四君子湯對FCIR大鼠大腦皮質神經保護作用的實驗研究

鄧文祥，李亮，吳華英，潘繼興，蔡雄，曾光，黃惠勇*

（湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷學湖南省重點實驗室，湖南長沙410208）

四君子湯對FCIR大鼠大腦皮質神經保護作用的實驗研究

鄧文祥，李亮，吳華英，潘繼興，蔡雄，曾光，黃惠勇*

（湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷學湖南省重點實驗室，湖南長沙410208）

目的探討四君子湯對局灶性腦缺血再灌注（focal cerebral ischemia-reperfusion，F(xiàn)CIR）大鼠大腦皮質神經保護作用的機制。方法將48只SD雄性大鼠隨機分成對照組、模型組、尼莫地平組（10.80 mg/kg）、四君子湯組（6 g/kg），每組12只。運用大腦中動脈栓塞法制備大鼠FCIR模型，對照組和模型組給予生理鹽水，其它各組則用相應藥物連續(xù)灌胃14 d。運用Zea-Longa 5級評分法評定FCIR大鼠神經功能，免疫組化檢測層粘連蛋白（laminin,LN）、組織金屬蛋白酶抑制劑1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 1,TIMP1）和基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9,MMP9）表達。結果與對照組比較，模型組神經功能評分顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，四君子湯組、尼莫地平組神經功能評分均明顯減少（P＜0.01），且四君子湯組、尼莫地平組組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。模型組大腦皮質LN陽性表達明顯低于對照組（P＜0.01），四君子湯和尼莫地平組LN陽性表達明顯高于模型組（P＜0.01）。模型組大腦皮質TIMP1、MMP9陽性表達明顯高于對照組（P＜0.01）。四君子湯和尼莫地平組TIMP1陽性表達明顯高于模型組（P＜0.01），而MMP9陽性表達明顯低于模型組（P＜0.01）。結論四君子湯可能通過促進LN和TIMP1表達，抑制MMP9表達，減輕大鼠的神經功能癥狀，進而對FCIR大鼠大腦皮質起到神經保護作用。

四君子湯；腦缺血再灌注；層粘連蛋白；基質金屬蛋白酶的組織抑制劑1；基質金屬蛋白酶9

腦缺血損傷過程中，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）在酶解作用下降解，導致細胞間信號傳遞失調，從而造成神經元損傷、凋亡。ECM是構成血腦屏障的主要成分，也是神經元賴以生存的外環(huán)境和載體，能穩(wěn)定神經系統(tǒng)內環(huán)境學，與中醫(yī)學“脾土”的功能相似，ECM的功能當屬中醫(yī)學“脾土”功能的范疇，因此劉旺華等提出健脾補土法治療腦缺血的理論[1-2]。

血管細胞外基質成分的合成和降解在正常生理情況下保持著動態(tài)平衡,基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）參與了所有ECM成分的調節(jié)，能夠降解ECM的大部分成分[3]。腦缺血過程中，微血管基底膜的損傷導致層粘連蛋白（laminin，LN）表達減少，與纖溶酶原激活系變化有關；組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs）是MMPs的特異性內源性抑制劑，可阻斷MMPs與底物的結合，防止ECM降解，TIMP1為其家族主要成員之一。ECM的降解可以破壞腦微血管結構的完整性，同時損壞血腦屏障，導致繼發(fā)性腦水腫以及腦損傷。研究發(fā)現(xiàn)，健脾補土法組方能減少神經元凋亡對于腦卒中后遺癥，其機制可能是通過抑制MMP9表達以及LN降解[4]。本研究從LN、TIMP1和MMP9蛋白的表達探討健脾補土法名方四君子湯對大腦皮質的神經保護作用，探討四君子湯腦保護作用的可能機制，以期為臨床抗腦缺血/再灌注損傷提供新的思路。

1　材料

1.1動物

清潔級SD大鼠48只，雄性，體質量280~ 300 g。動物由湖南斯萊克景達實驗動物有限司提供，許可證號：SCXK（湘）2013-0004。常規(guī)飼養(yǎng)，運用12 h交替光線進行照明，實驗室通風良好，室溫控制在21~26℃，相對濕度保持在40%~50%。

1.2藥物

選用健脾補土名方四君子湯（由人參9 g，白術9 g，茯苓9 g，炙甘草6 g組成）。水煎液濃縮為含生藥2 g/mL，4℃冰箱冷藏備用。尼莫地平：購于德國拜耳公司，規(guī)格30 mg，溶于蒸餾水配成3.6 mg/mL備用。

1.3主要試劑和儀器

TIMP1兔抗鼠多克隆抗體（Proteintech公司），MMP9兔抗鼠多克隆抗體（Proteintech公司），LN兔抗鼠多克隆抗體（Proteintech公司），PV-9000二步法通用試劑盒（北京中杉金橋生物公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物公司）。手動石蠟切片機（中國浙江金華），顯微攝像圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團公司）。

