跌打通痹膏對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨MMP-13、Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)的影響

龔志賢，羅凌威,盧敏,鄺高艷,范杰,銀絲絲

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208）

跌打通痹膏對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨MMP-13、Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)的影響

龔志賢1，羅凌威2,盧敏1,鄺高艷2,范杰2,銀絲絲2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208）

目的觀察跌打通痹膏對(duì)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）、Ⅱ型膠原mRNA（COL-ⅡmRNA）表達(dá)的影響。方法選用65只新西蘭兔隨機(jī)分成正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、跌打通痹膏組、骨通貼組，每組13只。模型組、跌打通痹膏組、骨通貼組采用改良Hulth造模法，正常組、假手術(shù)組不予處理，模型組、跌打通痹膏組、骨痛貼組分別用膠帶、跌打通痹膏、骨痛貼膏貼敷4周，觀察治療后各組實(shí)驗(yàn)兔關(guān)節(jié)軟骨改變情況，并檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13、COL-ⅡmRNA的表達(dá)。結(jié)果（1）組織學(xué)關(guān)節(jié)軟骨評(píng)分：跌打通痹膏組評(píng)分較模型組低（P＜0.05）。（2）MMP-13mRNA檢測(cè)：模型組MMP-13表達(dá)較正常對(duì)照組顯著提高（P＜0.01)，跌打通痹膏組MMP-13 mRNA表達(dá)較模型組降低（P＜0.01)。（3）COL-ⅡmRNA檢測(cè)：跌打通痹膏組COL-Ⅱ表達(dá)較模型組升高（P＜0.01）。結(jié)論跌打通痹膏能通過(guò)降低Ⅱ型膠原降解，抑制MMP-13 mRNA表達(dá)，從而有效保護(hù)膝骨關(guān)節(jié)炎模型兔關(guān)節(jié)軟骨，延緩關(guān)節(jié)軟骨退變。

膝骨性關(guān)節(jié)炎；跌打通痹膏；MMP-13mRNA；Ⅱ型膠原mRNA

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是中老年常見(jiàn)病之一，其主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、功能障礙，屬于中醫(yī)“痹癥”范疇[1-2]。流行病學(xué)資料表明隨著現(xiàn)代社會(huì)平均壽命的增長(zhǎng)，KOA在40~80歲的人群中，已成為一種有較高發(fā)病率的骨科疾病[3-4]。關(guān)節(jié)軟骨退變的主要原因?yàn)殛P(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解異常，而軟骨細(xì)胞外基質(zhì)為軟骨細(xì)胞存活所依靠的主要環(huán)境?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在維持其降解和合成的過(guò)程中表現(xiàn)出重要作用。因此，本課題以兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型為受試對(duì)象，以MMPs學(xué)說(shuō)為切入點(diǎn)，觀察跌打通痹膏是否通過(guò)調(diào)節(jié)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）及Ⅱ型膠原mRNA（CollagenⅡ，COL-Ⅱ）mRNA表達(dá)，達(dá)到減緩膝骨關(guān)節(jié)炎疾病發(fā)展的作用，為跌打通痹膏治療KOA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物65只清潔級(jí)成年新西蘭白兔（雌性，體質(zhì)量1.8～2.5 kg），由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心代購(gòu)，動(dòng)物許可證編號(hào)：SKYK(湘)2013-0005。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物跌打通痹膏，由湖南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，規(guī)格：7 cm×10 cm，批號(hào)：20140809；骨痛貼膏，桂林天和藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：7 cm×10 cm，產(chǎn)品批號(hào)：20140709。

1.1.3主要試劑TRIZOL試劑(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)、Reverse Transcription System、Go Taq Green MasterMix(均購(gòu)自美國(guó)Promega公司)；0.9%氯化鈉注射液（100 mL，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H141009C）。

1.1.4主要儀器4℃臺(tái)式離心機(jī)、水平電泳儀、移液槍、美國(guó)Bio-Rad Molecular Imager Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)；Beijing Liuyi instrument Factory PCR儀，37℃恒溫箱（均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)實(shí)驗(yàn)室中心提供）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組方法將65只新西蘭白兔按體質(zhì)量編號(hào)，參照隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行分組實(shí)施動(dòng)物分組，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、跌打通痹膏組、骨痛貼組五組，各組13只，分籠飼養(yǎng)，定時(shí)、定量、定人飼養(yǎng)，按照兔標(biāo)準(zhǔn)飼料配制飼料。

