UHRF1表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用及機(jī)制

類維振，耿亞楠，韓東升，張偉，周林

（中國(guó)人民解放軍第八十八醫(yī)院，山東泰安271000）

UHRF1表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用及機(jī)制

類維振，耿亞楠，韓東升，張偉，周林

（中國(guó)人民解放軍第八十八醫(yī)院，山東泰安271000）

目的 探討泛素樣含PHD和環(huán)指域1（UHRF1）表達(dá)下調(diào)后對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用，并探討其作用機(jī)制。方法 將培養(yǎng)好的人胃癌細(xì)胞系（MKN45）隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（shNC）和干擾組，后兩組分別感染病毒shNC、shUHRF1，采用短發(fā)夾RNA（shRNA）技術(shù)下調(diào)MKN45細(xì)胞中UHRF1表達(dá)，XTT法測(cè)定各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況，平板克隆形成試驗(yàn)測(cè)算細(xì)胞克隆形成率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率；裸鼠皮下成瘤試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)能力。結(jié)果 UHRF1表達(dá)下調(diào)后，MKN45細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯下降、克隆形成減少（P均＜0.05）；干擾組G0／G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少（P均＜0.05），細(xì)胞凋亡率升高（P均＜0.05）；裸鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)速度下降（P＜0.01）。結(jié)論 下調(diào)UHRF1的表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖，該作用可能通過(guò)延長(zhǎng)細(xì)胞周期進(jìn)程和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

胃腫瘤；泛素樣含PHD和環(huán)指域1；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

胃癌是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，包括中國(guó)在內(nèi)的東亞地區(qū)是胃癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)［1］。胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及多基因、多分子水平變化、多階段的一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，而基因的表觀遺傳學(xué)修飾在其中發(fā)揮重要作用［2］。泛素樣含PHD和環(huán)指域1（UHRF1）作為重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)因子，參與DNA甲基化、細(xì)胞增殖和異染色質(zhì)形成等過(guò)程［3］，并且在肝癌［4］、前列腺癌［5］和乳腺癌［6］等腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤形成密切相關(guān)。2014年6月～2015年12月，本研究通過(guò)分子生物學(xué)方法觀察UHRF1基因沉默對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料 RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，RNA裂解液TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；總蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京普利萊，UHRF1和β-actin抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司；UHRF1 shRNA及病毒由上海吉?jiǎng)P基因公司合成；XTT試劑盒購(gòu)自羅氏公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連Takala公司，PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，熒光定量PCR分析儀7500購(gòu)自美國(guó)ABI公司；Annexin V／碘化丙啶（propidiumiodide，PI）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 人胃癌細(xì)胞系（MKN45）來(lái)源于第四軍醫(yī)大學(xué)腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。利用GV209載體構(gòu)建UHRF1短發(fā)夾RNA（shRNA）（shUHRF1）和陰性對(duì)照（shNC）的慢病毒載體，滴度測(cè)定為1× 109TU／mL。將MKN45細(xì)胞鋪于96孔板，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（shNC）和干擾組（shUHRF1），待陰性對(duì)照組和干擾組細(xì)胞生長(zhǎng)至50%時(shí)按病毒滴度10、50、100、200分別進(jìn)行病毒感染，12 h后更換培養(yǎng)液，3 d后熒光顯微鏡下通過(guò)綠色熒光觀察病毒感染情況。接著收集病毒滴度100、200的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀分選帶有綠色熒光的細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)?？瞻讓?duì)照組不接受任何干擾。

