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，大寫(xiě)字母表示差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；下表同。

Notes： A and B indicate the comparison of the same parts between male and female，C and D indicate the comparison of the same individual between dorsal and ventral，superscript lowercase letters indicate there is a significant difference (P<0.05), superscript capital letters indicate there is an extremely significant difference (P<0.01); the same below.

表2 西藏蟾蜍皮膚腺體面積和數(shù)量密度

圖版Ⅰ 西藏蟾蜍皮膚顯微結(jié)構(gòu)

1.頭背側(cè)皮膚, 2.頭腹側(cè)皮膚, 3～4.體背側(cè)皮膚, 5.體側(cè)皮膚, 6～7.體腹側(cè)皮膚, 8.前肢背側(cè)皮膚, 9.前肢腹側(cè)皮膚, 10～12.耳后腺; SC.角質(zhì)層, TL.過(guò)渡層(中間層), SB.基底層(生發(fā)層), PC.色素細(xì)胞, SS.疏松層, SCp.致密層, MG.粘液腺, GG.顆粒腺, BC.瓶狀細(xì)胞, CV.毛細(xì)血管, OS.皮膚骨化, MC.鑲嵌連接。

1.dorsal skin of head, 2.ventral skin of head, 3～4.dorsal skin of trunk, 5.side skin of trunk, 6～7.ventral skin of trunk, 8.dorsal skin of forelimb, 9.ventral skin of forelimb, 10～12.ear gland; SC.stratum comeum, TL.transition layer (middle layer), SB.stratum basale (stratum germinativum), PC.pigment cell, SS.stratum spongiosum, SCp.stratum compactum, MG.mucous gland, GG.granular gland, BC.bottle cell, CV.capillary vessel, OS.osteoderms, MC.mosaic connection.

2.3.2 粘液腺 粘液腺(圖版Ⅰ：6)分布于皮膚疏松層的淺表，腺泡明顯小于顆粒腺，腺腔明顯。腺細(xì)胞高柱狀，界限清晰，胞質(zhì)弱嗜伊紅色。胞核橢圓，位于細(xì)胞基底部。腺細(xì)胞外圍可見(jiàn)少量類(lèi)肌細(xì)胞存在，明顯少于顆粒腺外圍的類(lèi)肌細(xì)胞數(shù)量。另外，粘液腺外周的毛細(xì)血管數(shù)量遠(yuǎn)不及顆粒腺多。但粘液腺處于排空狀態(tài)時(shí)，腺泡內(nèi)側(cè)可見(jiàn)1～2個(gè)蘑菇狀凸起，有多數(shù)柱狀細(xì)胞集聚而成，“蘑菇炳”為胞核集聚處，“蘑菇傘”為強(qiáng)嗜伊紅的胞質(zhì)。

腺體密度 雌雄兩性個(gè)體各部位皮膚中粘液腺密度(表2)除前肢外，其他部位均表現(xiàn)為背側(cè)大于腹側(cè)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而雌雄兩性間各部位皮膚的腺體密度除頭部腹側(cè)外，均表現(xiàn)為雄性大于雌性，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

粘液腺面積(表2) 雄性除前肢背側(cè)大于腹側(cè)外，其他部位均為腹側(cè)大于背側(cè)；除頭部背、腹兩側(cè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他部位差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雌性除前肢腹側(cè)大于背側(cè)外，其他部位均為背側(cè)大于腹側(cè)；前肢及后肢的背、腹兩側(cè)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，軀干背、腹兩側(cè)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而頭部背、腹側(cè)間差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雌雄兩性比較的結(jié)果是，除雄性頭部和后肢腹側(cè)外，均為雌性大于雄性，頭部和軀干背側(cè)兩性個(gè)體之間呈差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腹側(cè)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩性前肢背側(cè)皮膚中粘液腺大小差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而腹側(cè)差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；雌雄兩性后肢背側(cè)差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腹側(cè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.3 耳后腺 以顆粒腺為主要組成成分，一般由3～5個(gè)超大型顆粒腺腺泡作為主體，還有在期間穿插分布的中等腺泡以及近耳后腺外緣的較小腺泡共同組成(圖版Ⅰ：10～12)。另外，在耳后腺的近表皮處有少量粘液腺分布。耳后腺的表皮較薄，且基底層細(xì)胞均高柱狀，高度幾乎是表皮總厚度的二分之一(圖版Ⅰ：11～12)。在基底細(xì)胞內(nèi)側(cè)有豐富的毛細(xì)血管分布。在表皮與真皮交界處有分布較均勻的色素細(xì)胞，未見(jiàn)突入基底細(xì)胞基膜。真皮層中疏松層較薄或幾乎不可分辨，粘液腺主要分布在此層中。而顆粒腺周?chē)鶠橹旅芙Y(jié)締組織包圍，可見(jiàn)有順著耳后腺長(zhǎng)軸整齊排列的膠原纖維和其間分布的具有梭形核的成纖維細(xì)胞。此外，在致密結(jié)締組織中，近腺體周?chē)€有較多的毛細(xì)血管存在。在粘液腺附近的結(jié)締組織中，有較多的HE染色呈藍(lán)色的圓形、橢圓形的均質(zhì)團(tuán)塊(圖版Ⅰ：11)，其大小差異明顯，此結(jié)構(gòu)即為兩棲類(lèi)皮膚中的內(nèi)骨骼(integunentary skeletion)，或稱(chēng)為鈣化斑(lanina calcarea)。這種結(jié)構(gòu)在其他部位皮膚中未曾發(fā)現(xiàn)。

