褪黑素對急性脊髓損傷大鼠脊髓組織中MPO及CINC-1表達的影響*

苗金紅，朱海洋，鐘 斌，崔 浩，汪 鑫，理 陽，徐玉生#

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

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褪黑素對急性脊髓損傷大鼠脊髓組織中MPO及CINC-1表達的影響*

苗金紅1)，朱海洋2)，鐘 斌2)，崔 浩2)，汪 鑫2)，理 陽2)，徐玉生2)#

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

#通信作者，男，1969 年 3 月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向:骨科疾病的基礎與臨床，E-mail:ysxu@zzu.edu.cn

褪黑素：脊髓損傷：中性粒細胞趨化因子；髓過氧化物酶；大鼠

目的：探討褪黑素(MT)對大鼠急性脊髓損傷后髓過氧化物酶(MPO)及中性粒細胞趨化因子(CINC)-1表達的影響。方法：108只SD大鼠分為假手術組、脊髓損傷組、褪黑素治療組。手術組大鼠僅切除T11椎板，脊髓損傷組、褪黑素治療組建立T11脊髓損傷模型。脊髓損傷組、褪黑素治療組在脊髓損傷后10 min內(nèi)分別腹腔注射含體積分數(shù)5%乙醇的生理鹽水和100 mg/kg的褪黑素制劑。于脊髓損傷后1 h、6 h、12 h、1 d、3 d、5 d分別取脊髓組織，化學法測定MPO活力變化，HE染色法觀察脊髓組織結(jié)構(gòu)，RT-PCR法觀察CINC-1 mRNA表達情況。結(jié)果：脊髓內(nèi)CINC-1水平和MPO活性有相似的變化規(guī)律, 且MPO在CINC-1表達達峰之后12 h達高峰；除1 h外各時間點各組相比較，B組最高、C組次之、A組最低，其中B組與A組、C組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論：褪黑素可通過抑制CINC-1的表達減少中性粒細胞的浸潤，從而減輕炎癥反應，起到一定的神經(jīng)保護作用。

據(jù)報道[1-3]全球每年因脊髓損傷導致自主運動及感覺功能損害的患者在1 150萬至5 340萬之間，且患者生活質(zhì)量與脊髓損傷程度密切相關。脊髓損傷目前尚無有效的治療手段。脊髓損傷后繼發(fā)性引起的炎癥反應嚴重影響著脊髓修復[4-5]，其中中性粒細胞發(fā)揮著重要作用[6]。而髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)是中性粒細胞活化的標志物，且中性粒細胞趨化因子-1(cytokine-induced neutrophil chemoattractant,CINC-1)的濃度梯度是中性粒細胞跨越血管內(nèi)皮的基礎。褪黑素(melatonin,MT)是于1956年被Lerner和其同事從牛松果體組織中提取出來的兩性分子。有證據(jù)[7-10]表明褪黑素具有神經(jīng)保護、減少氧化應激、減輕水腫等作用。但其是否可通過減少CINC-1的含量從而減輕炎癥反應目前尚未見報道。該研究旨在通過脊髓損傷后立即注射褪黑素制劑，觀察短期內(nèi)脊髓組織中CINC-1、MPO的變化，探討褪黑素在局部炎癥反應中的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雌性SPF級SD大鼠108只，體重(230±20) g，購于河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK(豫)2010-0002。實驗動物自由飲水、隨意進食，12 h照明，實驗過程中對動物的操作均按照動物倫理學的要求進行。

1.2 主要試劑及儀器 Trizol試劑、Maker、RT試劑盒、PCR試劑盒均購自Transgene公司；引物購自北京博大泰克公司；MPO測試盒購自南京建成公司；MT、DEPC、EB購自美國Sigma公司。PCR GeneAmp System(美國Applied Biosystems公司)；低溫離心機(美國Sigma公司)；圖像記錄分析系統(tǒng)(大連Jim-X Scientific)。