1.3病毒感染后細(xì)胞中UHRF1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。裂解各組細(xì)胞后提取總蛋白，配制12%分離膠及5%積層膠，上樣，電流恒定20 mA進(jìn)行SDS-PAGE電泳50 min，用半干法轉(zhuǎn)膜17 min（電壓恒定20 V），5%脫脂奶粉于室溫封閉20 min，2%脫脂奶粉稀釋一抗（鼠抗人UHRF1單克隆抗體1∶400），4℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜。TBST洗滌，2%脫脂奶粉稀釋HRP標(biāo)記的二抗（羊抗鼠，1∶2 000），于室溫孵育1～1.5 h，TBST洗滌，ECL顯色，凝膠成像儀拍照（Biorad），QuantityOne軟件進(jìn)行定量分析，以空白對(duì)照組為參照，計(jì)算其他各組UHRF1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4細(xì)胞生長(zhǎng)情況測(cè)定 采用XTT法。將各組細(xì)胞以1×103個(gè)／孔接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，共接種7塊板，常規(guī)培養(yǎng)7 d，每天取出1塊板進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)前將XTT標(biāo)記試劑（最終濃度為0.3 mg／mL）和電子偶聯(lián)試劑（PMS，N-甲基二苯并吡嗪甲基硫酸鹽）混合，每孔加入50 μL配好的混合液，與細(xì)胞共培養(yǎng)6 h，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)466 nm處檢測(cè)吸光度值，對(duì)照波長(zhǎng)為650 nm，由此繪制各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)。

1.5細(xì)胞克隆形成率測(cè)算 采用平板克隆形成試驗(yàn)。各組細(xì)胞按1×103個(gè)／孔接種于90 mm2培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)2周后，待形成肉眼可見(jiàn)的集落時(shí)終止培養(yǎng)，PBS清洗3遍，甲醇固定15 min，用0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，流水緩慢沖洗后晾干，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)量，計(jì)算克隆形成率。

1.6細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)／mL，用70%冰乙醇溶液固定。檢測(cè)前PBS洗滌1次，加入含RNA酶的碘化丙啶，避光溫育30 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，計(jì)算各周期細(xì)胞百分比及細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.7裸鼠皮下成瘤試驗(yàn) BALB／C裸小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，4～6周齡，17～21 g，均為雌性。寄養(yǎng)在動(dòng)物中心，選擇恒溫25～28℃、恒濕45%～50%的半屏障系統(tǒng)環(huán)境下飼養(yǎng)。裸鼠攝入的飼料和水均需滅菌處理。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN45-shNC和MKN45-shUHRF1細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107／mL，用注射器抽取MKN45-shNC和MKN45-shUHRF1細(xì)胞懸液分別注入裸鼠尾右側(cè)和左側(cè)后背，每點(diǎn)0.2 mL（含活細(xì)胞數(shù)2×106個(gè)）。每次取5只裸鼠，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每2天測(cè)量腫瘤1次，體積＝（D×d2）／2，其中D為最長(zhǎng)直徑，d為最短直徑。4周后處死裸鼠，稱量腫瘤質(zhì)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組UHRF1蛋白表達(dá) 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和干擾組UHRF1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00 ±0.00、1.05±0.13、0.09±0.01，與其他兩組比較，shUHRF1組UHRF1蛋白表達(dá)降低（P均＜0.05）。

2.2下調(diào)UHRF1表達(dá)對(duì)MKN45細(xì)胞增殖、凋亡的影響 見(jiàn)圖1、表1。

2.3下調(diào)UHRF1表達(dá)對(duì)MKN45體內(nèi)成瘤能力的影響 將MKN45-shNC和MKN45-shUHRF1細(xì)胞分別注射于裸鼠兩側(cè)皮下，經(jīng)過(guò)4周觀察后發(fā)現(xiàn)：注射MKN45-shUHRF1細(xì)胞的瘤體生長(zhǎng)速度慢于注射MKN45-shNC細(xì)胞的瘤體；4周后同一只裸鼠MKN45-shNC側(cè)瘤體體積明顯大于MKN45-shUHRF1側(cè)，兩組瘤體的質(zhì)量分別為（1.07±0.26）、（0.48±0.18）g，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1　MKN45細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

