miR-451在腎癌患者血清中的異常表達(dá)及其臨床意義

張濤，阿力木·熱合曼，張云宇,邵齊，吳冠偉

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，烏魯木齊 830063)

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miR-451在腎癌患者血清中的異常表達(dá)及其臨床意義

張濤，阿力木·熱合曼，張云宇,邵齊，吳冠偉

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，烏魯木齊 830063)

目的 檢測miR-451在腎癌患者血清中的表達(dá)，研究miR-451與腎癌患者臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)性。方法 收集35例新診斷腎癌患者術(shù)前血清樣本，另外收集35例健康體檢者血清樣本做為對照，利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測miR-451在腎癌患者血清中的表達(dá)情況，分析腎癌患者臨床病理特征和miR-451表達(dá)量兩者之間的關(guān)系。結(jié)果 與對照組比較，腎癌組患者血清中miR-451表達(dá)量明顯低于健康體檢組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在35例腎癌患者血清樣本中，27例(77.14%)miR-451下調(diào)，而8例(22.86%)則表現(xiàn)為上調(diào)。腎癌患者的性別、年齡、腎癌組織類型、腎腫瘤大小、TNM分期和腎癌患者血清中miR-451表達(dá)量無相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論 miR-451在腎癌患者血清中低表達(dá)，提示其可能與腎癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。

腎腫瘤；微RNAs；基因表達(dá)

腎細(xì)胞癌(RCC)簡稱腎癌，是泌尿系統(tǒng)三大腫瘤之一，占全身腫瘤的3%，是比較常見的一種腎臟惡性腫瘤，而且最近十年來腎癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)比較明顯的上升趨勢[1-4]。探索能對腎癌患者進(jìn)行早期診斷的腫瘤生物標(biāo)志物，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問題。已經(jīng)證實(shí)[5]microRNA(miRNA)是機(jī)體處于正常狀態(tài)下以及病理狀態(tài)下細(xì)胞的重要分子成分。miR-451在胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等腫瘤中異常表達(dá)[6-8]，有關(guān)miR-451與腎癌方面的研究很少，本研究旨在探討miR-451在腎癌患者血清中的表達(dá)水平，及其與腎癌患者臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2014年1月至2015年12月期間初次就診并診斷為腎細(xì)胞癌的患者(術(shù)后病理證實(shí))35例為腎癌組，其中男27例，女8例；年齡為35～68歲。平均年齡(50±13)歲。選取同一時間在我院健康體檢中心35例健康體檢者作為健康對照組，男26例，女9例；年齡為38～59歲。平均年齡(48±12)歲。兩組人員在年齡、性別、族別的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。腎癌組和健康對照組所有人員均在抽取血標(biāo)本前被詳細(xì)告知本研究項(xiàng)目，同意并簽署了知情同意書，本課題研究通過了新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 采樣 腎癌組(在行手術(shù)前)和健康對照組均采集空腹血標(biāo)本，在5 h內(nèi)進(jìn)行以下處理：3000 r/min,離心10 min，4 ℃，收集上層血清后保存于-80°C冰箱中待用。

1.2.2 總RNA的提取 遵循mirVanaTMPARISTMKit(Ambion,USA)說明書來操作進(jìn)行提取總RNA。流程如下；提取300 μL血清，混入300 μL的變性液待混勻后，將acidic phenol:chloroform滴入，進(jìn)行離心，離心后在上清液中滴入無水乙醇，給予多次的離心與洗脫，洗脫液60 μL加熱到95 °C后來洗脫RNA，這時保存收集到的RNA液于-80 °C冰箱中，準(zhǔn)備下一步進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(在2 h之內(nèi))。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄 特異性反轉(zhuǎn)錄引物是由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，Has-miR-451反轉(zhuǎn)錄引物序列： 下游引物5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，上游引物：5′-GCGGCGGAAAAGTGCTTACAGTG-3′，5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCT-3′ 。

Has-U6反轉(zhuǎn)錄引物序列：下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。合成目的基因 c DNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo scientific)。

1.2.4 實(shí)時熒光定量 PCR 應(yīng)用 Maxima SYBR Green qPCR Kit(Thermo scientific)試劑盒來實(shí)施定量,具體步驟嚴(yán)格遵循說明書來操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0 軟件處理數(shù)據(jù)，先對基因相對表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，對不服從正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換后其數(shù)值服從正態(tài)分布規(guī)律，兩組數(shù)據(jù)間差異比較使用t檢驗(yàn)或方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-451在腎癌患者血清中的表達(dá) 對35例腎癌患者術(shù)前血清與健康對照組血清中miR-451的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示：與健康對照組比較,miR-451在腎癌患者血清中低表達(dá)，在35例腎癌血清樣本中，有27例miR-451出現(xiàn)下調(diào)(77.14%)，而8例則表現(xiàn)為上調(diào)(22.86%)，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 miR-451表達(dá)水平與臨床資料的關(guān)聯(lián)性 根據(jù)腎癌患者的性別、年齡、腎癌組織類型、腎腫瘤大小、TNM分期和腎癌患者血清中miR-451表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 血清中miR-451表達(dá)與腎癌臨床病理的關(guān)系