1.2.2造模方法模型組、跌打通痹膏組、骨痛貼組兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型采用Hulth造模法進(jìn)行造模，具體方法如下：由耳緣靜脈注射入麻醉藥物（20%烏拉坦，4 mL/kg），取右后膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，切口周?chē)? cm脫毛、絡(luò)合碘消毒、鋪無(wú)菌孔巾。以右后膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)作一長(zhǎng)約3 cm的切口，逐層分離軟組織，依次暴露內(nèi)側(cè)副韌帶，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶。小心摘除內(nèi)側(cè)半月板，后用尖刀切斷前交叉韌帶，術(shù)后行抽屜實(shí)驗(yàn)，若陽(yáng)性則表示造模手術(shù)完成。術(shù)后給予肌肉注射青霉素20萬(wàn)U，每天1次，連續(xù)3 d，維持傷口干潔，分籠喂養(yǎng)，術(shù)后2周傷口拆線。正常對(duì)照組不進(jìn)行造模處理，假手術(shù)組則在麻醉后打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，不做處理后直接縫合。造模期間各組白兔傷口均愈合，無(wú)感染發(fā)生，無(wú)白兔死亡。在造模手術(shù)后第五周時(shí)，此時(shí)在各組隨機(jī)選取1只白兔處死，打開(kāi)右膝關(guān)節(jié)腔，驗(yàn)證模型制備成功，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)干預(yù)按照成人每次貼敷膏藥需求量,采用體表面積Meeh-Rubner公式：體表面積（m2）=k（系數(shù)）×[（W（體質(zhì)量g）2/3）]/10000，計(jì)算實(shí)驗(yàn)兔每次使用膏藥大小為2 cm×4 cm。正常對(duì)照組、假手術(shù)組不予以治療，模型組用膠帶固定，跌打通痹膏組用跌打通痹膏貼敷，骨痛貼組用骨痛貼膏貼敷，膠帶、跌打通痹膏、骨痛貼膏均裁剪為2 cm×4 cm大小，固定于右后膝關(guān)節(jié)，膏藥固定后再以繃帶捆扎預(yù)防實(shí)驗(yàn)兔撕咬膏藥，捆扎繃帶后檢查肢端血運(yùn)，以不影響血運(yùn)為宜。膏藥敷貼連續(xù)4周，每天1次，每天8 h（每日08:00-16:00，自敷藥后每隔4 h前往實(shí)驗(yàn)室觀察，檢查膏藥是否固定，敷藥8 h后拆除膏藥）。

1.3觀察指標(biāo)及方法（標(biāo)本均送至中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)）

1.3.1關(guān)節(jié)軟骨觀察實(shí)驗(yàn)干預(yù)4周后，采用空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)兔，處死后解剖右膝關(guān)節(jié)，打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，分離股骨遠(yuǎn)端及脛骨平臺(tái)周?chē)浗M織，先取股骨遠(yuǎn)端標(biāo)本，制備切片,行HE常規(guī)染色后在光鏡（放大倍數(shù)400倍）下觀察，將光鏡下所見(jiàn)關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)改變，按照關(guān)節(jié)軟骨改良Mankin評(píng)分[5]進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分準(zhǔn)則詳見(jiàn)表1。

1.3.2關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13、COL-Ⅱ的mRNA的表達(dá)

取各組白兔右脛骨平臺(tái)（保持完整關(guān)節(jié)軟骨，修整骨端周?chē)∪獾冉M織），收集后將標(biāo)本置于-10℃低溫冰凍保存。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)用RT-PCR技術(shù)（按說(shuō)明書(shū)）檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13、COL-ⅡmRNA表達(dá)情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1　關(guān)節(jié)軟骨改良Mankin評(píng)分法

2　結(jié)果

各組白兔在實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)無(wú)死亡，均完成療程，結(jié)果如下。

2.1跌打通痹膏對(duì)關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)影響

對(duì)各組關(guān)節(jié)軟骨切片進(jìn)行光鏡觀察，對(duì)光鏡下關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行Mankin評(píng)分，各組評(píng)分均滿(mǎn)足方差齊性（P＜0.01），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。跌打通痹膏組、骨痛貼組與模型組比較（P＜0.05），正常對(duì)照組與假手術(shù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。跌打通痹膏組與骨痛貼組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。評(píng)分結(jié)果詳見(jiàn)表2、圖1。

表2　各組實(shí)驗(yàn)兔關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分結(jié)果比較（±s，分）

表2　各組實(shí)驗(yàn)兔關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分結(jié)果比較（±s，分）

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，*P＜0.05；與模型組對(duì)比，＃P＜0.05。

組別正常對(duì)照組假手術(shù)組模型組跌打通痹膏組骨痛貼組n 12 12 12 12 12 Mankin評(píng)分0 0.42±0.15 3.33±0.22* 2.83±0.21*＃2.67±0.19*＃