表1　下調(diào)UHRF1表達(dá)對(duì)MKN45細(xì)胞增殖、凋亡的影響（%±s）

表1　下調(diào)UHRF1表達(dá)對(duì)MKN45細(xì)胞增殖、凋亡的影響（%±s）

注：與干擾組比較，*P＜0.05。

組別細(xì)胞克隆形成率G0／G1期細(xì)胞S 期細(xì)胞細(xì)胞凋亡率空白對(duì)照組100±0*50.34±5.03*30.31±2.06*6.53±1.85*陰性對(duì)照組96±11*49.98±4.61*30.01±2.72*7.69±1.62*干擾組54±1168.46±3.0619.27±1.6413.94±2.06

3　討論

UHRF1是UHRF超家族成員之一，又稱ICBP90，包含N端泛素樣結(jié)構(gòu)域UBL、植物同源性PHD結(jié)構(gòu)域、SRA結(jié)構(gòu)域和C端的環(huán)狀RING結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，可與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去乙?；讣敖M蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA甲基化、組蛋白乙?；敖M蛋白甲基化的調(diào)控，從而參與細(xì)胞增殖、周期轉(zhuǎn)換及DNA損傷修復(fù)等生物學(xué)過(guò)程，是一種重要的表觀遺傳調(diào)控因子［7］。研究發(fā)現(xiàn)抑制UHRF1表達(dá)可增強(qiáng)和恢復(fù)抑癌基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［8］。Unoki等［9］研究發(fā)現(xiàn)，E2F-1調(diào)控UHRF1促進(jìn)細(xì)胞G1／S期轉(zhuǎn)換。UHRF1在肝癌［4］、乳腺癌［8］和膀胱癌［10］等腫瘤中異常高表達(dá)，在癌旁組織中的表達(dá)低于癌組織。證實(shí)了UHRF1在DNA甲基化、促細(xì)胞增殖和抗凋亡以及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

本課題組前期通過(guò)免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中UHRF1表達(dá)顯著高于癌旁組織，其表達(dá)與胃癌分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與患者年齡和性別無(wú)關(guān)，并且UHRF1表達(dá)強(qiáng)度可以作為胃癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)［11］。該結(jié)果初步提示了UHRF1在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，是一種潛在的癌基因。本研究首先通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的UHRF1表達(dá)遠(yuǎn)高于癌旁組織，然后通過(guò)shRNA技術(shù)下調(diào)MKN45細(xì)胞中的UHRF1表達(dá)后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著下降，其中G0／G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少，從而特異性地抑制了細(xì)胞分裂，使細(xì)胞增殖速度減慢，并且能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究表明，UHRF1在維持DNA甲基化包括腫瘤抑癌基因的啟動(dòng)子甲基化方面非常重要，如果這種維持作用被破壞，各種基因的隨機(jī)表達(dá)將被觸發(fā)，細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或者細(xì)胞周期阻滯［12］。

綜上所述，下調(diào)UHRF1的表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡、延長(zhǎng)細(xì)胞周期進(jìn)程從而抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)。這一發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步闡明胃癌的發(fā)生機(jī)制，并可望為胃癌防治提供新的靶標(biāo)。

［1］Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

［2］Hartgrink HH，Jansen EP，van Grieken NC，et al.Gastric cancer［J］.Lancet，2009，374（9688）：477-490.

［3］Yao J，Leng L，Sauler M，et al.Transcription factor ICBP90 regulates the MIF promoter and immune susceptibility locus［J］.J Clin Invest，2016，126（2）：732-744.

［4］Mudbhary R，Hoshida Y，Chernyavskaya Y，et al.UHRF1 overexpression drives DNA hypomethylation and hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Cell，2014，25（2）：196-209.

［5］Babbio F，Pistore C，Curti L，et al.The SRA protein UHRF1 promotes epigenetic crosstalks and is involved in prostate cancer progression［J］.Oncogene，2012，31（46）：4878-4887.

