體外培養(yǎng)自體黑素細(xì)胞移植治療白癜風(fēng)78例療效觀察

安彩霞，王紅娟，劉文先，胡　雯，趙亞楠，普雄明

體外培養(yǎng)自體黑素細(xì)胞移植治療白癜風(fēng)78例療效觀察

安彩霞，王紅娟，劉文先，胡雯，趙亞楠，普雄明

安彩霞

目的評(píng)價(jià)自體黑素細(xì)胞培養(yǎng)移植治療白癜風(fēng)的療效和影響因素。方法臨床選擇穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者78例，采用自體黑素細(xì)胞培養(yǎng)與移植治療方法，記錄療效和并發(fā)癥，分析可能影響因素。結(jié)果78例患者總計(jì)189處皮損，98處皮損（51.85%）獲得了90%以上的復(fù)色，53處皮損（28.04%）獲得了50%～90%以上的復(fù)色，總有效率達(dá)到79.89%；節(jié)段型白癜風(fēng)患者有效率為86.04%，優(yōu)于局限型白癜風(fēng)患者（83.54%）和泛發(fā)型白癜風(fēng)患者（71.64%）的治療效果；面頸部位的皮損治療效果最佳（有效率87.80%），要優(yōu)于軀干部（83.67%）和四肢部位（80.39%），手足部位治療效果最差（有效率68.75%），黑素細(xì)胞分裂時(shí)間≤3.5 d的移植有效率明顯高于＞3.5 d者（P＜0.05）。結(jié)論自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植是治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)的一種有效方法，其療效與白癜風(fēng)的分型、皮損的部位和黑素細(xì)胞的生物活性有關(guān)。

白癜風(fēng)；黑素細(xì)胞；移植

白癜風(fēng)是皮膚科常見的色素減退性疾病，發(fā)病機(jī)制不明，治療困難[1,2]。針對(duì)白癜風(fēng)不同的分型分期，需要采用不同的治療手段。對(duì)于穩(wěn)定期白癜風(fēng)，在藥物和紫外線治療效果欠佳的情況下，手術(shù)治療是個(gè)不錯(cuò)的選擇。既往筆者多采用自體表皮移植治療，但皮源有限，對(duì)于大面積及特殊部位白癜風(fēng)效果欠佳[3]。而自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植治療，取小面積的表皮即可培養(yǎng)出大量的黑素細(xì)胞，從而治療面積較大的白癜風(fēng)皮損，是目前治療大面積穩(wěn)定期白癜風(fēng)效果較佳的辦法，但仍有一些臨床應(yīng)用問題尚需解決[4]。筆者所在科室2012—2015年使用自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植治療95例穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者，17例失訪，隨訪并觀察了其中78例患者，現(xiàn)將治療結(jié)果報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料

本研究共納入患者78例，其中 男37例（47.44%），女41例（52.56%）；平均年齡（35.62±3.24）歲（7～67歲）；漢族45例，維族23例，回族6例，蒙古族2例，哈薩克族2例；18例節(jié)段型患者共有皮損43塊，35例局限型患者共有皮損79塊，25例泛發(fā)型患者共有皮損67塊。手術(shù)部位位于面部者18例，皮損共41塊，軀干部29例，皮損49塊，四肢及手足部位31例，皮損99塊；患者均為穩(wěn)定期白癜風(fēng)，病情穩(wěn)定≥6個(gè)月，無其他系統(tǒng)性疾病，如血液病、自身免疫?。ㄈ缂谞钕偌膊?、糖尿?。┑?，非瘢痕體質(zhì)等。經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核同意，所有患者均簽署知情同意書和臨床資料調(diào)查表。

1.2試劑

M2黑素細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（Gibco公司），0.25%胰酶，胎牛血清（Gibco公司）。左旋多巴(L-Dopa，Sigma公司)。