圖1　各組關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)觀察（HE×400）

2.2跌打通痹膏對(duì)關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13mRNA表達(dá)的影響

對(duì)照組與假手術(shù)組MMP-13表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組、跌打通痹膏組、骨痛貼組與正常對(duì)照組比較，MMP-13表達(dá)顯著提高（P＜0.01)。跌打通痹膏組、骨痛貼組與模型組比較MMP-13表達(dá)降低（P＜0.01）。跌打通痹膏組與骨痛貼組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

2.3跌打通痹膏對(duì)關(guān)節(jié)軟骨中COL-ⅡmRNA表達(dá)的影響

模型組、跌打通痹膏組、骨痛貼組與正常對(duì)照組比較，COL-Ⅱ表達(dá)顯著降低（P＜0.01)。跌打通痹膏組與模型組比較COL-Ⅱ表達(dá)升高（P＜0.01）。跌打通痹膏組與骨痛貼組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3　各組MMP-13mRNA、COL-ⅡmRNA表達(dá)比值結(jié)果比較（±s）

表3　各組MMP-13mRNA、COL-ⅡmRNA表達(dá)比值結(jié)果比較（±s）

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，**P＜0.01；與模型組對(duì)比，＃＃P＜0.01。

組別正常對(duì)照組假手術(shù)組模型組跌打通痹膏組骨痛貼組COL-Ⅱ/β-actin 1.860 3±0.202 4 1.840 0±0.228 3 0.999 0±0.093 2** 1.290 8±0.155 4**＃＃1.295 6±0.124 8**＃＃n 12 12 12 12 12 MMP-13/β-actin 0.9785±0.0362 0.9829±0.0668 1.2325±0.1069** 1.1595±0.0494**＃＃1.1632±0.0728**＃＃

3　討論

KOA在中醫(yī)學(xué)中并無(wú)確切病名，將其歸為“痹證”范疇，主要是依照KOA的臨床癥狀。痹，即堵塞不通。痹證是指外邪留于經(jīng)脈，導(dǎo)致以疼痛、腫脹、為主要癥狀表現(xiàn)在膝關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周?chē)∪獾囊环N疾病。有關(guān)痹癥的記載，首先見(jiàn)于《內(nèi)經(jīng)》。書(shū)中指出：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹”[6]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，氣血失和、肝腎虧虛為膝痹病的主要內(nèi)因。外感風(fēng)寒濕邪，筋脈氣血阻滯為膝痹病的主要外因。內(nèi)虧外邪導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)不榮則痛，不通則痛[7]。目前，對(duì)于未嚴(yán)重影響生活質(zhì)量的非晚期KOA患者仍以保守治療為主，中藥雖起效較慢，但以整體調(diào)節(jié)為主，作用溫和、持久，能夠顯著改善病人自覺(jué)癥狀，提高生活質(zhì)量，容易被患者接受[8]。根據(jù)臨床病例發(fā)現(xiàn)KOA患者多以局部癥狀突出，故臨床上多采用外治法治療KOA。所以貼敷膏藥的方法以其使用方便的優(yōu)點(diǎn)已成為治療KOA的一種重要治療方法。

KOA主要病變部位為關(guān)節(jié)軟骨，細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨細(xì)胞室構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨的主要兩種成分。幾乎所有的軟骨外基質(zhì)都能被MMPs降解，KOA的發(fā)生主要是因?yàn)檐浌腔|(zhì)被大量降解，破壞了膠原網(wǎng)絡(luò)和軟骨細(xì)胞周?chē)沫h(huán)境。MMPs中膠原酶亞型—MMP-13，可以?xún)?yōu)先分解COL-Ⅱ，對(duì)軟骨基質(zhì)COL-Ⅱ分解能力最強(qiáng)[9]。COL-Ⅱ占總膠原量中的90%～95%，是正常關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)內(nèi)的主要膠原成分。軟骨破壞主要是因?yàn)榧?xì)胞外基質(zhì)降解和合成之間的平衡無(wú)法維持。通過(guò)其他文獻(xiàn)表明，可通過(guò)測(cè)定MMP-13、COL-Ⅱ的mRNA的表達(dá)間接反映出來(lái)。本次實(shí)驗(yàn)中，對(duì)兔KOA軟骨進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組指標(biāo)MMP-13的mRNA表達(dá)較空白組顯著升高，COL-Ⅱ的mRNA表達(dá)較空白組明顯降低。