耳后腺中的顆粒腺和粘液腺面積(表2)均為雌性大于雄性，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

3.1 皮膚機(jī)能結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

兩棲類(lèi)裸露的皮膚與環(huán)境之間有著充分的接觸，因此皮膚的結(jié)構(gòu)與其生存的環(huán)境表現(xiàn)出很好的適應(yīng)性，曹燕等(2011)對(duì)齒突蟾屬Scutiger的4個(gè)物種的研究指出，屬于齒突蟾亞屬S.(Scutiger) Theobald, 1868的西藏齒突蟾S.(S.)boulengeri背側(cè)皮膚中，表皮細(xì)胞3～7層，其中角質(zhì)細(xì)胞層有1～2層細(xì)胞構(gòu)成，而屬于貓眼齒突蟾亞屬S.(Aelurophryne)boulenger, 1919的3個(gè)物種背側(cè)皮膚中，表皮細(xì)胞數(shù)為3～5層，其中角質(zhì)細(xì)胞層均僅由1層細(xì)胞構(gòu)成，顯示出西藏齒突蟾具有較強(qiáng)的陸棲性，即皮膚具有良好的防止水分喪失的功能。從4種齒突蟾?jìng)€(gè)體軀干背側(cè)皮膚總厚度看，陸棲性強(qiáng)的西藏齒突蟾背側(cè)皮膚總厚度(202.87 μm±15.93 μm)小于水棲類(lèi)型的3種貓眼齒突蟾背側(cè)皮膚總厚(332.73 μm±31.87 μm，453.27 μm±53.4 μm，412.00 μm±34.74 μm)。而在國(guó)內(nèi)已報(bào)道的水棲蛙物種中，虎紋蛙Holobatrachuschinensis(李洋等，2009)背側(cè)皮膚厚為(680 μm±170 μm)和牛蛙Lithobatescatesbeianus背側(cè)皮膚(490 μm±30 μm)、雄性黑斑側(cè)褶蛙Pelophylaxnigromaculatus(王麗等，2010)(362.9 μm±51.05 μm)和金線(xiàn)側(cè)褶蛙P.plancyi(376.6 μm)等的背側(cè)皮膚總厚度也較陸棲蛙類(lèi)黑龍江林蛙Ranaamurensis(吳文英等，2011b)(299.2 μm±50.48 μm)厚。本研究觀(guān)察的西藏蟾蜍皮膚角質(zhì)細(xì)胞層為1～2層細(xì)胞構(gòu)成，雄性個(gè)體軀干背側(cè)皮膚總厚度為230.61 μm±60.21 μm，與上述陸棲兩棲類(lèi)一致。是否可以推斷，水棲類(lèi)型由于其皮膚無(wú)需通過(guò)角質(zhì)化來(lái)防止體內(nèi)水分的丟失，以及濕潤(rùn)的環(huán)境保證了皮膚呼吸的功效，故以增加厚度強(qiáng)化了皮膚的保護(hù)功能。但由于統(tǒng)計(jì)的物種數(shù)量有限，這個(gè)趨勢(shì)是否具有代表性還需要補(bǔ)充數(shù)據(jù)。

