泥鰍和大鱗副泥鰍細(xì)胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及組織表達(dá)分析

劉士力，張愛(ài)菊，練青平，吳衛(wèi)君，賈永義，蔣文枰，李 飛

(1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州313001； 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306； 3.慶元縣水利局 水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江 慶元323800； 4.慶元縣水電學(xué)會(huì) 水產(chǎn)分會(huì)，浙江 慶元323800)

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泥鰍和大鱗副泥鰍細(xì)胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及組織表達(dá)分析

劉士力1，2，張愛(ài)菊1，練青平1，吳衛(wèi)君3，4，*，賈永義1，蔣文枰1，李 飛1

(1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州313001； 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306； 3.慶元縣水利局 水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江 慶元323800； 4.慶元縣水電學(xué)會(huì) 水產(chǎn)分會(huì)，浙江 慶元323800)

采用3′-和5′-RACE法克隆了泥鰍和大鱗副泥鰍CYP17-Ⅰ基因的cDNA全長(zhǎng)序列，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析其表達(dá)情況。結(jié)果表明，泥鰍CYP17-Ⅰ基因cDNA全長(zhǎng)1706bp，開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF) 1563bp，編碼520個(gè)氨基酸；大鱗副泥鰍CYP17-Ⅰ基因cDNA全長(zhǎng)1763bp，ORF長(zhǎng)1545bp，編碼514個(gè)氨基酸。2種鰍CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1個(gè)信號(hào)肽、1個(gè)跨膜區(qū)、1個(gè)保守的蛋白結(jié)構(gòu)域和3個(gè)功能保守區(qū)。相似度分析顯示，2種鰍之間CYP17-Ⅰ相似度為99%，與其他魚(yú)類的相似度也超過(guò)70%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，2種鰍之間關(guān)系最為接近，其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系基本符合傳統(tǒng)的分類地位。qRT-PCR結(jié)果顯示，CYP17-Ⅰ在2種鰍的腸、肌肉、心臟、胃、肝臟、精巢、卵巢、脾臟等8個(gè)組織均有表達(dá)，在精巢和卵巢中表達(dá)量相對(duì)較高。

細(xì)胞色素；泥鰍；大鱗副泥鰍；CYP17-Ⅰ

細(xì)胞色素P450c17(cytochrome P450c17，CYP17)是一種單一微粒體酶，屬于CYP450家族，在類固醇激素(甾體激素)合成中起關(guān)鍵作用，具有17α-羥化酶、17，20-裂解酶等酶活性[1-3]。17α-羥化酶是孕激素及腎上腺糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇)合成中所必需的，17，20-裂解酶則是性腺類固醇激素(如雌激素和雄激素)合成中所必需的[1-6]。因此，CYP17的活性在繁殖生物學(xué)中非常重要，是類固醇生物合成不可或缺的重要酶類[1]。目前，CYP17基因在人和高等動(dòng)物中研究較多，哺乳動(dòng)物中只發(fā)現(xiàn)1種CYP17，魚(yú)類中發(fā)現(xiàn)2種不同基因編碼的CYP17，即CYP17-Ⅰ和CYP17-Ⅱ，前者具有17α-羥化酶和17，20-裂解酶活性，而后者只具有17α-羥化酶活性[3-4，7-9]。迄今為止，已成功克隆半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[1]、綠鰭?cǎi)R面鲀(Navodonseptentrionalis)[4]、青鳉(Oryziaslatipes)[7]、呆鰷魚(yú)(Pimephalespromelas)[10]、斑馬魚(yú)(Daniorerio)[11]等多種魚(yú)類的CYP17-Ⅰ基因。

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)和大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)，分別隸屬鯉形目(Cypriniformes)、鰍科(Cobitidae)的泥鰍屬(Misgurnus)和副泥鰍屬(Paramisgurnus)，這2種鰍適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣，具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)，是重要的小型經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。目前，已對(duì)泥鰍和大鱗副泥鰍繁育相關(guān)的基因進(jìn)行了相關(guān)研究[12-14]，但關(guān)于2種鰍CYP17-Ⅰ基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用3′-和5′-RACE法，以泥鰍和大鱗副泥鰍為研究材料，克隆這2種鰍CYP17-Ⅰ基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并對(duì)CYP17-Ⅰ基因cDNA和氨基酸序列進(jìn)行分析，同時(shí)運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR (quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)研究其在不同組織中的表達(dá)，旨在了解CYP17-Ⅰ基因序列特征及其表達(dá)模式，為泥鰍和大鱗副泥鰍的繁殖生物學(xué)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用泥鰍和大鱗副泥鰍均取自浙江省淡水水產(chǎn)研究所綜合實(shí)驗(yàn)基地，分別剪取健康泥鰍和大鱗副泥鰍的腸、肌肉、心臟、胃、肝臟、精巢、卵巢、脾臟等組織，迅速放入液氮冷凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：TRIzol?Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；M-MLV RTase cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTP Mixture(2.5mM)、10×ExTaqBuffer (Mg2+Plus)、ExTaq(5U·μL-1)、DNA回收試劑盒、pMD18-T試劑盒、SYBR?PremixExTaqTMⅡ試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；RACE試劑盒購(gòu)自Clontech公司；DEPC購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 總RNA的提取