1.3方法

1.3.1黑素細(xì)胞的培養(yǎng)使用負(fù)壓真空吸皰儀在白癜風(fēng)患者腹部正常皮膚處吸皰6～12個(gè)（根據(jù)皮損面積決定，負(fù)壓50 kPa，時(shí)間60～90 min，每個(gè)皰直徑0.8 cm），吸皰完成后，用無菌注射器將皰液吸出，濾器過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆?。沿皰壁基底部完整剪下皰壁，加入含雙抗（青霉素和鏈霉素）100 U/ml的磷酸鹽緩沖液（PBS），室溫放置10 min。加入PBS徹底清洗，組織剪碎，加入0.25%胰酶放入4 ℃冰箱消化12～16 h。胎牛血清終止消化，吹打使細(xì)胞分散，試管內(nèi)液體混濁后1 500 r/min離心3 min棄上清，緩沖液沖洗后再次離心和棄上清。加入M2黑素細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基中，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3天更換培養(yǎng)液1次，在倒置顯微鏡下觀察黑素細(xì)胞形態(tài)，觀察其生長(zhǎng)和增生情況，當(dāng)黑素細(xì)胞融合后，進(jìn)行傳代。培養(yǎng)過程中利用成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)速度快的特點(diǎn)，用差速貼壁法及胰酶差速消化法去除角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞污染,同時(shí)利用M2黑素細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，以獲得高純度活化可供移植的黑素細(xì)胞。

1.3.2黑素細(xì)胞的鑒定和計(jì)數(shù)首先采用抗成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞特異抗原染色，不顯色時(shí)證明沒有這兩種細(xì)胞的污染，再進(jìn)行黑素細(xì)胞功能的鑒定。

1.3.2.1L-DOPA 染色調(diào)整黑素細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/ml，接種于放有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞爬滿蓋玻片80%時(shí)，取出蓋玻片，用冰PBS洗兩次，5%的甲醛固定30 min，再用冰PBS洗兩次，加入0.1%左旋多巴磷酸鹽緩沖液（pH7.4），放人37 ℃溫箱中溫浴4 h，棄去多巴液，觀察細(xì)胞顯色程度，L-DOPA陽性反應(yīng)細(xì)胞胞質(zhì)呈灰色至黑色，證明黑素細(xì)胞具有合成黑素的功能。

1.3.2.2黑素細(xì)胞的計(jì)數(shù)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并以白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)3～5次傳代，黑素細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)量達(dá)到手術(shù)要求時(shí)[根據(jù)實(shí)際白斑面積定，（8～14）×104個(gè)/ cm2]，進(jìn)行移植手術(shù)。

1.3.2.3黑素細(xì)胞分裂時(shí)間(DOT)計(jì)算[5]每次接種和傳代時(shí)均計(jì)算黑素細(xì)胞數(shù)量，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)倍數(shù)(D)和生長(zhǎng)時(shí)間(T)，按照公式計(jì)算DOT（DOT=0.3 T/logD）。

1.3.3黑素細(xì)胞的移植培養(yǎng)的黑素細(xì)胞用胰酶消化，離心收集，PBS洗3次后，用患者皰液混懸黑素細(xì)胞（8 μl/cm2）?；颊甙装咝g(shù)區(qū)常規(guī)消毒，局部麻醉后以磨削機(jī)磨削去表皮，深度以可見點(diǎn)狀毛細(xì)血管出血為度。將混懸的黑素細(xì)胞種植于移植區(qū)創(chuàng)面，油紗布覆蓋創(chuàng)面，外敷含有患者血清液的無菌紗布，待患者平臥休息1 h后用無菌敷料包扎，7～10 d后去除紗布。

1.4臨床療效判定標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)白癜風(fēng)臨床分型及療效標(biāo)準(zhǔn)《草案》[6]。由2位非手術(shù)工作人員根據(jù)手術(shù)前后復(fù)色面積判定療效。痊愈：色素恢復(fù)＞90%；顯效：白斑部分消失或縮小，恢復(fù)正常膚色面積占皮損面積50%～90%；有效：白斑部分減退或縮小，恢復(fù)正常膚色面積占皮損面積10%～49%；無效：白斑無變化或縮小，恢復(fù)正常膚色面積占皮損面積＜10%。有效率=（痊愈+顯效）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，各組比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1黑素細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