兩棲類(lèi)個(gè)體通過(guò)抱對(duì)行為才能完成其繁殖任務(wù)，在這個(gè)過(guò)程中雌性需要背負(fù)著雄性個(gè)體尋找適宜的產(chǎn)卵水域完成體外受精的過(guò)程。在此過(guò)程中雌雄性蛙相互接觸的皮膚存在著較為明顯的摩擦。吳文英等(2011b)和賈麗麗等(2013)對(duì)黑龍江林蛙和東北林蛙R.dybouwskii研究指出，雌雄兩性個(gè)體皮膚結(jié)構(gòu)也具有與生殖行為相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即繁殖期間的黑龍江林蛙和東北林蛙雄蛙腹側(cè)皮膚較雌蛙厚，而雌蛙背側(cè)皮膚比雄蛙厚。而本研究結(jié)果更明確的顯示了西藏蟾蜍也具有類(lèi)似的特點(diǎn)，即雌性軀干背側(cè)皮膚厚度是雄性1.73倍，與上述結(jié)果一致；但雌性軀干腹側(cè)皮膚厚度是雄性的1.37倍，與上述結(jié)果不符。這種情況可以從蟾蜍與蛙的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)去分析，由于蟾蜍肩帶屬于“弧胸型”，加之一般蟾蜍的四肢明顯短于蛙類(lèi)，因此在運(yùn)動(dòng)中常以“步行”為主，且腹側(cè)與地面或多或少有摩擦接觸，尤其在抱對(duì)期間雌性要背負(fù)雄性尋找適宜的產(chǎn)卵水域，雌性腹側(cè)與地面的接觸性摩擦就更加明顯，只有通過(guò)增加皮膚厚度已達(dá)到保護(hù)的目的。就構(gòu)成皮膚各層結(jié)構(gòu)看，雌性蟾蜍腹側(cè)表皮層厚度、真皮致密層厚度、真皮疏松層分別是雄性腹側(cè)相應(yīng)結(jié)構(gòu)的2.05倍、1.35倍和0.95倍，由此也可以看出雌性西藏蟾蜍以加厚的表皮層和真皮致密層來(lái)抵抗運(yùn)動(dòng)中腹側(cè)皮膚與地面的摩擦損傷。由于雌性表皮層的增厚，在某種程度上影響了此處的皮膚呼吸作用，這點(diǎn)可以從雌、雄性腹側(cè)毛細(xì)血管相對(duì)長(zhǎng)度的數(shù)值(♀0.29±0.068，♂0.41±0.080)得到證明。另外，雄性頭部腹側(cè)皮膚厚于雌性，也應(yīng)屬于此類(lèi)。

3.2 色素細(xì)胞與高原生境的適應(yīng)

兩棲類(lèi)動(dòng)物機(jī)體由于缺乏體溫調(diào)節(jié)機(jī)制，生理機(jī)能活躍與否受外界溫度變化制約。然而，它們皮膚中含有大量的色素細(xì)胞，在垂體分泌的促黑激素作用下改變細(xì)胞形態(tài)，以利于更好的吸收陽(yáng)光的能量，達(dá)到調(diào)節(jié)體溫的目的(梁剛，王瓊霞，2004)。但是陽(yáng)光中的紫外輻射對(duì)兩棲類(lèi)也有著明顯的損傷作用(Hunsaker & Johnson，1959；Blausteinetal.，2003；屈婷婷等，2012；高鳳娟等，2015)，而皮膚中大量的色素細(xì)胞，通過(guò)它們的分支交織成網(wǎng)，形成了一定厚度的色素層可吸收部分紫外輻射，達(dá)到減輕紫外輻射對(duì)皮膚以及機(jī)體內(nèi)部重要器官的損傷(Hofer & Mokri，2000；Blaustein & Belden，2003)。

兩棲類(lèi)皮膚中色素細(xì)胞主要分布于真皮疏松層中,致密層中有少量單個(gè)分布(劉滿(mǎn)櫻等，2007；林文達(dá)等，2008)；表皮層中偶見(jiàn)色素細(xì)胞分布(梁剛，王瓊霞，2004；王麗等，2010；曹燕等，2011)；一般情況下背側(cè)皮膚中色素細(xì)胞明顯多于腹側(cè)皮膚(張賢芳等，2002；曹燕等，2011；雷飛宙等，2012)。西藏蟾蜍色素細(xì)胞在軀干背、腹側(cè)分布情況與上述報(bào)道一致，背側(cè)色素細(xì)胞密度大于腹側(cè)。但有兩點(diǎn)不同，首先構(gòu)成色素層的色素細(xì)胞還可通過(guò)其長(zhǎng)的分支，延伸至疏松結(jié)締組織深部，甚至腺體上方及周?chē)灿杏缮丶?xì)胞分支形成的較薄的、不連續(xù)的色素層。這樣能更好保護(hù)腺體免受高輻射傷害，保證腺體功能的正常。第二，在軀干背側(cè)的表皮層中有大量的色素細(xì)胞分布，少數(shù)區(qū)域由于色素細(xì)胞的密集分布，僅基底細(xì)胞清晰可見(jiàn)。色素細(xì)胞如此密集分布應(yīng)該是西藏蟾蜍對(duì)高原較強(qiáng)的紫外輻射的一種適應(yīng)。