按照TRIzol?reagent一步法操作提取泥鰍和大鱗副泥鰍各組織總RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀等檢測(cè)總RNA的濃度及純度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。

1.3 第1鏈cDNA的合成

分別取泥鰍和大鱗副泥鰍各組織總RNA 500ng，按照M-MLV RTase cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 部分cDNA序列擴(kuò)增

根據(jù)斑點(diǎn)叉尾鮰(GenBank: NM_001200313)、斑馬魚(yú)(GenBank: NM_212806)、虹鱒(GenBank: NM_001124747)、青鳉(GenBank: NM_001105094)的CYP17-Ⅰ基因序列設(shè)計(jì)泥鰍和大鱗副泥鰍兼并引物cDNA-F和cDNA-R(表1)，由Invitrogen公司合成。以2種鰍總RNA濃度和質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果最好的卵巢RNA合成的第1鏈cDNA為模板，分別擴(kuò)增2種鰍CYP17-Ⅰ部分cDNA序列，反應(yīng)體系50μL。PCR程序：95℃ 3min；95℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min 30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 8min，4℃終止程序。PCR產(chǎn)物按照DNA回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行切膠純化回收，按照pMD18-T克隆試劑盒說(shuō)明，連接入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后，通過(guò)藍(lán)白斑篩選和菌落鑒定，挑選陽(yáng)性克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序所得序列經(jīng)NCBI的BLAST比對(duì)檢驗(yàn)。

1.5 CYP17-Ⅰ基因3′-RACE法克隆

根據(jù)已得到的泥鰍和大鱗副泥鰍CYP17-Ⅰ基因部分cDNA序列，分別設(shè)計(jì)泥鰍和大鱗副泥鰍3′-RACE引物：MA-GSP-CYP17-3′和PD-GSP-CYP17-3′ (表1)。按照RACE試劑盒說(shuō)明，分別以2種鰍卵巢第1鏈cDNA為模板，PCR擴(kuò)增CYP17-Ⅰ基因3′序列。反應(yīng)體系25μL，模板1μL。PCR程序：94℃ 30s，72℃ 3min，共5個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，70℃ 30s，72℃ 3min，共5個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，68℃ 30s，72℃ 3min，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離檢測(cè)，按照1.4節(jié)方法，進(jìn)行切膠回收純化，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選和菌落鑒定，挑選陽(yáng)性克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.6 CYP17-Ⅰ基因5′-RACE法克隆

根據(jù)已得到的泥鰍和大鱗副泥鰍CYP17-Ⅰ基因部分cDNA序列，分別設(shè)計(jì)泥鰍和大鱗副泥鰍5′-RACE引物：MA-GSP-CYP17-5′和PD-GSP-CYP17-5′ (表1)，根據(jù)RACE試劑盒說(shuō)明，按照1.5節(jié)方法，PCR擴(kuò)增CYP17-Ⅰ基因5′序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離檢測(cè)，按照1.4節(jié)方法，進(jìn)行切膠回收純化，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選和菌落鑒定，挑選陽(yáng)性克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.7 序列分析

應(yīng)用NCBI上的ORF finder程序查找開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)；用ExPASy在線protparam程序分析氨基酸的物理參數(shù)；利用TMHMM程序預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)；用SignalP程序預(yù)測(cè)信號(hào)肽；用bioinf程序結(jié)合predictprotein程序分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；用SMART程序結(jié)合NCBI的Conserved Domains(CD-Search)程序分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；用NCBI的BLAST進(jìn)行相似度分析；BLAST分析泥鰍、大鱗副泥鰍與其他物種的CYP450家族推導(dǎo)的氨基酸序列，用ClustalX進(jìn)行多重序列比對(duì)分析；用MEGA進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，采取鄰位相接法(neighbor-joining，NJ)，Bootstrap重復(fù)1000次計(jì)算各分枝的置信度，構(gòu)建2種鰍CYP17-Ⅰ氨基酸序列與其他物種的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.8 CYP17-Ⅰ基因組織表達(dá)檢測(cè)