黑素細(xì)胞培養(yǎng)初期，細(xì)胞形態(tài)呈黑色圓點(diǎn)狀，培養(yǎng)1周左右，一部分細(xì)胞逐漸由圓形變成梭形，并有2～3個(gè)樹突。約2周后，黑素細(xì)胞數(shù)量明顯增多，連接成網(wǎng)狀，細(xì)胞內(nèi)充滿黑素顆粒，細(xì)胞呈梭形。原代細(xì)胞呈多極性、有折光性的纖維樣細(xì)胞，傳代細(xì)胞多為雙極性、細(xì)長(zhǎng)、平行排列。L-DOPA染色：細(xì)胞胞質(zhì)及樹突呈黑色或棕褐色，呈陽性反應(yīng)，可正常合成黑素（圖1）。

2.2白癜風(fēng)患者療效觀察

78例患者均在術(shù)后1、3、6個(gè)月采集照片，記錄療效。隨訪時(shí)間最長(zhǎng)16個(gè)月，平均隨訪時(shí)間8個(gè) 月。78例患者總計(jì)189處皮損，98處（51.85%）皮損獲得了90%以上的復(fù)色，53處（28.04%）皮損獲得了50%～90%以上的復(fù)色，總有效率為79.89%。

2.3白癜風(fēng)患者移植療效影響因素

表1可見，節(jié)段型白癜風(fēng)患者（有效率86.04%）治療效果優(yōu)于局限型白癜風(fēng)患者（83.54%）和泛發(fā)型白癜風(fēng)患者（71.64%），結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為14.301，26.043，P均＜0.05）；面頸部的皮損治療效果最佳（有效率為87.80%），優(yōu)于軀干部（83.67%）和四肢（80.39%），手足部位治療效果最差（有效率為68.75%），結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為12.271，25.056，35.367，P均＜0.05）；DOT≤3.5 d的有效率明顯高于DOT＞3.5 d的患者皮損，結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.30，P＜0.05），而在不同性別、族別和年齡分組間的有效率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1　倒置顯微鏡下黑素細(xì)胞培養(yǎng)

圖2　白癜風(fēng)患者面頸部皮損移植前后臨床變化

圖3　白癜風(fēng)患者腰部皮損移植前后臨床表現(xiàn)

表1　白癜風(fēng)患者皮損移植的療效評(píng)估　（例）

2.4不良反應(yīng)

供皮區(qū)及移植區(qū)均未發(fā)生同形反應(yīng)及瘢痕增生，移植部位10～15 d后皮膚創(chuàng)面愈合，移植部位輕微發(fā)紅，移植區(qū)邊緣與正常皮膚交界處有淺白色分界線。移植后5～8個(gè)月色素恢復(fù)穩(wěn)定，且顏色與鄰近正常皮膚接近（圖2，3），也有移植后1個(gè)月色素即恢復(fù)到接近正常膚色的患者。34例患者移植后出現(xiàn)色素沉著，隨著時(shí)間的推移色素沉著斑逐漸變淡；有2例患者色素恢復(fù)后又再次復(fù)發(fā)，1例于移植區(qū)新生色素消退后再次出現(xiàn)白斑，1例為白癜風(fēng)面積擴(kuò)大，移植區(qū)新生色素消退。有4例患者行2次手術(shù)治療，未見明顯不良反應(yīng)及并發(fā)癥。

