圈養(yǎng)林麝養(yǎng)殖場內(nèi)銅綠假單胞菌的分布及其耐藥性分析

郗立新，文彩芳，趙 珊，陳珍容，卓利苗，楊光友，顏其貴，2，*，鄭從軍，王洪永，夏中林

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130； 3.四川省寶興縣林業(yè)局，四川 雅安 625700； 4.四川夾金山逢春養(yǎng)殖科技有限公司，四川 德陽 618100； 5.四川省峨眉山市林業(yè)管理局，四川 峨眉山 614200)

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圈養(yǎng)林麝養(yǎng)殖場內(nèi)銅綠假單胞菌的分布及其耐藥性分析

郗立新1，文彩芳1，趙 珊1，陳珍容1，卓利苗1，楊光友1，顏其貴1，2，*，鄭從軍3，王洪永4，夏中林5

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130； 3.四川省寶興縣林業(yè)局，四川 雅安 625700； 4.四川夾金山逢春養(yǎng)殖科技有限公司，四川 德陽 618100； 5.四川省峨眉山市林業(yè)管理局，四川 峨眉山 614200)

從陜西鎮(zhèn)坪、四川寶興兩個(gè)林麝養(yǎng)殖中心共采集124份樣品進(jìn)行銅綠假單胞菌的分離鑒定，并采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)其耐藥情況。結(jié)果顯示，共分離出60株銅綠假單胞菌，其中鎮(zhèn)坪34株，寶興26株。兩個(gè)養(yǎng)殖場銅綠假單胞菌檢出率由高到低依次為傷口膿汁>死亡林麝組織器官>傷皮>鼻拭子>土壤>糞便>尿液>空氣，且鎮(zhèn)坪比寶興的總檢出率高。所分離的60株銅綠假單胞菌耐藥表型趨于一致，都對(duì)阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星敏感，對(duì)亞胺培南中等敏感，對(duì)多西環(huán)素、四環(huán)素、磺胺異惡唑嚴(yán)重耐藥。

林麝；銅綠假單胞菌；分離鑒定；藥敏

林麝因產(chǎn)麝香而成為珍貴的藥用資源動(dòng)物。近年來，由于麝香需求量增加，野生林麝的捕殺量迅速增多，國家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物——林麝的野生資源遭到嚴(yán)重破壞[1]。開展規(guī)范化人工養(yǎng)麝是保護(hù)野生資源、解決麝香資源短缺的有效途徑，但目前我國在林麝的人工養(yǎng)殖技術(shù)、疾病防治等方面的研究還較少[2-3]。在實(shí)際生產(chǎn)中，化膿性疾病是林麝的主要疾病之一，對(duì)人工養(yǎng)殖影響很大[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，患化膿性疾病的林麝占病麝的50%以上，在因病死亡的林麝中，與化膿有關(guān)的占死亡總數(shù)50%以上[5]。林麝化膿性疾病病原多樣、病因復(fù)雜，但主要以銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)、金黃色葡萄球菌、化膿棒狀桿菌等感染為主[6]。

本研究通過對(duì)圈養(yǎng)林麝飼舍環(huán)境以及林麝體表、鼻腔分泌物、尿液和糞便等采樣檢測(cè)，分析銅綠假單胞菌在飼舍內(nèi)的分布與引發(fā)化膿性疾病間的關(guān)系，為防控銅綠假單胞菌感染提供依據(jù)，同時(shí)采用微量肉湯稀釋法調(diào)查銅綠假單胞菌的耐藥情況，為臨床上優(yōu)化用藥提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

參照文獻(xiàn)[7]的方法，于空氣、土壤、糞便、飲水、污水、臥臺(tái)、鼻腔黏液棉拭子、尿液、傷皮、膿汁、血液、死亡病麝部分臟器共采集124份樣品，其中，64份采集于四川寶興逢春林麝養(yǎng)殖場，60份采集于陜西鎮(zhèn)坪逢春林麝養(yǎng)殖場。病麝臟器樣品來源于前述養(yǎng)殖場2014年10月—2015年4月間非正常死亡的林麝，其余樣品均分別在前述養(yǎng)殖場內(nèi)于同一時(shí)間完成采集。