根據(jù)CYP17-Ⅰ基因序列分別設(shè)計(jì)泥鰍和大鱗副泥鰍定量引物：MA-CYP17-F、MA-CYP17-R及PD-CYP17-F、PD-CYP17-R (表1)。分別以泥鰍β-actin和大鱗副泥鰍16S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參，設(shè)計(jì)內(nèi)參引物β-actin-F、β-actin-R及16S rRNA-F、16S rRNA-R (表1)。采用qRT-PCR檢測(cè)CYP17-Ⅰ基因在各個(gè)組織中的表達(dá)情況，按照SYBR?PremixExTaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明，分別以1.3節(jié)方法所得泥鰍和大鱗副泥鰍各組織的第1鏈cDNA為模板，qRT-PCR程序：95℃ 4min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)；72℃ 8min。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算每個(gè)樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 基因克隆和熒光定量所用到的引物
Table 1 Primers for gene cloning and qRT-PCR experiments

引物名稱Primername序列Sequence(5'→3')cDNA-FCAGCCAGGGMATYGTGGATACcDNA-RGGGTTYTTCCAYTCYTTYTCATCMA-GSP-CYP17-3'CACTGTGCAGAAAGGGACACGAGTCPD-GSP-CYP17-3'AAGACAGACACCCTCAGCTCGGTGMA-GSP-CYP17-5'ATTCTCAGAACTGCGCTTGGCCCTCPD-GSP-CYP17-5'GGAAACGGGTCGGATTCTTAGCACTMA-CYP17-FGTGGTTTGTGCCCTGTGTMA-CYP17-RCAACTTGTGCTCCTCGTATTPD-CYP17-FCCTCCCCTCACTGCCTATCAPD-CYP17-RCCCATGCACCATCTTCCGATβ-actin-FCAATCCCAAAGCCAACAGβ-actin-RCCATCACCAGAGTCCATCA16SrRNA-FGGAACTCGGCAAACTCAA16SrRNA-RCTCCAAAGGGTCTTCTCG

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)，多重比較分析各組織基因相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CYP17-Ⅰ基因cDNA全長(zhǎng)序列

克隆得到泥鰍CYP17-Ⅰ基因cDNA全長(zhǎng)序列1706bp，包含5′-非翻譯區(qū)(5′-untranslated region，5′-UTR) 14bp和3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR) 129bp，ORF長(zhǎng)度1563bp。大鱗副泥鰍CYP17-Ⅰ基因cDNA全長(zhǎng)序列1763bp，包含5′-UTR 86bp和3′-UTR 132bp，ORF長(zhǎng)度1545bp。2種鰍的3′-UTR都有1個(gè)多聚腺苷酸加尾信號(hào)(AATAAA)和1個(gè)多聚A尾(圖1)。所得泥鰍和大鱗副泥鰍CYP17-Ⅰ基因cDNA全長(zhǎng)序列提交GenBank，登錄號(hào)分別為JQ269653.1和JQ269651.1。

2.2 CYP17-Ⅰ氨基酸序列

泥鰍CYP17-Ⅰ的ORF編碼520個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為59.0776ku，分子式C2656H4235N733O744S23，理論等電點(diǎn)(isoelectric point，pI)為9.19。其中，亮氨酸(Lue，L)含量最高為12.3%，半胱氨酸(Cys，C)、色氨酸(Trp，W)含量較低，分別為1.9%、1.3%；帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu) 33個(gè)，帶正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys) 67個(gè)；脂肪族氨基酸指數(shù)為97.08。大鱗副泥鰍CYP17-Ⅰ的ORF編碼514個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為58.1876ku，分子式C2611H4156N716O736S26，pI為9.01。其中，亮氨酸(Lue，L)含量最高為11.9%，半胱氨酸(Cys，C)、色氨酸(Trp，W)含量較低，分別為2.1%、1.6%；帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu) 52個(gè)，帶正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys) 63個(gè)；脂肪族氨基酸指數(shù)為96.13。

A，泥鰍；B，大鱗副泥鰍。方框黑體核苷酸表示多聚腺苷酸加尾信號(hào)(AATAAA)；*為終止密碼子；方框內(nèi)氨基酸序列表示信號(hào)肽；虛線氨基酸序列表示跨膜結(jié)構(gòu)；陰影部分氨基酸序列表示保守的蛋白結(jié)構(gòu)域；下劃線表示3個(gè)功能保守區(qū)序列A，Mud loach; B，large-scale loach.The polyadenylation addition signal (AATAAA) is marked with a bold block.The stop codon is represented as an asterisk(*).The signal peptide of the amino acid sequence is boxed.The transmembrane region of the amino acid sequence is marked by dotted lines.The conserved protein domains of the amino acid sequence indicated by shaded areas.The three functionally conserved sequences are underlined