1.3 脊髓損傷動物模型的建立 用體積分數(shù)10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，術區(qū)備皮，取俯臥位固定于手術臺上。消毒、鋪巾，取背中段正中切口，以T11為中心顯露T10～T12棘突、椎板，暴露脊髓硬膜。采用改良Allen’s WD法，自距硬膜15 cm的高度用5 g的砝碼垂直落下，建立大鼠脊髓損傷模型。觀察到砝碼砸傷后硬膜表面出現(xiàn)充血水腫，雙下肢出現(xiàn)撲動且為回縮性，尾巴出現(xiàn)擺動且為痙攣性即為造模成功。術畢大量生理鹽水沖洗手術視野，適量青霉素鈉置于切口內(nèi)預防感染，再次消毒后縫合切口。

1.4 實驗分組 108 只SD健康成年雌性大鼠隨機分為假手術組、脊髓損傷組、褪黑素治療組，每組36只。脊髓損傷組在脊髓損傷后10 min按體重腹腔注射含體積分數(shù)5%乙醇的生理鹽水(MT溶劑)。褪黑素治療組給予100 mg/kg[11-12]的褪黑素制劑。假手術組僅行椎板切除而不損傷脊髓。為預防感染，每組大鼠均每日給予腹腔注射青霉素40萬單位。脊髓損傷組及褪黑素治療組術后每天給予人工輔助排尿排便4次。

1.5 HE染色檢測脊髓組織形態(tài)學變化 各組大鼠于術后1 h、6 h、12 h、1 d、3 d、5 d六個時間點再次麻醉后迅速開胸，用無菌冰生理鹽水500 mL心臟灌注，完整地切取T10～T12的脊髓組織。切取T10～T12頭端脊髓組織存放在液氮中，待行MPO活性測定及總RNA提?。磺腥10～T12尾端脊髓組織浸入體積分數(shù)10%中性甲醛固定 24 h，常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，用LE ICACM 1900恒冷箱切片機對脊髓組織作橫切面連續(xù)切片，切片厚度6 μm，放于溫水中，載玻片收集組織后，恒溫烘箱烘干進行HE染色。

1.6 脊髓組織中CINC-1 mRNA表達水平檢測 采用 RT-PCR 擴增法。取凍存脊髓標本于研缽內(nèi)研碎后采用Trizol法提取總 RNA，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，再以 GAPDH 為內(nèi)參進行 PCR 擴增。大鼠CINC-1引物序列：上游5’-ATT AGCCTACTGGTGGTGC-3’ ，下游5’-ACAGCCTGGC CTAAGTGA-3’,擴增產(chǎn)物大小為286 bp。大鼠GAPDH引物序列：上游5’-CACGGCAAGTTCAACGGCA CA-3’，下游5’-GCGGCATGTCAGATCCACAACG-3’，擴增產(chǎn)物大小為588 bp。取 5 μL 擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳并觀察電泳條帶，記錄圖像后進行分析，目的基因CINC-1 mRNA的表達量用CINC-1和GAPDH條帶的灰度值比值表示。

1.7 MPO活力測定 應用化學方法，嚴格按照髓過氧化物酶測試盒說明書測定。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0進行分析。術后不同時間點各組大鼠脊髓組織CINC-1 mRNA表達和MPO活力的比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 脊髓損傷建模情況 脊髓損傷組及褪黑素治療組均出現(xiàn)尿潴留、后肢癱瘓。術后各組大鼠進食水量、活動量明顯減少。各組大鼠切口均未出現(xiàn)感染情況。

2.2 各組脊髓組織中CINC-1 mRNA的表達 各組各時間點均出現(xiàn)286 bp 左右的特異性擴增條帶，電泳結(jié)果見圖1～3。各組脊髓組織中CINC-1 mRNA表達的比較見表1。脊髓損傷后12 h 各組大鼠脊髓中CINC-1 mRNA表達水平從高到低依次為脊髓損傷組、褪黑素治療組、假手術組(圖4)。脊髓損傷組及褪黑素治療組各個時間點CINC-1 mRNA的表達均高于假手術組，但褪黑素治療組上升程度小于脊髓損傷組。

