四君子湯對(duì)腸梗阻解除后大鼠血清DAO及小腸組織MDA、SCF表達(dá)的影響

桑偉崗，李琳，解基良

（1天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070；2天津市南開醫(yī)院）

四君子湯對(duì)腸梗阻解除后大鼠血清DAO及小腸組織MDA、SCF表達(dá)的影響

桑偉崗1，李琳2，解基良2

（1天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070；2天津市南開醫(yī)院）

目的 探討四君子湯對(duì)腸梗阻解除后大鼠血清二胺氧化酶（DAO）及小腸組織丙二醛（MDA）、干細(xì)胞因子（SCF）表達(dá)的影響。方法 將60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（C）組10只、造模組50只。制作腸梗阻模型后造模組再隨機(jī)均分為模型（M）組、梗阻解除48 h自然恢復(fù)48 h（R1）組、梗阻解除48 h自然恢復(fù)96 h（R2）組、梗阻解除48 h四君子湯治療48 h（S1）組、梗阻解除48 h四君子湯治療96 h（S2）組。造模組造模48 h解除小腸機(jī)械性梗阻。S1、S2組四君子湯灌胃，每次1 mL／100 g，2次／d；C組及R1、R2組給予等體積生理鹽水灌胃。各組各自干預(yù)后即刻取下腔靜脈血分離血清，取梗阻近端小腸組織。采用ELISA法檢測(cè)血清DAO及小腸組織MDA，采用RT-PCR法檢測(cè)小腸組織SCF mRNA表達(dá)。結(jié)果 與M組比較，S1組、S2組血清DAO水平、小腸組織MDA及SCF mRNA表達(dá)降低，且S2組小腸組織MDA及SCF mRNA表達(dá)降低更明顯（P均＜0.05）。結(jié)論 腸梗阻解除后大鼠應(yīng)用四君子湯后血清DAO及小腸組織MDA、SCF表達(dá)降低。

腸梗阻；四君子湯；二胺氧化酶；丙二醛；干細(xì)胞因子；大鼠

腸梗阻導(dǎo)致腸功能障礙的概率很高，而腸梗阻解除后腸功能并不能立即恢復(fù)。腸梗阻導(dǎo)致腸功能障礙可表現(xiàn)在腸屏障功能破壞、營(yíng)養(yǎng)不良、運(yùn)動(dòng)功能障礙等多個(gè)方面。腸梗阻解除后同時(shí)存在“脾胃虛弱”的表現(xiàn)，本質(zhì)上屬于“本虛標(biāo)實(shí)證”。而四君子湯作為補(bǔ)益脾胃的基礎(chǔ)方劑，有調(diào)節(jié)胃腸功能恢復(fù)的作用［1］。2013年10月～2015年10月，本研究以機(jī)械性腸梗阻大鼠模型為研究對(duì)象，探討腸梗阻解除后四君子湯對(duì)其血清二胺氧化酶（DAO）及小腸組織丙二醛（MDA）、干細(xì)胞因子（SCF）表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物、試劑及藥物 健康雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量250～300 g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK-（軍）2009-003，標(biāo)準(zhǔn)顆?；旌巷暳衔桂B(yǎng)1周。DAO、MDA ELISA試劑盒（BlueGene公司提供）；蛋白定量測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所提供）；組織總RNA提取試劑盒，RevertAid First Strand cDNA Sythesis Kit，Maxima SYBR Green／Fluorescein qPCR Master Mix（2×）（Thermo Fisher公司）。SCF mRNA引物由上海生工設(shè)計(jì)、合成。中藥煎劑制備：將四君子湯中人參、茯苓、白術(shù)、甘草按照3∶3∶3∶2比例配伍，水煎煮，濾藥濃縮至1 g／mL，滅菌后4℃保存。