1.2 主要試劑及抗生素藥品

微量生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司；MH肉湯培養(yǎng)基、NAC培養(yǎng)基、NA營養(yǎng)瓊脂、無菌脫纖綿羊血購自青島日水生物技術(shù)有限公司；DNA分子標(biāo)記、2×TaqPCR master mix購自TaKaRa公司；頭孢曲松(CRO)、多西環(huán)素(DOX)、阿米卡星(AMK)、亞胺培南(IPM)、慶大霉素(GEN)、阿奇霉素(AZI)、環(huán)丙沙星(CIP)、四環(huán)素(TET)、氨曲南(AZM)、磺胺異惡唑(SUL)均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；大腸埃希菌ATCC25922與銅綠假單胞菌ATCC27853用作質(zhì)控菌株，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.3 樣品處理及接菌計(jì)數(shù)

[8-9]的方法進(jìn)行樣品預(yù)處理接菌、樣品細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)及樣品中銅綠假單胞菌計(jì)數(shù)。

1.4 菌落形態(tài)特征及染色鏡鑒觀察

將銅綠假單胞菌純化后分別接種于NA營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、NAC培養(yǎng)基及血瓊脂培養(yǎng)基，對(duì)菌落形態(tài)進(jìn)行描述，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡鑒。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌16S rRNA通用引物[10]，對(duì)菌株進(jìn)行PCR鑒定。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶純化回收后送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.6 理化特性觀察

結(jié)合菌株來源情況以及菌落形態(tài)特征，分別隨機(jī)從鎮(zhèn)坪、寶興樣品中各選取10株，共20株分離菌株，純化培養(yǎng)后，按常規(guī)方法進(jìn)行生化鑒定。

1.7 藥敏試驗(yàn)

參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(clinical and laboratory standards institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)，采用微量肉湯稀釋法對(duì)所有分離菌株進(jìn)行耐藥表型測(cè)定，并進(jìn)行多重耐藥分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 林麝飼舍環(huán)境細(xì)菌分布

共采集124份樣品，除飲水、臥臺(tái)、血液樣品外，其余樣品類型均分離出銅綠假單胞菌，共計(jì)60株，其中，從鎮(zhèn)坪樣品中分離出34株，依次編為PA-ZP01至PA-ZP34，從寶興樣品中分離出26株，依次編為PA-BX01至PA-BX26。具體統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)詳見表1。

表1 林麝飼舍環(huán)境內(nèi)銅綠假單胞菌檢出情況
Table 1P.aeruginosadistribution in forest musk deer breeding farm

樣品來源Samplesource取樣地區(qū)Samplesite樣品數(shù)量Samplequantity檢出數(shù)量Detectedquantity檢出率Detectionrate/%空氣Air鎮(zhèn)坪Zhenping6233.3寶興Baoxing6116.7土壤Soil鎮(zhèn)坪Zhenping6350.0寶興Baoxing6116.7糞便Feces鎮(zhèn)坪Zhenping6350.0寶興Baoxing6350.0鼻拭子Nasalswabs鎮(zhèn)坪Zhenping4250.0寶興Baoxing4250.0飲水Water鎮(zhèn)坪Zhenping300寶興Baoxing300尿液Urine鎮(zhèn)坪Zhenping3133.3寶興Baoxing3133.3臥臺(tái)Bedroomsets鎮(zhèn)坪Zhenping300寶興Baoxing300傷皮Skinwounds鎮(zhèn)坪Zhenping4375.0寶興Baoxing4250.0膿汁Pus鎮(zhèn)坪Zhenping44100寶興Baoxing4250.0血液Blood鎮(zhèn)坪Zhenping300寶興Baoxing300剖解臟器Organs鎮(zhèn)坪Zhenping181688.9寶興Baoxing221463.6合計(jì)Total鎮(zhèn)坪Zhenping603456.7寶興Baoxing642640.6

2.2 菌落形態(tài)觀察

陜西鎮(zhèn)坪分離菌株在NA營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上主要形成2種菌落形態(tài)：一種為圓形，表面有金屬光澤，產(chǎn)藍(lán)綠色色素且有生姜?dú)馕?；一種為橢圓形，表面有金屬光澤，產(chǎn)藍(lán)綠色色素且有生姜?dú)馕?。四川寶興分離菌株在NA營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上主要形成1種圓形、表面有金屬光澤、產(chǎn)藍(lán)綠色色素且有生姜?dú)馕兜木湫螒B(tài)。60株分離菌在NAC培養(yǎng)基上均產(chǎn)生明顯的玫紅色，在血瓊脂培養(yǎng)基上均產(chǎn)生透明β-溶血環(huán)，革蘭氏染色鏡鑒結(jié)果均為革蘭氏陰性桿菌。