［6］Geng Y，Gao Y，Ju H，et al.Diagnostic and prognostic value of plasma and tissue ubiquitin-like，containing PHD and RING finger domains 1 in breast cancer patients［J］.Cancer Sci，2013，104（2）：194-199.

［7］Bronner C，Krifa M，Mousli M.Increasing role of UHRF1 in the reading and inheritance of the epigenetic code as well as in tumorogenesis［J］.Biochem Pharmacol，2013，86（12）：1643-1649.

［8］Alhosin M，Sharif T，Mousli M，et al.Down-regulation of UHRF1，associated with re-expression of tumor suppressor genes，is a common feature of natural compounds exhibiting anti-cancer properties［J］.J Exp Clin Cancer Res，2011（30）：41.

［9］Unoki M，Nishidate T，Nakamura Y.ICBP90，an E2F-1 target，recruits HDAC1 and binds to methyl-CpG through its SRA domain［J］.Oncogene，2004，23（46）：7601-10.

［10］Ying L，Lin J，Qiu F，et al.Epigenetic repression of regulator of G-protein signaling 2 by ubiquitin-like with PHD and ring-finger domain 1 promotes bladder cancer progression［J］.FEBS J，2015，282（1）：174-182.

［11］張偉，周林，李乃義，等.胃癌組織UHRF1表達(dá)與預(yù)后相關(guān)性分析［J］.中華腫瘤防治雜志，2015，22（2）：109-112.

［12］Liu X，Gao Q，Li P，et al.UHRF1 targets DNMT1 for DNA methylation through cooperative binding of hemi-methylated DNA and methylated H3K9［J］.Nat Commun，2013（4）：1563.

Inhibitory effect of down-regulated expression of UHRF1
on cell proliferation of gastric cancer

LEI Weizhen，GENG Yanan，HAN Dongsheng，ZHANG Wei，ZHOU Lin
（1 The 88th Hospital of PLA，Taian 271000，China）

Objective To investigate the inhibitory effect of down-regulated expression of ubiquitin-like with PHD and ring finger domain 1（UHRF1）on cell proliferation of gastric cancer（GC）and to explore its mechanism.Methods The gastric cancer cell line（MKN45）were randomly divided into the blank control group，the negative control group（shNC group）and the interference group（shUHRF1 group）；the latter two group were infected with shNC and shUHRF1.After UHRF1 expression was down-regulated by shRNA in MKN45 cells，the cell growth was examined by XTT and the clone formation rate was calculated by plate clone formation assay.Cell cycle and apoptosis of MKN45 cells were detected by flow cytometry（FCM）.In vivo tumorigenicity assay was conducted to examine growth ability in vivo.Results After UHRF1 expression was down-regulated in MKN45 cells by shRNA，the cell growth significantly decreased and colony formation reduced（all P＜0.05）.In the shUHRF1 group，the proportion of cells in G0／G1 phase increased and in S phase decreased，the apoptosis rate was increased and the difference was statistically significant（all P＜0.05）.The tumor growth rate in nude mice was significantly decreased（P＜0.01）.Conclusion The down-regulation of UHRF1 expression may inhibit the proliferation of gastric cancer possibly through extending the cell cycle progression and inducing cell apoptosis.

gastric neoplasms；ubiquitin-like with PHD and ring finger domain 1；cell proliferation；apoptosis

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.003

R735.2

A

1002-266X（2016）21-0007-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81402337）。

類維振（1987-），男，護(hù)師，本科，主要研究方向?yàn)槲赴┑脑鲋撑c轉(zhuǎn)移機(jī)制。E-mail：122238256＠qq.com

簡(jiǎn)介：周林（1988-），男，主治醫(yī)師，博士，主要研究方向?yàn)槲改c道腫瘤的基礎(chǔ)與臨床。E-mail：zhoulin1105＠163.com

（2016-02-16）