3　討論

白癜風(fēng)是由于皮膚黑素細(xì)胞的缺失導(dǎo)致的常見色素異常性皮膚病，至今病因不清。皮損通常出現(xiàn)在暴露部位，可造成患者嚴(yán)重的精神和心理壓力，并引起社交障礙、抑郁癥等疾病，導(dǎo)致生活質(zhì)量下降[7]。白癜風(fēng)的治療方法雖然較多，但療效并不令人滿意，特別當(dāng)白癜風(fēng)處于穩(wěn)定期，外科治療將是患者和醫(yī)生不錯(cuò)的選擇。隨著體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，使得黑素細(xì)胞移植治療白癜風(fēng)成為可能[8]，這種方法可以從小面積的供區(qū)表皮就可以獲得大量的黑素細(xì)胞，為一次性治療大面積的皮損提供了可能。然而，因黑素細(xì)胞培養(yǎng)所需技術(shù)條件較高，是目前國(guó)內(nèi)外白癜風(fēng)較前沿的治療方法，國(guó)內(nèi)外均進(jìn)行了此方面的臨床應(yīng)用研究。上世紀(jì)80年代，Lontz等[9]采用此方法治療27例白癜風(fēng)，結(jié)果產(chǎn)生不同程度的色素恢復(fù)，并且發(fā)現(xiàn)色素恢復(fù)的程度主要取決于白癜風(fēng)皮損的部位（面部、軀干與手背療效最佳），而與疾病活動(dòng)性無關(guān)。我國(guó)學(xué)者自上世紀(jì)90年代開始了黑素細(xì)胞培養(yǎng)移植方面的研究和臨床應(yīng)用。Chen等[10]采用 Hu16 培養(yǎng)基，獲得自體純黑素細(xì)胞懸液，移植治療了120 例白癜風(fēng)患者，84%的局限型穩(wěn)定期和54%的泛發(fā)型穩(wěn)定期患者完全復(fù)色，并成功應(yīng)用液氮儲(chǔ)存黑素細(xì)胞移植治療，患者治療后復(fù)色效果良好。但是，由于此項(xiàng)技術(shù)的復(fù)雜和白癜風(fēng)疾病本身的特點(diǎn)，仍有許多臨床應(yīng)用方面的問題需要我們?nèi)ヌ剿骱脱芯?。本研究選擇臨床屬于穩(wěn)定期的白癜風(fēng)患者做為受試對(duì)象，以保證獲得最好的臨床效果，避免同形反應(yīng)等不良反應(yīng)的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示自體黑素細(xì)胞移植治療的總有效率達(dá)到79.89%，痊愈率達(dá)到51.85%，其療效是肯定的，但仍有一部分患者未獲得良好的治療效果。我們發(fā)現(xiàn)，白癜風(fēng)臨床分型、皮損的部位和黑素細(xì)胞的生物學(xué)活性均可影響自體黑素細(xì)胞移植的療效，而患者的性別、族別及年齡對(duì)于療效無明顯影響。節(jié)段型白癜風(fēng)治療效果最好，有效率達(dá)到86.04%，明顯好于泛發(fā)型（71.64%），這也與之前的研究結(jié)果報(bào)告類似[11,12]，分析其原因或與白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜有關(guān)。而對(duì)于不同部位的治療效果觀察發(fā)現(xiàn)，面頸部治療效果最好，其次為軀干和四肢，最差的是四肢末端，這與移植皮片成活的結(jié)果類似，或與手術(shù)局部的血供和營(yíng)養(yǎng)有關(guān)[13]；DOT是代表細(xì)胞生物活性的重要指標(biāo)之一[14]，黑素細(xì)胞DOT小，表明黑素細(xì)胞的分裂和增生能力強(qiáng)，細(xì)胞的生物學(xué)活性好。本文研究得出DOT≤3.5 d的黑素細(xì)胞移植后療效較好。

總之，自體純培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植是治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)的有效治療手段之一，未見嚴(yán)重并發(fā)癥。其移植療效受多種因素影響，白癜風(fēng)類型、皮損部位及個(gè)體的黑素細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)均是重要的影響因素，而且可能存在其他的因素影響治療效果，尚需我們不斷的研究和觀察。

[1] Gawkrodger DJ, Ormerod AD, Shaw L, et al. Guideline for the diagnosis and management of vitiligo [J]. Br J Dermatol, 2008, 159(5):1051-1076.

[2]Patel NS, Paghdal KV, Cohen GF. Advanced treatment modalities for vitiligo [J]. Dermatol Surg, 2012, 38(3):381-391.

[3]Mulekar SV, Isedeh P. Surgical interventions for vitiligo: an evidencebased review [J]. Br J Dermatol, 2013, 169 (3):57-66.