2.3 分離菌株的16S rRNA擴(kuò)增及測(cè)序鑒定結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)16S rRNA的擴(kuò)增片段大小約1500bp，與預(yù)期目的片段大小一致。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST分析比對(duì)顯示，所有分離菌株的16S rRNA基因部分序列與銅綠假單胞菌同源性高達(dá)99%以上，確定分離菌株均為銅綠假單胞菌。

2.4 分離菌株的理化鑒定

將單個(gè)菌落接種于微量生化管中進(jìn)行鑒定，培養(yǎng)特性結(jié)果顯示，該菌發(fā)酵糖的能力不強(qiáng)，分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，分解尿素，不形成吲哚，氧化酶試驗(yàn)陽性，可利用枸椽酸鹽，不產(chǎn)生H2S，MR、VP試驗(yàn)均為陰性。對(duì)照說明書檢索結(jié)果，所選取菌株均為銅綠假單胞菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

不同地區(qū)林麝養(yǎng)殖場內(nèi)分離的銅綠假單胞菌對(duì)10種抗菌藥物的耐藥率總體趨于一致，但是部分抗菌藥物耐藥率存在較大差異(表2)：鎮(zhèn)坪所有分離株對(duì)頭孢曲松、阿奇霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、磺胺異惡唑均表現(xiàn)出極高的耐藥性，對(duì)氨曲南、亞胺培南表現(xiàn)出中等耐藥性，對(duì)阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星表現(xiàn)出敏感性；寶興所有分離株對(duì)多西環(huán)素、四環(huán)素、磺胺異惡唑表現(xiàn)出極高的耐藥性，對(duì)頭孢曲松、阿奇霉素、亞胺培南、氨曲南表現(xiàn)出中等耐藥性，對(duì)阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星表現(xiàn)出敏感性。

表2 銅綠假單胞菌分離株對(duì)抗菌藥物的耐藥率
Table 2 Antimicrobial resistance rate ofP.aeruginosaisolates

取樣地區(qū)Samplesite樣品來源Samplesource分離菌株數(shù)No.ofisolates耐藥率Ratioofdrugresistance/%頭孢曲松CRO氨曲南AZM阿奇霉素AZI阿米卡星AMK慶大霉素GEN多西環(huán)素DOX四環(huán)素TET磺胺異惡唑SUL環(huán)丙沙星CIP亞胺培南IPM鎮(zhèn)坪空氣Air210050.010000100100100050.0Zhenping土壤Soil366.733.31000010066.7100033.3糞便Feces310001000066.710010000鼻拭子Nasalswabs2100010000100100100050.0尿液Urine110001000010010010000傷皮Skinwounds3100010000100100100033.3膿汁Pus475.025.01000010075.0100025.0剖解臟器Organs1687.531.275.06.2537.5100100100037.5合計(jì)Total3488.223.588.22.9417.697.194.1100032.4寶興空氣Air100100001001001000100 Baoxing土壤Soil11001001000010010010000糞便Feces3033.366.700100100100066.7鼻拭子Nasalswabs250.050.000010010010000尿液Urine101000001001001000100傷皮Skinwounds250.001000010010010000膿汁Pus210050.050.0001001001000100剖解臟器Organs1428.614.371.47.147.14100100100035.7合計(jì)Total2664.329.265.43.843.84100100100046.2

2.6 多重耐藥分析

對(duì)60株林麝養(yǎng)殖場內(nèi)分離得到的銅綠假單胞菌對(duì)10種抗菌藥物的多重耐藥性進(jìn)行分析，從圖1可以看出，60株菌對(duì)所有抗菌藥物均呈3耐及3耐以上的多重耐藥性，多重耐藥菌株中以5耐(鎮(zhèn)坪41.18%、寶興46.15%)為主。

圖1 分離到的銅綠假單胞菌對(duì)不同抗菌藥物的多重耐藥性Fig.1 Multi-resistance of 60isolates of P.aeruginosa to different antimicrobial agents