3 討論

miRNA是一類短鏈的小分子非編碼RNA，通過結(jié)合靶信使RNA的非翻譯區(qū)，控制影響靶mRNA的翻譯后的調(diào)節(jié)，進(jìn)而來調(diào)節(jié)多種生物進(jìn)程。在腫瘤的研究中，miRNA被認(rèn)為是可行的腫瘤標(biāo)記物[9]，miRNA可能在發(fā)揮抑癌基因或者促癌基因的作用[10]，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期各環(huán)節(jié)，對細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程發(fā)揮重要作用[11-12]。VEGF、HIF等腎癌的多種分子機(jī)制都和miRNA的調(diào)控相關(guān)[13-14]。既往關(guān)于腫瘤的miRNA研究主要以腫瘤組織及腫瘤旁組織為標(biāo)本，然而作為腫瘤標(biāo)記物腫瘤組織的取材是非常困難的，而且創(chuàng)傷非常大，因此不適合作生物標(biāo)記物。然而血清具有創(chuàng)傷小，抽取便捷，同時能夠反復(fù)操作的優(yōu)點(diǎn)，是作為腫瘤標(biāo)記物的理想介質(zhì)。國外學(xué)者研究[15]發(fā)現(xiàn)血清miRNA可以非常穩(wěn)定地存在，更為重要的發(fā)現(xiàn)是腎癌患者血清中循環(huán)miRNA的表達(dá)水平和腎細(xì)胞癌組織具有一致性[16]。這讓miRNA成為腫瘤標(biāo)志物的前景變得光明。

miR-451相鄰于癌基因人類表皮生長因子受體2(HER2)的17q11.2-21,位于染色體17q11.2。miR-451在人類各個系統(tǒng)中存在，對于心血管系統(tǒng)病變、腫瘤、血液系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等都有非常顯著的影響[17-18]。miR-451可以抑制癌細(xì)胞的分化和癌細(xì)胞增殖，同時它還可以導(dǎo)致癌細(xì)胞加速凋亡[19-21]。

近來國內(nèi)外研究提示miR-451在多種腫瘤中異常表達(dá)。然而關(guān)于miR-451在腎癌中的表達(dá)相關(guān)報道很少。本研究檢測到miR-451在腎癌血清組中的表達(dá)與健康對照組相比明顯呈現(xiàn)低表達(dá)，提示在腎癌發(fā)生發(fā)展中miR-451很可能起一個抑癌基因的作用，可能抑制某種已知或者未知的轉(zhuǎn)錄因子，從而導(dǎo)致腎臟例行的轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生變化，從而導(dǎo)致腎癌的發(fā)生。循環(huán)miR-451的表達(dá)水平和臨床相關(guān)指標(biāo)如年齡、性別、腫瘤直徑、Fuhrman分級、腫瘤直徑、TNM分期無關(guān)，這表明血清miR-451表達(dá)穩(wěn)定，受其他因素影響小，miR-451表達(dá)水平改變可能是促使腎癌發(fā)生發(fā)展的因素之一，血清miR-451下調(diào)有可能發(fā)生于腎細(xì)胞癌早期，有望作為腎癌早期分子標(biāo)記物。

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The miR-451 expression in the serum of patients with renal cell carcinoma

ZhangTao,Alimu·Reheman,ZhangYunyu,ShaoQi,WuGuanwei

(DepartmentofUrology,SecondAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830063,China)

Objective To investigate the miR-451 expression in the serum of patients with renal cell carcinoma and the correlations between the miR-451expression and clinical pathologic characteristics.Methods A total of 35 serum samples in patients with RCC were collected before the surgery .35 healthy subjects were collected as the control.The real-time PCR was used to detect the expression of miR-451 in patients with RCCand healthy controls.Results The expression of miR-451 in the serum of patients with RCC is decreasd compared with the health control(P<0.05).Among the 35 serum samples of the patients with RCC, the miR-451 expression were down-regulated in 27 samples(77.14% ) ,and up-regulated in 8 samples (22.86%).Expression of miR-451 was not related with the age of patients,the gender，tumor size ,histology and TNM stage.Conclusion Reduced miR-451 expression may be involved in the oncogenesis and development of patients with RCC.

Kidney neoplasms；MicroRNAs；Gene expression

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2014211C086)

張濤，博士，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，Email：13999990532@163.com

R737.11

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2016.06.011

2016-08-17)