電針對(duì)小鼠慢傳輸型便秘模型結(jié)腸動(dòng)力學(xué)影響的神經(jīng)-內(nèi)分泌機(jī)制研究

阮嬰丹,趙征宇

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電針對(duì)小鼠慢傳輸型便秘模型結(jié)腸動(dòng)力學(xué)影響的神經(jīng)-內(nèi)分泌機(jī)制研究

阮嬰丹1,趙征宇2

(1.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院,臺(tái)州 318020;2.成都中醫(yī)藥大學(xué),成都 610000)

目的 通過觀察電針干預(yù)下慢傳輸型便秘(slow transit constipation, STC)模型小鼠結(jié)腸動(dòng)力學(xué)的效應(yīng)改變,探討其神經(jīng)-內(nèi)分泌作用機(jī)制。方法 將40只雌性昆明種小鼠隨機(jī)分為A組(STC模型電針治療組)、B組(STC模型電針預(yù)防組)、C組(STC模型對(duì)照組)和D組(空白對(duì)照組),每組10只。A組在造模成功后取上巨虛和大腸俞進(jìn)行電針治療;B組于造模開始30 d后介入電針治療;C組和D組采用相同方法固定,不予針刺。治療結(jié)束后采用碳末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)計(jì)算腸推進(jìn)率,并用放免法測(cè)定小鼠結(jié)腸組織中P物質(zhì)(SP)和生長(zhǎng)抑素(SS)的含量。結(jié)果 C組小腸推進(jìn)率低于D組,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (＜0.05);A組和B組腸推進(jìn)率均優(yōu)于C組(＜0.05);小鼠結(jié)腸組織中,C組SP含量均低于A組、B組和D組,而SS含量則均高于其他3組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。結(jié)論 電針可有效改善STC模型小鼠的結(jié)腸動(dòng)力障礙問題。通過調(diào)節(jié)腸神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)進(jìn)而改善STC模型小鼠結(jié)腸動(dòng)力障礙是電針治療STC模型小鼠的主要作用機(jī)制。

針刺療法;電針;便秘;結(jié)腸動(dòng)力學(xué);P物質(zhì);生長(zhǎng)抑素;慢傳輸型便秘

慢傳輸型便秘(slow transit constipation, STC),作為功能性便秘的常見類型,是指由于結(jié)腸動(dòng)力障礙使內(nèi)容物滯留于結(jié)腸或結(jié)腸通過緩慢的便秘,結(jié)腸測(cè)壓顯示結(jié)腸動(dòng)力降低[1-4]。國(guó)內(nèi)報(bào)道STC的發(fā)病率占功能性便秘的10.3%～45.5%,且有上升趨勢(shì)[5]。

STC不僅是影響現(xiàn)代人生活質(zhì)量的重要良性疾病之一,而且與大腸癌發(fā)病關(guān)系密切[6-9]。胃腸動(dòng)力學(xué)和胃腸神經(jīng)遞質(zhì)是目前包括STC在內(nèi)的功能性胃腸疾病的研究熱點(diǎn),現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system, ENS)以及腸神經(jīng)遞質(zhì)在STC的發(fā)病中起著重要作用。在眾多的腸神經(jīng)遞質(zhì)中,肽能神經(jīng)遞質(zhì)如興奮性神經(jīng)遞質(zhì)P物質(zhì)(substance P, SP)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)生長(zhǎng)抑素(somatostatin, SS)在ENS病變中越來越受到關(guān)注[10-12]。

本研究采用復(fù)方地芬諾酯法復(fù)制小鼠STC模型,通過電針對(duì)模型動(dòng)物結(jié)腸動(dòng)力學(xué)影響的效應(yīng)觀察,以及對(duì)模型結(jié)腸組織中SP和SS的含量測(cè)定,初步探討電針治療STC的結(jié)腸動(dòng)力學(xué)影響及其神經(jīng)-內(nèi)分泌機(jī)制,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理

40只雌性昆明種小鼠,體重為(20±2)g,由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。采用查隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為A組、B組、C組和D組,每組10只。A組、B組和C組均采用復(fù)方地芬諾酯造模,A組造模后采用電針治療;B組造模期間采用電針治療;C組不予以針刺治療。D組為空白對(duì)照,采用蒸餾水灌胃,不予針刺治療。

1.2 試劑與儀器

復(fù)方地芬諾酯片(江蘇常州康普藥業(yè)有限公司,0702019);阿拉伯樹膠(泰安鼎力膠業(yè)有限公司);活性炭(廣州金駿龍?zhí)繕I(yè)化工有限公司);碘[125I]SP放免分析藥盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司)。