3 討論

3.1 林麝飼舍環(huán)境中銅綠假單胞菌的分布檢測(cè)與分離鑒定

目前，關(guān)于圈養(yǎng)林麝養(yǎng)殖場內(nèi)銅綠假單胞菌的分布研究未見報(bào)道。張鄧華等[7]通過對(duì)重慶動(dòng)物園動(dòng)物環(huán)境中常見病原菌的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物飼舍環(huán)境的細(xì)菌污染指數(shù)除與飼舍內(nèi)的通風(fēng)、溫度、濕度、光照等因素有關(guān)外，與飼舍中所飼養(yǎng)的動(dòng)物種類、動(dòng)物的生活習(xí)性及動(dòng)物的密度和日常飼養(yǎng)管理也有密切的關(guān)系。本研究鎮(zhèn)坪與寶興樣品中銅綠假單胞菌檢出率存在明顯差異，從試驗(yàn)結(jié)果可以看出：(1)飼舍內(nèi)通風(fēng)不良，且鎮(zhèn)坪比寶興情況更嚴(yán)重，使得空氣成為感染源，容易引發(fā)傷口感染或呼吸道感染；(2)銅綠假單胞菌可通過糞便、尿液排出，并可能污染土壤使其成為感染源；(3)除死亡病麝臟器外，兩個(gè)地區(qū)養(yǎng)殖場中傷口化膿液與傷口皮膚的銅綠假單胞菌檢出率最高，可能是銅綠假單胞菌與其他細(xì)菌的混合感染造成傷口化膿；(4)雖然飲水、臥臺(tái)和血液樣品中均未檢出銅綠假單胞菌，但是飲水、臥臺(tái)樣品中仍檢出其他細(xì)菌，因其與林麝有直接接觸，所以平時(shí)要加強(qiáng)消毒滅菌，減少患病風(fēng)險(xiǎn)。

伍清林等[11]對(duì)南京紅山森林動(dòng)物園部分動(dòng)物的生存環(huán)境進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，土壤中的細(xì)菌菌落總數(shù)、銅綠假單胞菌數(shù)相對(duì)較多，土壤是動(dòng)物感染環(huán)境中銅綠假單胞菌的主要來源。但本研究顯示，鎮(zhèn)坪與寶興兩個(gè)養(yǎng)殖場最大的感染源是傷口膿汁、傷皮，其次為鼻拭子、土壤、糞便、尿液和空氣。建議兩個(gè)養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)管理人員加強(qiáng)飼舍通風(fēng)，注意防寒保暖，減少外界因素對(duì)林麝的刺激，定期對(duì)飼舍進(jìn)行全面消毒，每天按時(shí)打掃圈舍并及時(shí)更換飲水，做好疾病監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)病麝及時(shí)隔離，防止交叉感染。

3.2 銅綠假單胞菌的耐藥性分析

多數(shù)報(bào)道認(rèn)為，銅綠假單胞菌對(duì)慶大霉素、多粘菌素、羧芐西林等藥物敏感，對(duì)治療銅綠假單胞菌感染引起的化膿性炎癥有效[12-13]；也有報(bào)道認(rèn)為，頭孢他啶是治療銅綠假單胞菌感染的首選藥物[14]。然而銅綠假單胞菌有復(fù)雜的耐藥機(jī)制，加之抗生素的不合理使用，總體來說耐藥率不斷上升[15]，這使其相關(guān)疾病的治療變得越來越棘手。

