遺傳性包涵體肌病一例GNE突變的檢測(cè)*

田 杰，李玉生，楊志華，駱海洋，毛澄源，許予明，史長(zhǎng)河#

1)鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理學(xué)院 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

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遺傳性包涵體肌病一例GNE突變的檢測(cè)*

田 杰1)，李玉生2)，楊志華2)，駱海洋2)，毛澄源2)，許予明2)，史長(zhǎng)河2)#

1)鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理學(xué)院 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

#通信作者，男，1985年5月生，博士，主治醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)遺傳變性病，E-mail：shichanghe@gmail.com

遺傳性包涵體肌??；目標(biāo)捕獲測(cè)序；GNE基因突變

目的：研究一例近親結(jié)婚導(dǎo)致的遺傳性包涵體肌病(HIBM)家系表型和基因型特點(diǎn)。方法：收集一例常染色體隱性遺傳性肌病患者，應(yīng)用目標(biāo)捕獲測(cè)序技術(shù)對(duì)該患者家系人員進(jìn)行致病基因篩查。結(jié)果：該患者以四肢近端肌進(jìn)行性無力為首發(fā)癥狀，電生理檢查提示肌源性損害；基因檢測(cè)結(jié)果顯示GNE基因發(fā)生c.C577T (p.Arg193Cys)純合錯(cuò)義突變；其父母均為GNE基因c.C577T (p.Arg193Cys)雜合攜帶者；該突變?cè)诩蚁祪?nèi)同疾病表型共分離，并且在200例正常對(duì)照人群中未被發(fā)現(xiàn)。結(jié)論：目標(biāo)捕獲測(cè)序技術(shù)可用于HIBM的診斷；c.C577T為一個(gè)新的GNE基因變異。

遺傳性包涵體肌病(hereditary inclusion body myopathy, HIBM)是一類罕見的慢性進(jìn)展性常染色體隱性遺傳性肌病，病理表現(xiàn)為細(xì)胞核和(或)細(xì)胞漿內(nèi)管絲狀包涵體形成[1-5]。HIBM主要分為股四頭肌不受累的空泡肌病(vacuolar myopathy sparing the quadriceps, VMSQ)與伴鑲邊空泡的遠(yuǎn)端肌病(distal myopathy with rimmed vacuoles,DMRV)，二者均與尿苷二磷酸-N-乙酞氨基葡萄糖2-表位酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(GNE)基因突變相關(guān)[6-9]。目前，已有超過100種GNE基因突變?cè)诙鄠€(gè)國(guó)家多個(gè)種族中被檢測(cè)到，但我國(guó)有關(guān)GNE突變的研究較少。作者收集到一例近親婚育家庭的近端肌無力患者，應(yīng)用目標(biāo)捕獲測(cè)序技術(shù)最終診斷為由GNE基因的新發(fā)突變位點(diǎn)導(dǎo)致的HIBM，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 該例為就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院、臨床表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳性肌病的患者，由兩名神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師進(jìn)行詳細(xì)的病史采集、神經(jīng)系統(tǒng)查體，詳細(xì)詢問家族史，完善肌酶學(xué)、肌電圖等檢查。收集該院2012年1月至2013年6月200例無神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病的健康志愿者為對(duì)照。研究得到鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得受試者的知情同意。

1.2 基于高通量測(cè)序技術(shù)的目標(biāo)捕獲測(cè)序 采集患者外周靜脈血3 mL，采用標(biāo)準(zhǔn)流程提取基因組DNA。參考OMIM以及HGMD數(shù)據(jù)庫，選取與遺傳性肌病相關(guān)的169個(gè)基因，利用Agilent Sure Design在線設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)針對(duì)目標(biāo)基因外顯子及側(cè)翼序列(±10 bp)的靶向捕獲探針，定制專門的目標(biāo)基因捕獲試劑盒，共設(shè)計(jì)了30 515條捕獲探針，總大小為992.533 kb。采用Agilent Sure Select目標(biāo)序列富集試劑盒制備針對(duì)患者DNA樣本的目標(biāo)基因捕獲文庫，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過程包括超聲破碎DNA片段、文庫構(gòu)建、雜交捕獲、捕獲文庫擴(kuò)增和純化等。使用Agilent Bioanalyzer 2100儀器對(duì)測(cè)序文庫的DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，試劑為DNA chips，最后按照捕獲文庫DNA樣本濃度及測(cè)序深度要求，應(yīng)用NEXTSEQ 500測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)測(cè)序。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)的分析 測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)(Fastq文件)經(jīng)RTA software、CASAVA software v1.8.2、BWA、Genome Analysis Toolkit生物信息學(xué)軟件分析后，評(píng)估測(cè)序質(zhì)量，評(píng)估參數(shù)包括總reads數(shù)[10]、與人類基因組序列相匹配的reads比例、位于目標(biāo)基因靶序列以內(nèi)的reads比例、平均測(cè)序深度、測(cè)序深度大于20×區(qū)域的比例及覆蓋度均一性等，并生成單核苷酸變異(single nucleotide variation，SNV)和插入/缺失變異(insertion/deletion, Indel)報(bào)告。運(yùn)用ANNOVAR軟件、PolyPhen-2.2.2軟件、HGMD數(shù)據(jù)庫、dbSNP數(shù)據(jù)庫、Genome1000數(shù)據(jù)庫進(jìn)行變異注釋，篩選可能的致病位點(diǎn)[11]。