電子天平DT500(常熟市百靈天平儀器有限公司);KUBOTA高速冷凍離心機(jī)(日本九保田制造);電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)DY89-Ⅰ型(寧波新芝科器研究所);低溫冰箱(無錫晟澤理化器械有限公司);G6805-2型電針儀(上海斯米達(dá)醫(yī)療器械有限公司);華佗牌針灸針(0.30 mm×13 mm,蘇州醫(yī)療用品長(zhǎng)有限公司);刻度離心管 (2 mL,上海狄氏醫(yī)療器械有限公司);SN-695B型智能放免g測(cè)量?jī)x(上海核所日環(huán)光電儀器有限公司);LXJ-ⅡB多管離心機(jī)(常溫,上海安亭科學(xué)儀器廠);DL- 5000B低溫離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.3 造模與治療方法

1.3.1 復(fù)方地芬諾酯混懸液的配制[13]

取復(fù)方地芬諾酯(以鹽酸地芬諾酯含量計(jì)),用研缽研碎成極細(xì)后加水配制成0.2 mg/mL的混懸液。

1.3.2 墨汁的配制[14]

稱取阿拉伯樹膠100 g,加水800 mL,煮沸至溶液透明,稱取活性碳(粉狀)50 g,加入上述溶液中煮沸3次,待溶液溫度降至室溫時(shí)加水定容至1000 mL。置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?用前搖勻。

1.3.3 小鼠慢傳輸型便秘模型制備

小鼠自由飲水投食,適應(yīng)性馴養(yǎng)5 d后,依照文獻(xiàn)[12-13]方法,以復(fù)方地芬諾酯20 mg/kg灌胃,連續(xù)60 d,直至小鼠糞便連續(xù)變少,便質(zhì)變干、變硬。

1.3.4 治療方法

參照《獸醫(yī)針灸學(xué)》《比較解剖學(xué)》的方法取雙側(cè)上巨虛、大腸俞穴。局部常規(guī)消毒后,采用0.30 mm×13 mm毫針進(jìn)行針刺,針刺深度為0.3 cm,針尾部接電針儀導(dǎo)線,采用疏密波,電壓為3 V,頻率為20～100 Hz。每日1次,每次20 min,正負(fù)電極隔日互換。B組于造模開始30 d后介入電針治療,每星期治療6次,間歇1 d,連續(xù)治療8星期;A組在造模成功后進(jìn)行電針治療,每星期治療6次,間歇1 d,連續(xù)治療4星期。針刺時(shí)間固定于下午1～6點(diǎn)。所有動(dòng)物均用自制籠具同法固定,C組和D組不予針刺。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 碳末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)[14]

采用碳末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)觀察電針對(duì)小鼠腸動(dòng)力的影響。小鼠禁食24 h后(不禁水),把配制好的墨汁按各鼠體重以0.2 mL/10 g灌胃,30 min后立即以斷髓法處死小鼠,剖開腹腔,截取十二指腸及全段小腸(幽門至結(jié)腸回盲段),輕輕展成一直線,平鋪在玻璃板上,測(cè)量幽門至碳末前沿和小腸全長(zhǎng)的距離,計(jì)算碳末推進(jìn)率。小腸推進(jìn)率＝[碳末前沿至幽門的距離－小腸全長(zhǎng)(幽門至回盲部)]×100%。

1.4.2 SP和SS含量

采用SP和SS含量變化情況觀察電針對(duì)小鼠結(jié)腸中部分神經(jīng)遞質(zhì)的影響。小鼠斷髓法處死,取小鼠結(jié)腸段(降結(jié)腸距脾曲1 cm左右處取材,橫結(jié)腸距脾曲1 cm左右處取材)約2 cm,反復(fù)用生理鹽水沖洗,秤重并包放于鋁箔紙內(nèi),置于-80℃冰箱內(nèi)貯存。解凍后,立即加入生理鹽水1 mL碾磨,制成勻漿(結(jié)腸組織用自動(dòng)勻漿機(jī)勻漿)。4 ℃,3500 rpm離心l5 min,取上清液在-20℃低溫冰箱內(nèi)保存。然后采用放射免疫法測(cè)定各組動(dòng)物結(jié)腸中SP與SS含量。測(cè)定方法按放免試劑盒說明書進(jìn)行,由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心放射免疫科協(xié)助檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用配對(duì)檢驗(yàn)。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腸推進(jìn)率比較

C組小鼠腸推進(jìn)率與D組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。A組和B組小鼠腸推進(jìn)率與C組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。A組小鼠腸推進(jìn)率與B組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠腸推進(jìn)率比較 (±s,%)