GenBank登錄號(hào)：泥鰍，AFD54865.1；大鱗副泥鰍，AFD54863.1；稀有鮈鯽，AEV91665.1；斑馬魚(yú)，NP_997971.2；斑點(diǎn)叉尾鮰，NP_001187242.1；鰻鱺，AAR88432.1；虹鱒，NP_001118219.1；黑鯛，AAW62972.1；三刺魚(yú)，NP_001254585.1；牙鲆，ACN72759.2。方框表示3個(gè)功能保守區(qū)，Ⅰ：Ono序列；Ⅱ：Ozols′十三肽區(qū)；Ⅲ：亞鐵血紅素結(jié)合區(qū)。陰影黑體為保守的精氨酸；陰影為發(fā)揮活性所必須的半胱氨酸GenBank accession number: Misgurnus anguillicaudatus，AFD54865.1; Paramisgurnus dabryanus，AFD54863.1; Gobiocypris rarus，AEV91665.1; Danio rerio，NP_997971.2; Ictalurus punctatus，NP_001187242.1; Anguilla japonica，AAR88432.1; Oncorhynchus mykiss，NP_001118219.1; Acanthopagrus schlegelii，AAW62972.1; Gasterosteus aculeatus，NP_001254585.1; Paralichthys olivaceus，ACN72759.2.The three functionally conserved regions are boxed，Ⅰ: Ono sequence; Ⅱ: Ozols′ tridecapeptide region; Ⅲ: haem-binding region.The conserved arginine is marked in shadow and bold.The active cysteine is shadowed

采用SignalP server程序預(yù)測(cè)，泥鰍和大鱗副泥鰍都有1個(gè)信號(hào)肽，分別包含25和22個(gè)氨基酸(圖1)。利用TMHMM程序預(yù)測(cè)，2種鰍都有1個(gè)明顯的跨膜區(qū)，分別包含23和20個(gè)氨基酸(圖1)。結(jié)構(gòu)域分析表明，2種泥鰍CYP17-Ⅰ都含1個(gè)保守的蛋白結(jié)構(gòu)域，分別位于第45-505和第41-501位氨基酸處，都存在3個(gè)功能保守區(qū)：(1)Ono序列；(2)Ozols′十三肽區(qū)；(3)亞鐵血紅素結(jié)合區(qū)(圖2)。同時(shí)，亞鐵血紅素結(jié)合區(qū)存在保守的精氨酸(Arg，R)和發(fā)揮活性所必需的半胱氨酸(Cys，C)(圖2)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，泥鰍CYP17-Ⅰ二級(jí)結(jié)構(gòu)含17個(gè)α螺旋、9個(gè)β折疊片及27個(gè)其他無(wú)規(guī)則卷曲，分別占二級(jí)結(jié)構(gòu)的32.1%、17.0%、50.9%；大鱗副泥鰍CYP17-Ⅰ二級(jí)結(jié)構(gòu)含18個(gè)α螺旋、9個(gè)β折疊片及27個(gè)其他無(wú)規(guī)則卷曲，分別占二級(jí)結(jié)構(gòu)的33.3%、16.7%、50.0%。

2.3 CYP17-Ⅰ氨基酸序列同源性和進(jìn)化樹(shù)分析

經(jīng)NCBI的BLAST蛋白質(zhì)相似度分析，泥鰍與大鱗副泥鰍的CYP17-Ⅰ氨基酸序列相似度最高，達(dá)99%，同其他魚(yú)類的相似度也在70%以上。使用ClustalX對(duì)氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)后，利用MEGA將比對(duì)結(jié)果構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)。結(jié)果表明，不同類型的CYP450占據(jù)進(jìn)化樹(shù)的不同分枝。其中，CYP17-Ⅰ和CYP17-Ⅱ距離最近。在CYP17-Ⅰ分支中，其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系基本符合傳統(tǒng)的分類地位，例如CYP17-Ⅰ按魚(yú)類和哺乳動(dòng)物分為2個(gè)分枝，在魚(yú)類分支中，鯉形目的3種魚(yú)聚在一起，且泥鰍與大鱗副泥鰍聚為1枝。CYP17-Ⅰ氨基酸序列可以作為魚(yú)類系統(tǒng)發(fā)育分析的參考。