1.2腸梗阻模型制作及分組 參照絲線造模法改良模型［2，3］，具體操作：大鼠術(shù)前禁飲食，麻醉滿意后，取腹部正中切口（約3 cm），將末端回腸輕緩提出體外，于末端回腸5 cm內(nèi)無(wú)血管區(qū)穿過(guò)腸系膜，將制作裝置固定結(jié)扎于此處（頭皮針?biāo)芰蠈?dǎo)管長(zhǎng)約0.7 cm，7號(hào)絲線從導(dǎo)管中間穿過(guò)，頭皮針型號(hào)0.4 ×20TW SB），用導(dǎo)管與腸管接觸，從而保護(hù)腸管，7號(hào)絲線結(jié)扎，形成腸梗阻，將腸管還納入腹腔，關(guān)閉腹腔，放回鼠籠，麻醉清醒后繼續(xù)正常喂養(yǎng)。48 h后再次手術(shù)解除腸梗阻，剪斷固定裝置，關(guān)腹。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（C）組10只、造模組50只。假手術(shù)組開腹方法同模型組但不結(jié)扎。造模組造模后48 h，再次手術(shù)，沿原手術(shù)切口進(jìn)入，剪斷固定裝置并小心取下，解除小腸機(jī)械性梗阻。造模組再隨機(jī)均分為模型（M）組、梗阻解除48 h自然恢復(fù)48 h（R1）組、梗阻解除48 h自然恢復(fù)96 h（R2）組、梗阻解除48 h四君子湯治療48 h（S1）組、梗阻解除48 h四君子湯治療96 h（S2）組。S1、S2組四君子湯灌胃，每次1 mL／100 g，2次／d；C組及R1、R2組給予等體積生理鹽水灌胃。各組各自干預(yù)后以水合氯醛麻醉，沿原手術(shù)切口進(jìn)腹，取下腔靜脈血2 mL置于促凝管中，4℃下3 000 r／min離心10 min，取上層血清置于1.5 mL EP管中備用。取梗阻近端小腸10 cm，沖洗干凈后研磨，取上清液保存。以上待測(cè)標(biāo)本-80℃存放。

1.3血清DAO、小腸組織MDA檢測(cè) 按照Blue-Gene公司提供的DAO、MDA試劑盒所示的操作步驟用ELISA法檢測(cè)血清DAO、小腸組織MDA。

1.4小腸組織SCF mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RTPCR法。SCF上游引物：5′-CATGCTTTAAGGCCTTTGTCACGAG-3′，下游引物5′-GGAGATGGCAGTTGTGCAGCTA-3′；內(nèi)參Gapdh上游引物：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。各組取20 mg大鼠小腸組織，提取總RNA，總RNA濃度36.7～190.0 ng／μL，然后合成cDNA第1鏈，按RevertAid First Strand cDNA Sythesis Kit，再行RT-PCR定量檢測(cè)。反應(yīng)條件：50℃預(yù)處理2 min，95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃延伸60 s，變性和延伸40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt公式計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

各組血清DAO水平、小腸組織MDA及SCF mRNA表達(dá)比較見表1。與C組比較，M組、R1組、R2組血清DAO水平、小腸組織MDA及SCF mRNA表達(dá)升高（P均＜0.05）；與M組比較，S1組、S2組血清DAO水平、小腸組織MDA及SCF mRNA表達(dá)降低，且S2組小腸組織MDA及SCF mRNA表達(dá)降低更明顯（P均＜0.05）。

表1　各組血清DAO水平、小腸組織MDA及SCF mRNA表達(dá)比較（±s）

表1　各組血清DAO水平、小腸組織MDA及SCF mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與C組比較，aP＜0.05；與M組比較，bP＜0.05；與R1組比較，cP＜0.05；與R2組比較，dP＜0.05；與S1組比較，eP＜0.05。

組別nDAO（mg／mL）MDA（mg／g蛋白）SCF mRNA C組104.942±0.5600.125±0.01627.387±0.939 M組108.325±1.553a0.234±0.027a10.066±0.585aR1組107.300±0.788ab0.209±0.028b14.118±0.601abR2組106.156±0.934abc0.176±0.022abc19.649±4.056abcS1組106.070±1.042bc0.171±0.018abc17.225±2.936abcS2組105.008±0.759bcd0.124±0.019bcde23.998±3.043bcde

3　討論

腸梗阻是臨床常見的導(dǎo)致腸功能障礙的病因之一。治療腸功能障礙的中醫(yī)方法很多，包括通里攻下法、活血化瘀法、清熱解毒法、健脾和胃法等，并獲得一定療效，其中以通里攻下法應(yīng)用最為廣泛。目前國(guó)內(nèi)研究已經(jīng)證實(shí)，通里攻下法對(duì)于急腹癥具有多層面、多靶點(diǎn)的治療作用，但不足之處在于缺乏嚴(yán)格的中醫(yī)辨證，因腸功能障礙不一定都屬于“里實(shí)熱證”。以往研究發(fā)現(xiàn)，腸梗阻解除后同時(shí)存在“脾胃虛弱”的表現(xiàn)，本質(zhì)上屬于“本虛標(biāo)實(shí)證”。李芳等［4］對(duì)81例膿毒癥的中醫(yī)證候進(jìn)行分析，結(jié)果顯示腸功能障礙屬于虛實(shí)夾雜證，虛證占很大比例，而且預(yù)后更差。現(xiàn)代藥理研究提示，四君子湯可影響胃腸活動(dòng)［5］，具有雙向調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)的作用［1，6，7］。四君子湯作為治療脾胃虛弱的基礎(chǔ)方劑，通過(guò)補(bǔ)益脾胃運(yùn)濕健脾，促進(jìn)脾運(yùn)化功能的恢復(fù)，使水濕不致停滯于腸道，恢復(fù)腸道的運(yùn)動(dòng)功能。