3.3 毛細(xì)血管與粘液腺的分布

兩棲類(lèi)由于心臟結(jié)構(gòu)的特殊性，皮膚的輔助呼吸作用在整體氧氣供給中有著重要的作用。但皮膚呼吸的功效卻受著皮膚表面粘液的溶氧量、皮膚中毛細(xì)血管的密度以及血流量等因素的限制(李丕鵬，方榮盛，1992)。在已有的有關(guān)無(wú)尾兩棲物種皮膚結(jié)構(gòu)中的毛細(xì)血管分布報(bào)道中，大多只進(jìn)行了一般的定性觀(guān)察，很難顯示水棲和陸棲物種之間皮膚呼吸質(zhì)的差異。對(duì)爪鯢Onychodactylusfischeri皮膚呼吸作用的研究中，利用皮膚切片中能夠測(cè)量的毛細(xì)血管總長(zhǎng)與所觀(guān)察皮膚切面的長(zhǎng)度比值，對(duì)作為陸棲有尾兩棲類(lèi)的爪鯢，由于缺少重要的呼吸器官——肺，而促成了皮膚呼吸作用的提升進(jìn)行了初步的量化報(bào)道，爪鯢軀干背腹側(cè)毛細(xì)血管相對(duì)長(zhǎng)度分別為0.081及0.062(陸宇燕等，2004)。西藏蟾蜍軀干毛細(xì)血管相對(duì)長(zhǎng)度遠(yuǎn)大于爪鯢，雌、雄性背側(cè)毛細(xì)血管相對(duì)長(zhǎng)度很接近，分別為0.32±0.075、0.36±0.066，但腹側(cè)雄性(0.41±0.08)明顯大于雌性(0.29±0.068)。如果將與皮膚呼吸密切相關(guān)的粘液腺的信息結(jié)合起來(lái)，將對(duì)西藏蟾蜍皮膚呼吸的特征有更加深入的理解。雄性西藏蟾蜍背側(cè)粘液腺的密度是雌性的1.33倍，而雄性腺體大小僅是雌性的0.5倍，提示一般情況下，雄性背側(cè)的粘液飽有量略低于雌性，而其通過(guò)毛細(xì)血管相對(duì)長(zhǎng)的略微優(yōu)勢(shì)，促成了背側(cè)皮膚呼吸功效的相似。而雄性腹側(cè)粘液腺密度是雌性的1.1倍，雄性腺體大小是雌性的0.99倍，雌雄兩性間基本持平，而雄性毛細(xì)血管相對(duì)長(zhǎng)度是雌性的1.41倍，可見(jiàn)雄性腹側(cè)皮膚呼吸供氧量遠(yuǎn)大于雌性。這種毛細(xì)血管的不均衡分布現(xiàn)象，推測(cè)與西藏蟾蜍雌雄兩性個(gè)體各自的生活習(xí)性有關(guān)：雄性較為瘦小，行走時(shí)四肢可使軀干抬離地面，使腹側(cè)皮膚有豐富的粘液包裹，有利于皮膚呼吸的進(jìn)行。而雌性較為笨重，尤其在卵巢發(fā)育期間，行走時(shí)軀干腹側(cè)與地面接觸的機(jī)會(huì)大大增加，致使皮膚表面的粘液?jiǎn)适В绊懥似つw呼吸所需要的濕潤(rùn)條件。當(dāng)然這種推測(cè)是僅從形態(tài)學(xué)的角度分析，至于皮膚呼吸的生理學(xué)機(jī)制還有待于深入研究。