各枝節(jié)點(diǎn)數(shù)字表示進(jìn)化分枝的置信度The confidence of the phylogenetic tree branches is represented a number in each branch node圖3 泥鰍、大鱗副泥鰍與其他物種CYP450家族NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Neighbour-joining phylogenetic tree of the CYP450family in mud loach (Misgurnus anguillicaudatus)，large-scale loach (Paramisgurnus dabryanus) and other species

2.4 CYP17-Ⅰ基因在各組織中的表達(dá)

分別以β-actin和16S rRNA為內(nèi)參，檢測(cè)CYP17-Ⅰ基因在泥鰍和大鱗副泥鰍腸、肌肉、心臟、胃、肝臟、精巢、卵巢、脾臟等8種組織的表達(dá)情況。結(jié)果表明，CYP17-Ⅰ在泥鰍和大鱗副泥鰍所有檢測(cè)組織中均表達(dá)，表達(dá)水平存在明顯的組織差異，均在精巢和卵巢中表達(dá)較高，其他組織表達(dá)較低。其中，精巢表達(dá)量最高，肝臟表達(dá)量最低，泥鰍和大鱗副泥鰍精巢的CYP17-Ⅰ相對(duì)表達(dá)量分別是肝臟的122.1和141.8倍(圖4)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，CYP17-Ⅰ基因在2種鰍不同組織間表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)，相同組織間表達(dá)量無(wú)顯著差異。

柱狀圖上無(wú)相同大寫字母表示各處理間差異極顯著(P<0.01)Data marked without the same uppercase letter in each histogram indicated significant differences at P<0.01.

3 討論

3.1 CYP17-Ⅰ基因的序列特征

魚(yú)類CYP17存在2種類型：CYP17-Ⅰ和CYP17-Ⅱ，分別由2種基因編碼[1，5，7，9]。CYP17-Ⅰ具有17α-羥化酶、17，20-裂解酶等酶活性，而CYP17-Ⅱ只具有17α-羥化酶活性[8]。本研究克隆的泥鰍和大鱗副泥鰍CYP17基因cDNA序列屬于前者。2種鰍CYP17-Ⅰ基因的3′-UTR都含多聚腺苷酸加尾信號(hào)(AATAAA)，這與其他物種相似[1]，但與仿刺參[2]不同的是，2種鰍CYP17-Ⅰ基因3′端未發(fā)現(xiàn)和mRNA降解作用有關(guān)的信號(hào)序列ATTTA(AUUUA)，這可能是CYP17-Ⅰ基因在不同物種的進(jìn)化中發(fā)生了突變，由其他相關(guān)序列代替，尚待研究。

泥鰍和大鱗副泥鰍CYP17-Ⅰ氨基酸序列都含1個(gè)信號(hào)肽，其有助于CYP17-Ⅰ透過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔[2]；信號(hào)肽中多數(shù)氨基酸為強(qiáng)疏水性，可支撐酶的跨膜位置，這與田燚等[2]、Wang等[11]的研究一致。此外，跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域二級(jí)結(jié)構(gòu)為α螺旋，其與膜內(nèi)外電子傳遞催化功能有關(guān)，這些特征有助于結(jié)合在膜上的CYP17-Ⅰ蛋白前體穿過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的選擇性膜，發(fā)揮17α-羥化酶、17，20-裂解酶等酶活性，這也符合CYP17-Ⅰ是一種微粒體酶，主要存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特點(diǎn)[2]。與仿刺參[2]不同的是，2種鰍CYP17-Ⅰ信號(hào)肽區(qū)域二級(jí)結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)則卷曲和α螺旋，并非延伸鏈，α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲占一半以上，是構(gòu)成蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的主要結(jié)構(gòu)單元[2]，與黃鱔(Monopterusalbus)等的CYP17-Ⅰ信號(hào)肽區(qū)域二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α螺旋和β折疊[2，15]存在一定差異，這些結(jié)構(gòu)差異與功能的關(guān)系和機(jī)理有待進(jìn)一步探索。