本試驗(yàn)中兩個(gè)地區(qū)養(yǎng)殖場分離的銅綠假單胞菌耐藥情況趨于一致，這與兩個(gè)養(yǎng)殖場所處的地理環(huán)境和抗菌藥物的使用情況密切相關(guān)。有報(bào)道認(rèn)為，環(huán)境脅迫是細(xì)菌變異進(jìn)化的重要誘因[16]，兩個(gè)養(yǎng)殖場均位于海拔1500m左右的山區(qū)，氣候類型都屬于亞熱帶山地濕潤氣候，環(huán)境條件基本一致。也有報(bào)道認(rèn)為，抗菌藥物的選擇壓力與細(xì)菌耐藥相關(guān)[17]，考慮到企業(yè)可能針對(duì)常見疾病的治療對(duì)各個(gè)養(yǎng)殖場的獸醫(yī)人員進(jìn)行過相同的指導(dǎo)培訓(xùn)，所以兩個(gè)養(yǎng)殖場在抗菌藥物的選擇和使用上也較為一致，這就造成了相同或者相近的抗菌藥物選擇壓力。60株分離菌對(duì)磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類抗菌藥物耐藥率高達(dá)65%以上，這可能是抗菌藥物的不合理使用與銅綠假單胞菌自身耐藥機(jī)制共同作用導(dǎo)致。鎮(zhèn)坪分離菌對(duì)頭孢曲松耐藥率較高，比較發(fā)現(xiàn)，該養(yǎng)殖場在治療林麝化膿性炎癥時(shí)均首選頭孢曲松，這可能是主要誘因。兩個(gè)養(yǎng)殖場的多重耐藥情況均十分嚴(yán)重，可能是獸醫(yī)人員長期使用同種藥物治療化膿性疾病所致，建議在使用抗生素藥物之前，進(jìn)行簡易藥敏試驗(yàn)并遵循試驗(yàn)結(jié)果合理用藥。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，喹諾酮類藥物是治療兩個(gè)養(yǎng)殖場銅綠假單胞菌感染的較為理想的藥物，可與氨基糖苷類抗菌藥物聯(lián)合用藥，以達(dá)到最佳的治療效果。

綜上所述，化膿性病灶是兩個(gè)林麝養(yǎng)殖場飼養(yǎng)環(huán)節(jié)中最大的銅綠假單胞菌污染源，喹諾酮類藥物是治療鎮(zhèn)坪、寶興林麝養(yǎng)殖場銅綠假單胞菌感染的最佳用藥。此研究結(jié)果可為跨地區(qū)林麝化膿性炎癥的防控與治療提供理論依據(jù)，同時(shí)也可為林麝的日常飼養(yǎng)管理提供科學(xué)參考。

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(責(zé)任編輯 高 峻)

Distribution-survey of Pseudomonas aeruginosa of captive forest musk deer and analysis of drug resistance

XI Li-xin1，WEN Cai-fang1，ZHAO Shan1，CHEN Zhen-rong1，ZHUO Li-miao1，YANG Guang-you1，YAN Qi-gui1，2，*，ZHENG Cong-jun3，WANG Hong-yong4，XIA Zhong-lin5

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.AnimalEpidemicDiseaseandHumanHealthKeyLaboratoryofSichuanProvince，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 3.SichuanBaoxingCountyForestryBureau，Ya’an625700，China; 4.SichuanFeng-chunBreedingTechnoloygCo.，Ltd,Deyang618100，China; 5.E’meishanForestryAdministrationBureauofSichuanProvince，E’meishan614200，China)

A total of 124samples were collected from Zhenping Country，Shaanxi Province and Baoxing Country，Sichuan Province，and were used to isolate and identifyPseudomonasaeruginosa，as well as to test their drug resistance by traditional bacteriological identification methods.It was shown that 60P.aeruginosastrains were isolated，of which 34were isolated from Zhenping，and 26were isolated from Baoxing.The detection rate decreased as wound pus>dead deer tissues and organs>skin wounds>nasal swabs>soil>feces>urine>air.The detection ratio of Zhenping samples was higher than that of Baoxing.All 60isolatedP.aeruginosastrains exhibited similar resistance phenotypes.All strains were sensitive to amikacin，gentamicin，ciprofloxacin，and were moderately sensitive to imipenem，but were resistance to doxycycline，tetracycline，sulphamethoxazole.

forest musk deer;Pseudomonasaeruginosa; isolation and identification; susceptibility

??(

)：

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.07

2016-04-13

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014SZ0132)

郗立新(1991—)，男，陜西鳳翔人，碩士研究生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物與免疫學(xué)。E-mail: 13547480554@163.com

*通信作者，顏其貴，E-mail: yanqigui@126.com

S855.1+2

A

1004-1524(2016)11-1847-06

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1847-1852

http://www.zjnyxb.cn

郗立新，文彩芳，趙珊，等.圈養(yǎng)林麝養(yǎng)殖場內(nèi)銅綠假單胞菌的分布及其耐藥性分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(11)： 1847-1852.