M：Marker；1、2、3、4、5、6:分別為1 h、6 h、12 h、1 d、3 d和5 d。圖1 假手術組不同時間點 脊髓組織CINC-1 mRNA的RT-PCR結(jié)果

M：Marker；1、2、3、4、5、6:分別為1 h、6 h、12 h、1 d、3 d和5 d。圖2 脊髓損傷組不同時間點 脊髓組織CINC-1 mRNA的RT-PCR結(jié)果

M：Marker；1、2、3、4、5、6:分別為1 h、6 h、12 h、1 d、3 d和5 d。圖3 褪黑素治療組不同 時間點脊髓組織CINC-1 mRNA的RT-PCR結(jié)果

M：Marker；1、2、3:分別為假手術組、脊髓損傷組、褪黑素治療組。圖4 脊髓損傷后12 h各組大鼠 脊髓組織CINC-1 mRNA的RT-PCR結(jié)果表1 術后不同時間點各組大鼠脊髓組織CINC-1 mRNA的表達(n=6)

組別1h6h12h24h3d5d假手術組0.094±0.0040.091±0.0050.100±0.0130.092±0.0110.094±0.0090.094±0.008脊髓損傷組0.110±0.0040.177±0.006*0.850±0.041*0.572±0.025*0.319±0.019*0.154±0.010*褪黑素治療組0.098±0.0050.148±0.008*#0.545±0.039*#0.404±0.036*#0.208±0.016*#0.127±0.012*#

F組間=16.351，P<0.001；F時間=21.321，P<0.001；F交互=83.217，P<0.001；*：與假手術組比較，P<0.05；#：與脊髓損傷組比較，P<0.05。

2.3 各組大鼠脊髓組織MPO活力比較 結(jié)果見表2。

表2 術后不同時間點各組大鼠脊髓組織MPO 活力比較(n=6)

F組間=173.615，P<0.001；F時間=21.321，P<0.001；F交互=18.151，P<0.001；*：與假手術組比較，P<0.05；#：與脊髓損傷組比較，P<0.05。

2.4 各組脊髓組織HE染色結(jié)果 見圖5。脊髓損傷組和褪黑素治療組脊髓組織中可見中性粒細胞浸潤、組織內(nèi)結(jié)構(gòu)紊亂等變化，褪黑素治療組上述變化較脊髓損傷組輕。假手術組脊髓結(jié)構(gòu)無中性粒細胞浸潤、出血等變化。

A、B、C:分別為假手術組、脊髓損傷組、褪黑素治療組。圖5 各組大鼠脊髓組織HE染色結(jié)果(×400)

3 討論

褪黑素作為人體內(nèi)重要的神經(jīng)內(nèi)分泌活性物質(zhì)，對生物的衰老、氧化應激、晝夜節(jié)律、腫瘤、性成熟及生殖、免疫反應等均有調(diào)節(jié)作用。作者前期的實驗證實在急性脊髓損傷后給予100 mg/kg的褪黑素可明顯抑制脂質(zhì)過氧化反應、提高神經(jīng)生長因子表達等作用[13-14]。

CINC-1與人類IL-8功能及結(jié)構(gòu)相近，是人類IL-8的對應物。它不僅能特異性介導中性粒細胞跨越血管內(nèi)皮，還能誘導細胞膜表面表達黏附分子DC11b/CD18，使中性粒細胞結(jié)合內(nèi)皮細胞的能力增加[15]。而中性粒細胞的聚集、浸潤是炎性反應發(fā)生的關鍵步驟。中性粒細胞能夠活化和釋放氧化物增加內(nèi)皮黏附分子的表達，其中的彈性蛋白酶能增加血管通透性并能損害內(nèi)皮細胞完整性進而影響脊髓損傷的發(fā)展進程[16-17]。該實驗檢測了各組各個時間點CINC-1的表達情況，發(fā)現(xiàn)CINC-1在脊髓未受損傷的假手術組中均有少量表達且表達量在各個時間點無明顯變化。脊髓損傷組CINC-1表達在各個時間點均有明顯的增高，且在12 h達高峰，提示可能CINC-1參與了繼發(fā)性脊髓損傷的過程。而褪黑素治療組在脊髓損傷后6 h、12 h、1 d、3 d CINC-1 mRNA的表達均低于相同時間點的脊髓損傷組，提示在脊髓損傷后應用褪黑素可抑制CINC-1的表達。