3.2 CYP17-Ⅰ的系統(tǒng)進(jìn)化

CYP17-Ⅰ的催化活性、結(jié)構(gòu)和功能均較保守[2，4，11]，本研究也證明了這一點(diǎn)。同其他物種CYP17-Ⅰ一樣，泥鰍和大鱗副泥鰍CYP17-Ⅰ氨基酸序列具有明顯的CYP450家族特征[2]，即包含3個(gè)典型功能保守區(qū)，即Ono序列、Ozols′十三肽區(qū)和亞鐵血紅素結(jié)合區(qū)，這3個(gè)功能保守區(qū)的保守性較高[1，4]。亞鐵血紅素結(jié)合區(qū)協(xié)調(diào)結(jié)合CYP17的底物進(jìn)行反應(yīng)，其中，亞鐵血紅素結(jié)合區(qū)是亞鐵血紅素的結(jié)合位點(diǎn)，其中存在保守的精氨酸(Arg，R)和發(fā)揮活性所必需的半胱氨酸(Cys，C)。這些功能保守區(qū)和活性位點(diǎn)構(gòu)成了質(zhì)子傳遞鏈、K螺旋、血紅素結(jié)合環(huán)和絕對(duì)保守的EXXR基序，在類固醇激素合成中起重要作用。人類CYP17的Arg358是酶依賴于細(xì)胞色素b5的裂解酶活性(或酰基碳切割活性)所必需的[2，16]，在硬骨魚(yú)類及其他脊椎動(dòng)物CYP17中，Arg358都位于Ozols′十三肽區(qū)，泥鰍和大鱗副泥鰍CYP17的Arg358也位于這一區(qū)域。

3.3 CYP17-Ⅰ基因的組織表達(dá)

在泥鰍和大鱗副泥鰍的8個(gè)組織中均檢測(cè)到有CYP17-Ⅰ表達(dá)，卵巢和精巢中表達(dá)量較高，這與Chen等[1]、溫海深等[4]和Liu等[6]的結(jié)果一致，表明性腺是CYP17-Ⅰ的主要表達(dá)部位。CYP17-Ⅰ調(diào)控類固醇激素前體——睪酮(testoserone，T)和17α-羥孕酮的產(chǎn)生，分別為17β-雌二醇(17β-estradiolum，E2)和17α，20β-雙羥孕酮(17α，20β-DHP)的生物合成提供重要的前體。同時(shí)，CYP17-Ⅰ也是E2向17α，20β-DHP轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因子[17]。睪酮是雄性性別分化中一種重要的激素，綠鰭?cǎi)R面鲀[4]和半滑舌鰨[8]的研究結(jié)果表明，CYP17基因的表達(dá)水平與血清中的睪酮含量密切相關(guān)，最高值均出現(xiàn)在卵細(xì)胞或精子成熟期。

在硬骨魚(yú)類卵巢中，E2和17α，20β-DHP分別用于誘導(dǎo)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和最終卵母細(xì)胞的成熟[3]。在魚(yú)類的卵母細(xì)胞成熟階段，此過(guò)程主要通過(guò)17α-羥孕酮合成17α，20β-DHP完成，最終促進(jìn)卵泡成熟。在硬骨魚(yú)類精巢中，CYP17-Ⅰ對(duì)孕激素的合成至關(guān)重要，孕激素可誘導(dǎo)排精和精子成熟[4，8]，硬骨魚(yú)類中孕激素17α，20β-DHP存在于精子生成早期的精巢內(nèi)，可誘導(dǎo)精原細(xì)胞DNA的復(fù)制，是精子產(chǎn)生及減數(shù)分裂的開(kāi)啟者[8]。CYP17在精子發(fā)育早期階段轉(zhuǎn)錄水平低，在精子形成過(guò)程中不斷增加[18]；在睪丸的形成中，表達(dá)量升高[19]，表明CYP17在魚(yú)類繁殖周期中，對(duì)睪酮的生成起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[4]。

CYP17在魚(yú)類的腎臟(頭腎)中表達(dá)量也較高，腎臟是另一個(gè)典型的類固醇合成組織[1]。魚(yú)類腦中CYP17的表達(dá)量也較高[1，4，10]，但低于性腺和腎。溫海深等[4]的研究表明，腦中CYP17的表達(dá)僅次于卵巢，略高于精巢。腦中CYP17參與調(diào)控神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，誘導(dǎo)腦中的類固醇激素生成，為在腦中起芳香化作用的腦型芳香化酶提供前體。推測(cè)類固醇激素可能在魚(yú)的大腦局部產(chǎn)生，說(shuō)明類固醇調(diào)控依賴于腦—垂體—性腺軸[8]。

[1] CHEN C F，WEN H S，WANG Z P，et al.Cloning and expression ofP450c17-Ⅰ (17α-hydroxylase/17，20-lyase) in brain and ovary during gonad development inCynoglossussemilaevis[J].FishPhysiologyandBiochemistry，2010，36(4): 1001-1012.

[2] 田燚，張丙龍，常亞青.仿刺參性別相關(guān)基因P450c17的克隆與序列分析[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2012，19(1): 22-32.