[4] 張迪敏, 洪為松, 傅麗芳, 等. 個(gè)體化培養(yǎng)自體黑素細(xì)胞移植治療白癜風(fēng) [J]. 中華皮膚科雜志, 2010, 43(10):57-61.

[5] 阮高波, 尉曉東, 許愛娥. 自體黑素細(xì)胞移植治療白癜風(fēng)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜, 2006, 5(4):252-254.

[6] 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專業(yè)委員會(huì)色素病學(xué)組. 白癜風(fēng)臨床分型及療效標(biāo)準(zhǔn)(2003 年修定稿) [J]. 中華皮膚科雜志, 2004, 37(7):440.

[7]Sangma LN, Nath J, Bhagabati D. Quality of life and psychological morbidity in vitiligo patients: a study in a teaching hospital from north-East India [J]. Indian J Dermatol, 2015, 60(2):142-146.

[8] Olsson MJ, Juhlin L. Transplantation of melanocytes in vitiligo [J]. Br J Dermatol, 1995, 132(4):587-591.

[9] Lontz W, Olsson MJ, Moellmann G, et al. Pigment cell transplantation for the treatment of vitiligo: A progress report [J]. J Am Acad Dermatol, 1994, 30(4):591-597.

[10] Chen YF, Yang PY, Hu DN, et al. Treatment of vitiligo by transplantation of cultured pure melanocyte suspension: analysis of 120 cases [J]. J Am Acad Dermatol, 2004, 51(1):68-74.

[11] Pandya V, Parmar KS, Shah BJ, et al. A study of autologous melanocyte tranfer in treatment of stable vitiligo [J]. Indian J Dermatol Venereol Leprol, 2005, 71(6):393-397.

[12] 姚蕾, 鐘淑霞, 李珊山, 等. 自體黑素細(xì)胞移植治療不同臨床類型白癜風(fēng)患者的療效評(píng)價(jià) [J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 38(6):1187-1190.

[13] 王尚蘭, 樊志華, 李牛勇, 等. 磨削加自體表皮細(xì)胞移植治療白癜風(fēng)528例臨床觀察 [J]. 四川醫(yī)學(xué), 2002, 23(10):1068-1069.

[14] Hu DN. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro [J]. Photochem Photobiol, 2008, 84(3):645-649.

（本文編輯耿建麗）

The clinical observation of cultured autologous melanocytes transplantation in the treatment of vitiligo

AN Cai-xia，WANG Hong-juan，LIU Wen-xian，et al
Department of Dermatology, Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital, Urumqi 830001, China

ObjectiveTo observe the therapeutic effect and influence factors of cultured autologous melanocytes to transplantation in the treatment of vitiligo. MethodsTo observe the therapeutic effect and influence factors of cultured autologous melanocytes transplantation in the treatment of vitiligo. MethodsSeventy-eight patients with stable vitiligo were enrolled in the study, and the autologous melanocytes cultured in vitro were transplanted onto the depigmented areas of the vitiligo patients. The therapeutic effect and complications were observed, and the influence factors were analyzed. ResultsThe patients had total 189 depigmented lesions. The repigmentation up to 90% or more was seen in 51.85% of the lesions, and the repigmentation over 50% was seen in 79.89% of the lesions. The effective rate of the segmental group was 86.04%, which is better than localized group and generalized group, respectively. A higher cure rate was also seen in patients with facial lesions. The effective rate in patients of DOT≤3.5 d was significantly higher than the patients of DOT＞3.5 d (P＜0.05). ConclusionTransplantation of autologous cultured melanocytes is effective in the treatment of stable vitiligo. The therapeutic efficacy is related to types of vitiligo, locations of lesions and melanocytes biologic activity.

Vitiligo；Melanocytes；Transplantation[J Pract Dermatol, 2016, 9(1):30-33]

R758.41

A

1674-1293(2016)01-0030-04

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160110

830001 烏魯木齊，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院（安彩霞，王紅娟，劉文先，胡雯，趙亞楠，普雄明）

安彩霞，副主任醫(yī)師，研究方向：皮膚外科和色素性皮膚病，E-mail: angelfish_2004@163.com

（2015-09-06

2015-10-29）