表1 各組小鼠腸推進(jìn)率比較 (±s,%)

組別n小腸推進(jìn)率 A組10 66.25±8.031) B組10 67.61±9.171) C組1055.45±9.79 D組10 65.79±9.391)

注:與C組比較1)＜0.05

2.2 各組小鼠結(jié)腸組織中SP和SS含量比較

C組小鼠結(jié)腸組織中SP和SS含量分別與A組、B組和D組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。A組、B組和D組小鼠結(jié)腸組織中SP和SS含量組間兩兩比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠結(jié)腸組織中SP和SS含量比較 (±s)

表2 各組小鼠結(jié)腸組織中SP和SS含量比較 (±s)

組別nSP(pg/mL)SS(pg/mL) A組1012.7750±6.64721)18.0037±5.14661) B組1010.2472±5.34921)14.7724±4.11581) C組104.3091±1.576631.0668±11.8277 D組1013.0420±5.54051)14.8947±7.08411)

注:與C組比較1)＜0.05

3 討論

3.1 關(guān)于便秘針灸處方(穴位)的選擇

大腸俞和上巨虛是臨床上治療便秘的常用要穴。大腸俞為膀胱經(jīng)經(jīng)穴,亦是大腸的背俞穴,具有調(diào)理胃腸、通腑行滯之功,主治腹脹、便秘等腸道疾病。解剖位置上,大腸俞穴處布有第3腰神經(jīng)皮支,深層為腰叢。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,控制胃腸道的自主神經(jīng)多數(shù)從背部脊髓T6-L2、S2-4發(fā)出,刺激相應(yīng)背俞穴可通過相應(yīng)自主神經(jīng)調(diào)整胃腸功能。

便秘的病位在大腸,但與胃的關(guān)系密切。脾主升清,胃主降濁,為氣機(jī)升降之樞紐。六腑以通為用,胃以通為順。早在《內(nèi)經(jīng)》上就明確闡述了胃與大腸密不可分的關(guān)系?！鹅`樞·本輸》:“大腸、小腸皆屬于胃?！薄鹅`樞·脹論》:“六府脹,胃脹者,腹?jié)M,胃脘痛,鼻聞焦臭,妨于食,大便難?！弊汴?yáng)明胃經(jīng)循行腹內(nèi)支脈“下循脛外廉”,上巨虛是大腸的下合穴,合治六腑。兩穴共用,亦利于動(dòng)物體位固定后便于電針治療操作。

3.2 電針對(duì)STC模型小鼠結(jié)腸動(dòng)力學(xué)的影響

結(jié)腸的運(yùn)動(dòng)功能表現(xiàn)為①對(duì)腸內(nèi)容物進(jìn)行混合、攪拌,使其附著于黏膜表面;②推送糞便使之充分吸收水分、電解質(zhì)及降解產(chǎn)物;③暫時(shí)貯存糞便;④激發(fā)排便反射。結(jié)腸的運(yùn)動(dòng)具有袋狀往返運(yùn)動(dòng)、分節(jié)推進(jìn)運(yùn)動(dòng)、多袋推進(jìn)運(yùn)動(dòng)、蠕動(dòng)及集團(tuán)運(yùn)動(dòng)等5種形式[15]。De Schryver AM等[16]研究認(rèn)為結(jié)腸動(dòng)力障礙是慢傳輸型便秘發(fā)生的重要原因。

碳末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)是目前比較常用的評(píng)價(jià)腸動(dòng)力狀況的效應(yīng)指標(biāo)。本次碳末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,C組腸推進(jìn)率與D組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05),符合STC腸內(nèi)容物通過緩慢的特點(diǎn),說明本次小鼠STC模型造模成功。

針灸治療STC療效確切[17-21]。本實(shí)驗(yàn)中A組和B組結(jié)腸推進(jìn)率均優(yōu)于C組(＜0.05),且與D組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＞0.05),提示實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床報(bào)道相符。說明電針療法能通過解決結(jié)腸動(dòng)力障礙問題,從而恢復(fù)正常排便功能。同時(shí),實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)A組腸推進(jìn)率與B組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05),說明針刺介入時(shí)間的早晚對(duì)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果未見明顯影響。

3.3 電針對(duì)STC模型小鼠SP和SS的影響[22-24]

P物質(zhì)是最早發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)肽,屬于速激肽家族。SP由神經(jīng)細(xì)胞和胃腸內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生并分泌,廣泛分布于周身各組織器官,其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道是SP存在的兩個(gè)主要部位。SP可作為遞質(zhì)或胃腸激素釋放,它對(duì)消化道平滑肌有強(qiáng)烈的刺激作用,增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)。