TIAN Y，ZHANG B L，CHANG Y Q.Cloning and bioinformatics analysis of aromatization geneP450c17in sea cucumberApostichopusjaponicus(Selenka)[J].JournalofFisherySciencesofChina，2012，19(1): 22-32.(in Chinese with English abstract)

[3] CHEN C F，WEN H S，HE F，et al.Molecular mechanism of P450c17-Ⅱ (17，20-lyase) regulating gonad development in femaleCynoglossussemilaevis[J].AquacultureResearch，2013，44(9): 1459-1469.

[4] 溫海深，任源遠(yuǎn)，張冬茜，等.綠鰭?cǎi)R面鲀CYP17-Ⅰ基因克隆及其在繁殖周期中的表達(dá)[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2014，38(12): 1945-1955.

WEN H S，REN Y Y，ZHANG D Q，et al.Molecular cloning and expression patterns of the cytochromeCYP17-Ⅰ gene during the reproductive cycle inNavodonseptentrionalis[J].JournalofFisheriesofChina，2014，38(12): 1945-1955.(in Chinese with English abstract)

[5] ZHOU L Y，WANG D S，KOBAYASHI T，et al.A novel type of P450c17lacking the lyase activity is responsible for C21-steroid biosynthesis in the fish ovary and head kidney[J].Endocrinology，2007，148(9): 4282-4291.

[6] LIU S，QIN F，WANG H，et al.Effects of 17α-ethinylestradiol and bisphenol A on steroidogenic messenger ribonucleic acid levels in the rare minnow gonads[J].AquaticToxicology，2012(122/123): 19-27.

[7] ZHOU L Y，WANG D S，SHIBATA Y，et al.Characterization，expression and transcriptional regulation ofp450c17-Ⅰ and -Ⅱ in the medaka，Oryziaslatipes[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，2007，362(3): 619-625.

[8] 陳彩芳，溫海深.P450c17s基因mRNA在雄性半滑舌鰨繁殖周期中的表達(dá)[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2012，36(7): 1019-1025.

CHEN C F，WEN H S.The characteristic analysis ofP450c17smRNA expression during the reproductive cycle in maleCynoglossussemilaevisGünther[J].JournalofFisheriesofChina，2012，36(7): 1019-1025.(in Chinese with English abstract)

[9] DING Y X，HE F，WEN H S，et al.DNA methylation status ofcyp17-Ⅱ gene correlated with its expression pattern and reproductive endocrinology during ovarian development stages of Japanese flounder (Paralichthysolivaceus)[J].Gene，2013，527(1): 82-88.

[10] HALM S，KWON J Y，RAND-WEAVER M，et al.Cloning and gene expression of P45017α-hydroxylase，17，20-lyase cDNA in the gonads and brain of the fathead minnowPimephalespromelas[J].GeneralandComparativeEndocrinology，2003，130(3): 256-266.

[11] WANG Y，GE W.Cloning of zebrafish ovarianP450c17(CYP17，17α-hydroxylase/17，20-lyase) and characterization of its expression in gonadal and extra-gonadal tissues[J].GeneralandComparativeEndocrinology，2004，135(2): 241-249.

[12] 劉士力，胡廷尖，王雨辰，等.泥鰍雌雄性比對(duì)繁殖影響的試驗(yàn)[J].河北漁業(yè)，2010，204(12):30-32.

LIU S L，HU T J，WANG Y C，et al.Effects of sex ratio on propagation of oriental weatherfish，Missgurnusarguillicaudatus[J].HebeiFishery，2010，204(12):30-32.(in Chinese with English abstract)

[13] 胡廷尖，劉士力，練青平，等.泥鰍早期形態(tài)發(fā)育的研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28(17): 132-138.

HU T J，LIU S L，LIAN Q P，et al.Study on the developmental and morphological characters inMissgurnusarguillicaudatusLarvae[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin，2012，28(17): 132-138.(in Chinese with English abstract)

[14] 劉士力，王雨辰，張德華，等.大鱗副泥鰍β-肌動(dòng)蛋白的cDNA全長(zhǎng)克隆及表達(dá)分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29(35): 96-101.

LIU S L，WANG Y C，ZHANG D H，et al.Cloning and expression analysis ofβ-actingene fromParamisgurnusdabryanus[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin，2013，29(35): 96-101.(in Chinese with English abstract)

[15] YU H，CHENG H，GUO Y，et al.Altemative splicing and differential expression ofP450c17(CYP17) in gonads during sex transformation in the rice field eel[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，2003，307(l): 165-171.