DAO是哺乳動(dòng)物小腸黏膜上層絨毛中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，能較理想地反映小腸黏膜的結(jié)構(gòu)和功能［8］，但在病理狀態(tài)下如機(jī)械性腸梗阻時(shí)腸黏膜細(xì)胞缺血受損，腸黏膜細(xì)胞內(nèi)DAO釋放入血，致血清DAO升高，可見血清DAO水平能反映小腸黏膜的損傷情況及功能紊亂情況，間接反映腸功能障礙。MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化物的代表，機(jī)體缺血缺氧時(shí)產(chǎn)生自由基的多少與MDA水平呈正相關(guān)，反映了氧自由基對(duì)細(xì)胞損傷的程度，它的產(chǎn)生能加劇黏膜的損傷，破壞細(xì)胞骨架，最終導(dǎo)致腸屏障的損害，細(xì)菌移位。因此可通過(guò)MDA了解脂質(zhì)過(guò)氧化程度，以間接反映大鼠小腸黏膜的損傷損傷程度及腸功能。有研究結(jié)果顯示，四君子湯有利于巨結(jié)腸患兒的腸黏膜結(jié)構(gòu)及屏障功能恢復(fù)［9］。李琳［10］對(duì)大耳白兔的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯對(duì)腸黏膜屏障有保護(hù)作用。本研究通過(guò)測(cè)定DAO、MDA腸黏膜屏障功能損傷指標(biāo)也發(fā)現(xiàn)，四君子湯有利于大鼠腸梗阻解除后腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。

腸梗阻雖然可解除，但是機(jī)體仍然存在腸功能障礙，且腸運(yùn)動(dòng)功能障礙是其中一個(gè)重要的臨床表現(xiàn)。目前普遍認(rèn)為胃腸道神經(jīng)（ENS）-Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC）-平滑肌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)。ICC被認(rèn)為是胃腸道動(dòng)力的“起搏細(xì)胞”及神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)的“中介細(xì)胞”，在胃腸道動(dòng)力調(diào)節(jié)的諸多因素中，對(duì)胃腸動(dòng)力的形成和調(diào)節(jié)起關(guān)鍵性作用［11，12］。酪胺酸激酶受體（c-Kit）是ICC的特異性標(biāo)志物，SCF是c-Kit的天然配體，SCF與c-Kit結(jié)合后所啟動(dòng)的信號(hào)通路，對(duì)ICC的增殖、分化及表型維持至關(guān)重要［13，14］。有研究顯示，c-Kit、SCF基因異常表達(dá)及相應(yīng)的信號(hào)通路受損可引起ICC表型發(fā)生轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致形態(tài)和功能異常。微環(huán)境中SCF水平對(duì)ICC的培養(yǎng)至關(guān)重要，ICC的培養(yǎng)必須依賴SCF才能成活，不加SCF的培養(yǎng)基ICC基本不能存活。這些研究結(jié)果說(shuō)明正常的SCF／c-Kit信號(hào)通路對(duì)ICC表型維持和生理功能的實(shí)現(xiàn)具有不可替代的作用，而c-Kit和SCF基因的正常表達(dá)是維持這一信號(hào)通路的必要條件。研究發(fā)現(xiàn)，ICC與許多胃腸動(dòng)力障礙性疾病有關(guān)。先天性巨結(jié)腸是以腸內(nèi)容物排出受阻為特征的一種先天性腸道動(dòng)力障礙性疾病，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)識(shí)到先天性巨結(jié)腸腸運(yùn)動(dòng)功能障礙與ICC分布、數(shù)量及功能異常有關(guān)［15］。本研究中大鼠腸梗阻解除后應(yīng)用四君子湯治療，SCF mRNA水平明顯升高，提示四君子湯對(duì)大鼠腸梗阻解除后腸運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)有利。

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10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.013

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A

1002-266X（2016）21-0035-03

天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合科研課題（13501）。

解基良（E-mail：Xie.j.l＠163.com）

（2015-10-24）