跌打通痹膏（原名傷速康貼膏）系本院臨床應(yīng)用四十余年的協(xié)定方——消炎散，進(jìn)行劑型改變，將其制成更為簡(jiǎn)單實(shí)用的巴布劑，改善了消炎散作用時(shí)間短，不宜固定等缺點(diǎn)。通過(guò)長(zhǎng)期的臨床使用證明跌打通痹膏外敷患處具有較好的活血化瘀、散瘀止痛的功效。其治療KOA的主要功效為清熱活血、祛瘀止痛活絡(luò)，該藥對(duì)于KOA中瘀阻脈絡(luò)證及氣滯血瘀證等相關(guān)證型療效尤佳，藥方主要由梔子、赤芍、蒲公英、金銀花、大黃、羌活、當(dāng)歸、薄荷、白芷、香附十一味中藥組成。藥方中金銀花、蒲公英、梔子、大黃均為君臣寒涼之藥清熱祛瘀；為增強(qiáng)其活血通絡(luò)、散瘀止痛之作用加入佐使藥，分別為香附、白芷、羌活、姜黃、赤芍、當(dāng)歸等行氣活血之品；為增加藥物透皮性加入芳香之薄荷。俱藥合用，使血活歸正路，散瘀有途徑，共奏寧絡(luò)清熱、散瘀活血之功。君臣藥涼血清熱、祛瘀活血，涼血與散瘀相輔，辛溫與寒涼相制。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，跌打通痹膏方中大黃有降低PLT聚集與粘附，并延長(zhǎng)TT、PT、PTT的作用以起到活血祛瘀的作用[10]，并可通過(guò)抑制下丘腦中cAMP含量達(dá)到解熱作用[11]。蒲公英提取物能降低炎癥細(xì)胞中COX-2的表達(dá)，進(jìn)而起到抗炎鎮(zhèn)痛的功效[12]。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，跌打通痹膏可有效降低兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型中關(guān)節(jié)液IL-1、IL-6及TNF-α的含量,對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎具有防治作用[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)跌打通痹膏治療后的兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型，能降低關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分和MMP-13 mRNA表達(dá)，增加COL-ⅡmRNA表達(dá)，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)，提示跌打通痹膏能通過(guò)減少COL-Ⅱ降解，抑制MMP-13 mRNA表達(dá)，從而有效保護(hù)膝骨關(guān)節(jié)炎模型兔關(guān)節(jié)軟骨，延緩關(guān)節(jié)軟骨退變，這可能是其治療本病的作用機(jī)制。

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（本文編輯 李杰）

The Effects of Dieda Tongbi Emplastrum on MMP-13,Collagen II mRNA Expression in the Knee Osteoarthritis Model Rabbits

GONG Zhixian1,LUO Lingwei2,LU Min1,KUANG Gaoyan2,FAN Jie2,YIN Sisi2
(1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China; 2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To observe the effects of Dieda Tongbi emplastrum on MMP-13(matrix metalloproteinase-13), COL-II mRNA expression in the knee osteoarthritis model rabbits.Methods The 65 healthy New Zealand rabbits were randomly divided into normal control group,sham-operation group,modeling group,Dieda Tongbi emplastrum group,Gutong patch group,13 rabbits in each group.The model group,Dieda Tongbi emplastrum group,Gutong emplastrum group were built by improved Hulth molding method.The normal group and sham-operation group were opened the joint cavities without any treatment.The model group,Dieda Tongbi emplastrumand and Gutong patch group were treated with adhesive tape,Dieda Tongbi emplastrumand and Gutongtie for 4 weeks,respectively.The changes of joint cartilage in all model rabbits were observed,and the expressions of MMP-13 and COL-ⅡmRNA in joint cartilage were detected.Results(1)The histologic articular cartilage score of Dieda Tongbi emplastrum group was lower than model group(P＜0.05).(2)MMP-13 mRNA test:the MMP-13 expression in model group was increased than that in normal control group(P＜0.01).The MMP-13 mRNA expression of Dieda Tongbi emplastrum group were lower than that in model group(P＜0.01).(3)COL-ⅡmRNA test:the expression of COL-Ⅱin Dieda Tongbi emplastrum group was increased than that in model group(P＜0.01).Conclusion Dieda Tongbi emplastrum can protect the articular cartilage in knee osteoarthritis model rabbits and delay the course of knee joint degeneration by reducing COL-Ⅱdegradation and inhibiting the expression of MMP-13.

knee osteoarthritis;Dieda Tongbi emplastrum;MMP-13mRNA;Collagen II mRNA

R274.3；R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2016.11.005

2015-09-28

湖南省教育廳優(yōu)秀青年科研課題項(xiàng)目(13B085)。

龔志賢，男，副主任醫(yī)師，研究方向：骨與關(guān)節(jié)及創(chuàng)傷修復(fù)，E-mail:26134591@qq.com。