1.4 候選變異的Sanger驗(yàn)證 應(yīng)用Prime3.0設(shè)計(jì)引物序列：正義鏈5’-GAGGGGAGAAGATGAG GCAG-3’，反義鏈：5’-CCACATGCGAATGATGCTCA-3’。 PCR體系總體積為50 μL，包括250 ng基因組DNA(每條引物各12.5 pmol)、10 mmol/L Tris-HCl(pH=8．3)、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、體積分?jǐn)?shù)10%二甲基亞砜、4 U Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；隨后95 ℃變性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)25次；最后72 ℃擴(kuò)延5 min。反應(yīng)產(chǎn)物由ABI 3730 DNA analyzer(生工生物工程有限公司)直接測(cè)序。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用DNASTAR v7.1軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料及輔助檢查結(jié)果 先證者(Ⅴ-1)，女，28歲，未婚，以“雙下肢無力4 a”為主訴入院。 4 a前無明顯誘因出現(xiàn)雙下肢無力，表現(xiàn)為雙側(cè)大腿上抬困難，后癥狀逐漸加重，出現(xiàn)行走不穩(wěn)、步態(tài)異常癥狀。神經(jīng)系統(tǒng)查體示：右上肢肌力5級(jí)，左上肢肌力近端4級(jí)、遠(yuǎn)端5級(jí)，雙下肢肌力近端2級(jí)、遠(yuǎn)端4-級(jí)；四肢肌張力正常，深淺感覺未見異常；左上肢橈反射亢進(jìn)，四肢病理征陰性；步態(tài)呈“鴨步”。肌酶檢測(cè)正常。肌電圖示：四肢被檢肌可見自發(fā)電位，呈肌源性改變。該家系無其他類似癥狀患者，但先證者父母為近親婚配，符合常染色體隱性遺傳模式，系譜圖見圖1。

圖1 家系系譜圖

2.2 目標(biāo)捕獲測(cè)序及Sanger驗(yàn)證結(jié)果 目標(biāo)捕獲測(cè)序共獲得151.5 M數(shù)據(jù)，注釋對(duì)比后共發(fā)現(xiàn)4 270個(gè)SNV和405個(gè)Indel，數(shù)據(jù)庫過濾后得到13個(gè)基因上的9個(gè)SNV和5個(gè)Indel。結(jié)合基因注釋和突變致病性預(yù)測(cè)，初步確定GNE基因c.C577T(p.Arg193Cys)為該患者的致病突變；進(jìn)一步對(duì)家系成員(Ⅳ-1，Ⅳ-2，Ⅴ-1)進(jìn)行Sanger 測(cè)序(圖2)，該患者為GNE基因純和突變，且其父母均為該突變的雜合攜帶者，此突變基因型同家系表型共分離。該突變位點(diǎn)在dbSNP、Genome1000數(shù)據(jù)庫中未見報(bào)道，且在200例正常對(duì)照中也未發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)。

圖2 GNE突變測(cè)序 (箭頭所示為突變位點(diǎn))

3 討論

HIBM具有明顯臨床異質(zhì)性，患者最初多表現(xiàn)為小腿前群肌肉無力與萎縮、足下垂、步態(tài)異常等，隨著病情進(jìn)展,可累及下肢近端，甚至出現(xiàn)上肢和中軸肌肉受累，面部肌肉、呼吸肌、心肌等也可受累。包涵體肌病的臨床特征變異較大，易與炎癥性疾病、脂質(zhì)沉積病、腓骨肌萎縮癥、肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良等混淆，臨床診斷比較困難。肌肉活檢對(duì)該病診斷具有重要意義，但是由于肌肉活檢受到醫(yī)院條件和患者自身心理的限制,檢查相對(duì)困難。此次收集的一例以下肢遠(yuǎn)端無力、行走不穩(wěn)為主要表現(xiàn)的肢帶型遺傳性肌病患者，其臨床癥狀與肌營(yíng)養(yǎng)不良等疾病表現(xiàn)相似，鑒別困難。