SS是由14個(gè)氨基酸殘基組成的環(huán)肽,因能抑制垂體前葉生長(zhǎng)激素的釋放而得名。生長(zhǎng)抑素能神經(jīng)元只在肌間神經(jīng)叢中分布,能抑制胃腸平滑肌運(yùn)動(dòng),延長(zhǎng)腸道通過時(shí)間。在STC患者的結(jié)腸黏膜中,SS含量明顯上升。SS還能通過特異性受體直接作用于人結(jié)腸環(huán)形肌細(xì)胞,抑制平滑肌收縮。此外,SS可以通過刺激肥大細(xì)胞釋放生物活性物質(zhì)影響腸道動(dòng)力。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與D組比較,C組結(jié)腸組織中SP含量顯著降低(＜0.05),SS含量顯著升高(＜0.05),這符合兩者對(duì)腸道促進(jìn)和抑制的相反作用,且與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道符合。A組和B組結(jié)腸組織中SP和SS含量與D組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05),且兩組間SP和SS含量比較亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均＞0.05)?？梢?通過電針治療,可促進(jìn)STC型小鼠腸道分泌相應(yīng)的腦腸肽,以維衡持胃腸道興奮性遞質(zhì)SP和抑制性遞質(zhì)SS之間的平衡,即恢復(fù)其正常的化學(xué)性調(diào)控,從而改善胃腸動(dòng)力障礙。且針刺介入時(shí)間的早晚對(duì)調(diào)節(jié)小鼠結(jié)腸內(nèi)SP和SS含量無明顯影響。

ENS是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的神經(jīng)系統(tǒng),接受自主神經(jīng)系統(tǒng)(交感神經(jīng)與副交感神經(jīng))的雙重外來神經(jīng)支配。研究結(jié)果表明上起腹部的天樞穴,下至下肢的豐隆穴,其間穴位的神經(jīng)節(jié)段分布范圍為T10-L5,與大腸神經(jīng)節(jié)段分布相對(duì)應(yīng)。因此,我們推測(cè)針刺治療STC的可能作用機(jī)理之一是通過局部的反射弧(脊髓胸、腰段)接受軀體傳入神經(jīng)傳入的針刺刺激信息,再由相應(yīng)節(jié)段的交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)整合,傳至胃腸道的內(nèi)在神經(jīng)系統(tǒng)(ENS),促使腸神經(jīng)元調(diào)整相應(yīng)遞質(zhì)的釋放,從而恢復(fù)紊亂的胃腸道功能,即恢復(fù)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)調(diào)控之一。

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Study of the Neuroendocrine Mechanism of the Action of Electroacupuncture on Colonic Motility in a Mouse Model of Slow Transit Constipation

-1,-2.

1.’,318020,; 2.,610000,

Objective To investigate the intervention effect of electroacupuncture on colonic motility in a mouse model of slow transit constipation (STC) and explore the neuroendocrine mechanism of its action. Methods Forty female Kunming mice were randomly allocated to groups A (STC model electroacupuncture treatment), B (STC model electroacupuncture prevention), C (STC model control) and D (blank control), 10 cases each. Group A received electroacupuncture at points Shangjuxu and Dachangshu after successful model making; group B, electroacupuncture at 30 days after the beginning of model making; groups C and D, no acupuncture, fastened by the same method. After the completion of treatment, intestinal propulsion rate was calculated by the charcoal powder propelling test and the substance P (SP) and somatostatin (SS) contents of mouse colon were measured by radioimmunoassay. Results Intestinal propulsion rate was lower in group C than in group D; there was a statistically significant difference between the two groups (＜0.05). Intestinal propulsion rate was higher in groups A and B than in group C (both＜0.05). The SP content of mouse colon was lower and the SS content was higher in group C than in groups A, B and D; there were statistically significant differences (＜0.05). Conclusions Electroacupuncture can effectively reduce colonic motility disorders in a mouse model of STC. The main mechanism of electroacupuncture treatment of slow transit constipation in a mouse model of STC is regulating intestinal neuroendocrine system to reduce colonic motility disorders.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Constipation; Colonic motility; Substance P; Somatostatin; Slow transit constipation

1005-0957(2016)11-1358-04

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.11.1358

2016-05-03

四川省自然科學(xué)基金項(xiàng)目

阮嬰丹(1983 - ),女,主治醫(yī)師

趙征宇(1968 - ),男,副教授