3.4 鈣化層的存在

Vickaryous和Sire(2009)指出，在無(wú)尾兩棲類(lèi)皮膚中存在有皮膚骨化(osteoderms)和皮膚鈣化層(lamina calcarea)2種皮膚骨骼類(lèi)型。并認(rèn)為皮膚鈣化是有成纖維細(xì)胞礦化形成，此區(qū)域已無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，含有多糖蛋白以及羥基磷灰石的結(jié)晶。國(guó)內(nèi)學(xué)者在對(duì)中華蟾蜍皮膚(耿欣蓮，1959)的研究中也發(fā)現(xiàn)了這種團(tuán)塊或者條索樣的結(jié)構(gòu)，由于其染色特點(diǎn)與粘液腺類(lèi)似，故稱(chēng)為“粘液團(tuán)”。在無(wú)尾兩棲類(lèi)皮膚中已報(bào)道11個(gè)科的部分物種皮膚中存在鈣化層的結(jié)構(gòu)(雷飛宙等，2012)，由此可見(jiàn)鈣化層在無(wú)尾兩棲類(lèi)皮膚中屬常見(jiàn)結(jié)構(gòu)。推測(cè)具有抵御干燥，調(diào)節(jié)鈣平衡，防御天敵以及限制皮膚進(jìn)行物質(zhì)交換的作用(Toledo & Jared，1995)。曹燕等(2011)對(duì)齒突蟾屬的陸棲類(lèi)群齒突蟾亞屬和水棲類(lèi)群的貓眼蟾亞屬的4個(gè)物種的研究指出，在4種蟾蜍體背側(cè)和體腹側(cè)皮膚疏松層中均發(fā)現(xiàn)有大量皮膚鈣化層的出現(xiàn)。而本研究觀(guān)察的西藏蟾蜍各個(gè)部位皮膚中，僅在耳后腺中發(fā)現(xiàn)了皮膚鈣化層，且數(shù)量和面積均甚小。與本實(shí)驗(yàn)室對(duì)中華大蟾蜍耳后腺結(jié)構(gòu)的觀(guān)察結(jié)果相近，推測(cè)可能與腺體的分泌有關(guān)(吳文英等，2011a)。而與西藏齒突蟾皮膚鈣化層相比，西藏蟾蜍的皮膚鈣化層結(jié)構(gòu)幾乎可以忽略不計(jì)。

本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察的西藏蟾蜍均為西藏察隅農(nóng)田和灌木林中捕獲的個(gè)體，該區(qū)域海拔較低，濕度較大，生活環(huán)境大大優(yōu)于生活在高海拔、高紫外輻射區(qū)域的西藏齒突蟾。是否由于長(zhǎng)期的演化，物種適應(yīng)了自身生活的環(huán)境，在皮膚結(jié)構(gòu)中有了明顯的適應(yīng)現(xiàn)象，還需要對(duì)高原地區(qū)不同生境下無(wú)尾兩棲類(lèi)皮膚進(jìn)行大量觀(guān)察。

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Histological Observation ofBufotibetanusSkin

GAO Fengjuan, LI Pipeng, WANG Yichang, LU Yuyan*

(Institute of Herpetology, Liaoning Key Laboratory of Evolution and Biodiversity,Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

In order to understand the skin adaptability of Tibetan toad (Bufotibetanus) that was responsible for its living environment at high elevation, the microstructural characteristics of its dorsal and ventral skins of head, trunk and limbs were studied from male and female specimens by normal histological method.The results showed that the basic structure of the skin was composed of epidermis and dermis, which was similar to other amphibians.The epidermis was thin and consisted of stratum corneum, middle layer and stratum basale with 5 to 8 layers of cells.The dermis was thick and consisted of stratum spongiosum and stratum compactum.The dorsal skin was thicker than the ventral one on the corresponding parts, and the female skin was thicker than the male.Changes in skin thickness were related to the movement pattern and the amplexus behavior to a certain extent.Skin glands could be divided into mucus glands and granular glands.The chromatophores were mainly distributed in the stratum spongiosum near the epidermis, as well as discontinuously distributed in the epidermis and the surrounding of glands.The capillary vessels were abundant in skin, which were not only continuously distributed in the epidermis but also densely distributed around the glands.In conclusion, the structures of the toad skin were closely adapted to the strong ultraviolet radiation and hypoxic environment.

Bufotibetanus; skin; microstructure

2016-01-29 接受日期：2016-04-13 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30870276)

高鳳娟(1990—)，女，碩士研究生，研究方向：兩棲爬行動(dòng)物環(huán)境毒理學(xué), E-mail：279324525@qq.com

*通信作者Corresponding author，E-mail：luyuyan2001@yahoo.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160026

Q959.5；Q954

A

1000-7083(2016)03-0444-08