遺傳性肌病具有明顯的遺傳異質(zhì)性，其致病基因數(shù)量多，外顯子數(shù)量更是龐大。傳統(tǒng)的測(cè)序方法(如Sanger)對(duì)每個(gè)外顯子進(jìn)行直接測(cè)序，通量較低，這使得直接測(cè)序篩查的工作量及成本巨大[12-16]。目標(biāo)捕獲測(cè)序技術(shù)可一次對(duì)幾十萬到幾百萬個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序，與直接測(cè)序相比，具有高通量、低成本的測(cè)序優(yōu)勢(shì)。該研究中，通過對(duì)該家系患者進(jìn)行目標(biāo)捕獲測(cè)序，確定GNE基因的c.C577T(p.Arg193Cys)為此家系的致病突變[17-19]。

在不同種族中GNE基因突變形式與位點(diǎn)差別很大。Argov等[17]在對(duì)129例中東猶太人HIBM的研究中發(fā)現(xiàn)，GNE突變?nèi)繛?2號(hào)外顯子P.M712T純和突變；而日本HIBM患者GNE基因突變形式則包括錯(cuò)義突變、剪切突變、無義突變、小片段插入突變、小片段缺失突變等多種,甚至發(fā)現(xiàn)了大片段缺失突變[20]。在中國(guó)GNE基因突變導(dǎo)致的HIBM報(bào)道極少，該研究發(fā)現(xiàn)的GNE基因c.C577T (p.Arg193Cys)突變未見文獻(xiàn)報(bào)道，提示該地區(qū)HIBM的GNE突變類型可能與其他人群不同，但仍然需要大樣本的研究證實(shí)這一假說[19,21-22]。

GNE基因編碼尿苷二磷酸-N-乙酞氨基葡萄糖2-表位酶/N-乙酰甘露糖胺激酶，具有表位酶和激酶兩種功能結(jié)構(gòu)域, 是在唾液酸的生物合成中起關(guān)鍵作用的雙功能限速酶。唾液酸為生物信息傳遞中的重要分子，在細(xì)胞黏附、抗原決定簇識(shí)別與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮重要作用。GNE突變可能導(dǎo)致酶活性降低，使肌纖維內(nèi)唾液酸代謝紊亂，肌纖維內(nèi)蛋白磷酸化異常，最終導(dǎo)致肌纖維的退行性變。此外尚有報(bào)道認(rèn)為HIBM肌病可能與線粒體功能、細(xì)胞凋亡通路有關(guān)，具體機(jī)制可能需要進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)[23-24]。

該突變?yōu)榻H婚育家系中發(fā)現(xiàn)的HIBM致病基因GNE的新發(fā)突變類型，這進(jìn)一步完善了中國(guó)人群中GNE的突變類型。在臨床實(shí)踐中應(yīng)提高對(duì)HIBM的認(rèn)識(shí)，積極應(yīng)用目標(biāo)捕獲測(cè)序等新一代基因測(cè)序技術(shù)對(duì)HIBM作出診斷。

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(2016-04-05收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Identification of a novel mutation in GNE gene of hereditary inclusion body myopathy

TIANJie1),LIYusheng2),YANGZhihua2),LUOHaiyang2),MAOChengyuan2),XUYuming2),SHIChanghe2)

1)SchoolofNursing,ZhengzhouRailwayVocationalandTechnicalCollege,Zhengzhou450052 2)DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

hereditary inclusion body myopathy;target capture sequencing;GNE gene mutation

Aim: To analyze the phenotypic and genotypic characteristics in a consanguineous family presented with hereditary inclusion body myopathy(HIBM). Methods: The clinical data of an autosomal recessive myopathy pedigree were collected, and target capture sequencing technology was used to identify the pathogenic gene mutation. Results: The patient in the pedigree presented proximal limb muscles weakness as the first symptom, electrophysiological examination suggested a myogenic damage, and genetic testing results show a homozygous missense mutation c.C577T(p.Arg193Cys); the parents were both heterozygous for the c.C577T(p.Arg193Cys) mutation.The GNE gene mutation was co-segregated with the phenotype in the pedigree and was not detected in 200 normal control subjects. Conclusion: A novel GNE gene mutation is identified and target captare sequencing method is helpful for the diagnosis of HIBM.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.014

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 U1404311

R596.1