[16] LEE-ROBICHAUD P，AKHTAR M E，WRIGHT J N，et al.The cationic charges on Arg347，Arg358and Arg449of human cytochome P450c17(CYP17) are essential for the enzyme’s cytochrome b5-dependent acyl-carbon cleavage activities[J].TheJournalofSteroidBiochemistryandMolecularBiology，2004，92(3): 119-130.

[17] SREENIVASULU G，SENTHILKUMARAN B.A role for cytochrome P45017α-hydroxylase /c17-20lyase during shift in steroidogenesis occurring in ovarian follicles prior to oocyte maturation[J].GeneralandComparativeEndocrinology，2009，115(3/5): 77-85.

[18] MAUGARS G，SCHMITZ M.Gene expression profiling during spermatogenesis in early maturing male Atlantic salmon parr testes[J].GeneralandComparativeEndocrinology，2008，159(2): 178-187.

[19] IWADE R，MARUO K，OKADA G，et al.Elevated expression ofP450c17(CYP17) during testicular formation in the frog[J].GeneralandComparativeEndocrinology，2008，155(1): 79-87.

(責(zé)任編輯 侯春曉)

Cloning and tissue expression analysis of the cytochrome P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)gene from mud loach (Misgurnus anguillicaudatus) and large-scale loach (Paramisgurnus dabryanus)

LIU Shi-li1，2，ZHANG Ai-ju1，LIAN Qing-ping1，WU Wei-jun3，4，*，JIA Yong-yi1，JIANG Wen-ping1，LI Fei1

(1.ZhejiangInstituteofFreshwaterFisheries，AgricultureMinistryKeyLaboratoryofHealthyFreshwaterAquaculture/KeyLaboratoryofFreshwaterAquaticAnimalGeneticandBreedingofZhejiangProvince，Huzhou313001，China; 2.CollegeofFisheriesandLifeScience，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China; 3.FisheriesTechnologyExtensionStation，WaterResourcesBureauofQingyuanCounty，Qingyuan323800，China; 4.FisheriesBranch，HydropowerInstituteofQingyuanCounty，Qingyuan323800，China)

In this study，full-length cDNA sequences of the cytochromeP450c17-Ⅰ (CYP17-Ⅰ) gene were cloned using homologous cloning and 3′- and 5′-rapid amplification of cDNA ends techniques from mud loach (Misgurnusanguillicaudatus) and large-scale loach (Paramisgurnusdabryanus).Their expression in various tissues were then explored using quantitative real-time PCR (qRT-PCR).In mud loach，the cloned sequence was 1706bp in length and contained a 1563bp open reading frame (ORF) encoding a protein of 520amino acids.In the large-scale loach，the cloned sequence was 1763bp in length and contained a 1545bp ORF encoding a protein of 514amino acids.Both CYP17-Ⅰ proteins had a predicted signal peptide，a transmembrane domain，a conserved protein domain and three conserved functional areas.Identity analysis showed that CYP17-Ⅰ amino acid sequences were 99% identical between the two loaches，and were more than 70% identical to the same proteins from other fish species.Phylogenetic analysis showed that the closest relationship of CYP17-Ⅰ amino acid sequences was between this two loaches，and the phylogenetic relationships among the CYP17-Ⅰ amino acid sequences were in accord with the traditional classification.CYP17-Ⅰ was expressed widely in the intestine，muscle，heart，stomach，liver，testis，ovary and spleen in the two species of loach，with the highest expression levels being observed in the the testis and ovary.

cytochrome;Misgurnusanguillicaudatus;Paramisgurnusdabryanus;CYP17-Ⅰ

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.08

2016-03-14

浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)(2014F10037)；浙江省重大科技專項(xiàng)(2013C02009)；浙江省設(shè)施水產(chǎn)養(yǎng)殖科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2011R50029)；浙江省公益技術(shù)研究項(xiàng)目(2010C32033，2012C22059)；慶元縣科技項(xiàng)目(QKF2015-22-8)

劉士力(1985—)，男，湖北洪湖人，博士研究生，主要從事水生動(dòng)物遺傳育種研究。E-mail: liushili1212@126.com

*通信作者，吳衛(wèi)君，E-mail: zjwuweijun@163.com

S917.4；Q753

A

1004-1524(2016)11-1853-09

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1853-1861

http://www.zjnyxb.cn

劉士力，張愛(ài)菊，練青平，等.泥鰍和大鱗副泥鰍細(xì)胞色素P450c17-Ⅰ (CYP17-Ⅰ)基因的克隆及組織表達(dá)分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(11): 1853-1861.