中性粒細胞中存在大量的 MPO。它與中性粒細胞的絕對數(shù)量相關聯(lián)，是一個定量中性粒細胞對損傷組織浸潤的特異和敏感標記。該研究用化學方法檢測了MPO在假手術組、脊髓損傷組及褪黑素治療組中的變化情況，發(fā)現(xiàn)在假手術組中能檢測出低活力的MPO，但隨著時間變化MPO活力無明顯變化。在脊髓損傷組，損傷區(qū)脊髓組織內(nèi)MPO活力明顯升高，傷后1 d達高峰。隨著觀察時間的延長，MPO活力逐漸減弱，但至脊髓損傷后5 d仍維持較高水平。褪黑素治療組與脊髓損傷組有相同的變化規(guī)律，且褪黑素治療組在脊髓損傷后 6 h、12 h、1 d、3 d MPO活力明顯低于脊髓損傷組。該研究結(jié)果表明MPO與CINC-1有相似的表達規(guī)律，MPO活力在CINC-1表達達高峰之后12 h也達峰值。

綜上所述，作者認為CINC可能通過介導中性粒細胞浸潤而參與繼發(fā)性脊髓損傷過程，而且在急性脊髓損傷后給予褪黑素，會通過抑制CINC-1的表達減少中性粒細胞對損傷脊髓的浸潤，從而減輕炎癥反應，起到一定的神經(jīng)保護作用。

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(2016-01-22收稿 責任編輯李沛寰)

Effects of melatonin on expression of MPO and CINC-1 in rats with acute spinal cord injury

MIAOJinhong1),ZHUHaiyang2),ZHONGBin2),CUIHao2),WANGXin2)，LIYang2),XUYusheng2)

1)TheFirstAffiliatedHospital,Zhengzhou450052 2)DepartmentofOrthopedics，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

melatonin;spinal cord injury;cytokine-induced neutrophil chemoattractant;myeloperoxidase；rat

Aim: To investigate the effects of melatonin(MT) on expression of myeloperoxidase(MPO) and cytokine-induced neutrophil chemoattractant(CINC)-1 in rats after acute spinal cord injury. Methods: Totally 108 SD rats were randomly allocated into 3 groups:sham operation group(group A，n=36),spinal cord injury group (group B，n=36), and MT treatment group (group C，n=36). Group B and C were established SCI animal models at T11 level. Lamina of vertebra was cut without spinal cord injury in the sham operation group. The rats of group C were injected 5%(V/V) alcohol into abdominal cavity after spinal cord injury while the rats of group B were injected MT(100 mg/kg). Fetching the spinal tissue at 1 h, 6 h, 12 h, 1 d, 3 d and 5 d after spinal cord injury. Chemical method was used to detect the expression of MPO. HE staining was performed to observe the pathological changes of the spinal cord in the 3 groups respectively. RT-PCR was used to detect the expression of CINC-1 mRNA in spinal cord tissue. Results: There were similar changing patterns of contents of CINC-1 and MPO, and the peak time of MPO was 12 h later than CINC-1. Compared the three groups except 1 h,group B had the highest level and group A had the lowest level regarding to the contents of CINC-1 and MPO, and the differences among them were statistical(P<0.05).Conclusion: MT could inhibit the expression of CINC-1 and reduce neutrophil infiltration,thus relieve inflammation reaction and protect spinal cord from damage.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.017

*河南省國際科技合作項目 134300510005

R681.5+4