2　方法

2.1動物分組及給藥

將48只SD大鼠隨機分為4組，對照組、模型組、尼莫地平組（10.8 mg/kg）、四君子湯組（6 g/kg）每組12只。從造模前3 d開始給藥，每天1次，劑量根據(jù)人臨床劑量按動物體表面積換算，對照組、模型組大鼠用等體積蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃14 d。

2.2模型制備及模型篩選

采用大腦中動脈栓塞法制備大鼠局灶性腦缺血/再灌注（focal cerebral ischemia/reperfusion, FCIR）模型[5]。運用Zea-Longa[6]的5級4分評分標準對模型進行篩選：0分，正常，無神經功能缺損；1分，左前肢不能充分伸展，輕度神經功能缺損；2分，行走時，大鼠向癱瘓側（左側）轉圈，中度神經功能缺損;3分，行走時，大鼠身體向癱瘓側（左側）傾倒。重度神經功能缺損；4分，不能自發(fā)行走，有意識喪失。模型只保留神經功能障礙在1級以上的大鼠，不成功者剔除，補充動物，保證每組動物12只。

2.3標本采集及處理

灌胃后第15 d，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉并固定大鼠，用200 mL生理鹽水經左心室快速灌注，至流出液變清，再用4%多聚甲醛緩慢灌注固定30 min，至肝臟變硬白后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛固定4 h。石蠟切片機做冠狀切片，片厚5μm。

2.4指標檢測

2.4.1神經功能評分神經功能評分參照Longa 5級4分法[6]，各組動物在手術完全清醒后和灌注后第15天處死前2 h進行評分。

2.4.2免疫組化檢測LN、TIMP1和MMP9表達具體步驟如下：切片脫蠟、水化組織切片；3%雙氧水孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶；入PBS修復液置微波爐修復抗原，PBS沖洗，2 min×3次；滴加一抗LN、TIMP1或MMP9（均為1∶100），4℃過夜；PBS沖洗，2 min×3次；滴加試劑1，37℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次；滴加試劑2（試劑盒自帶）37℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次；應用DAB溶液顯色，自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、封片。

顯微鏡下LN主要為細胞外基質染成棕黃色顆粒狀。TIMP1、MMP9陽性主要表達于細胞質，為黃色或棕黃色。采用彩色圖像分析系統(tǒng)，每張切片400倍下隨機取6個不重疊的視野，測定陽性表達的面積密度及平均光密度，計算整合光密度值（IOD），IOD=面積密度×平均光密度；陽性反應越大，表示反應越強。

2.5統(tǒng)計學分析

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)均采用“±s”表示。組間兩兩比較方差齊者用LSD法檢驗，方差不齊者用Dunnett's T3法檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3　結果

3.1各組大鼠肢體神經功能評分情況

與對照組比較，模型組神經功能評分顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，四君子湯組、尼莫地平組神經功能評分均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且四君子湯組、尼莫地平組組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

3.2四君子湯對FCIR大鼠大腦皮質LN蛋白表達的影響

對照組LN在神經元及血管細胞外基質呈強陽性表達，染色呈深棕色，厚度適中。模型組、四君子湯組、尼莫地平組表達減弱,染色較淡和厚度變小等。對照組LN在顳葉皮質表達呈強陽性表達；模型組LN表達明顯降低，染色淡；四君子湯組和尼莫地平組LN表達降低，染色較淡。模型組大腦皮質LN陽性表達明顯低于對照組（P＜0.01），四君子湯和尼莫地平組LN陽性表達明顯高于模型組（P＜0.01）見表1，圖1。

3.3四君子湯對FCIR大鼠大腦皮質TIMP1、MMP9蛋白表達的影響

胞漿或胞核著色呈棕黃色為TIMP1陽性細胞。對照組偶見少量TIMP1、MMP9陽性表達；模型組TIMP1、MMP9陽性表達應激性升高；四君子湯組和尼莫地平組TIMP1陽性表達增多，MMP9陽性表達減少。模型組大腦皮質TIMP1、MMP9陽性表達明顯高于對照組（P＜0.01）。四君子湯和尼莫地平組TIMP1陽性表達明顯高于模型組（P＜0.01），而MMP9陽性表達明顯低于模型組（P＜0.01）。見表1，圖2、3。

圖1　各組大鼠皮質LN表達顯微光鏡圖（免疫組化×400）

圖2　各組大鼠皮質TIMP1顯微光鏡圖（免疫組化×400）

圖3　各組大鼠皮質MMP9顯微光鏡圖（免疫組化×400）

表1　各組大鼠神經功能評分及LN、TIMP1、MMP9表達的光密度比較(±s)

表1　各組大鼠神經功能評分及LN、TIMP1、MMP9表達的光密度比較(±s)

注：與對照組比較**P＜0.01，與模型組比較△△P＜0.01。

組別n神經功能評分LN(整合光密度值)TIMP1光密度值MMP9光密度值對照組12 0 35.11±7.25 0.186±0.023 0.053±0.016模型組12 2.83±0.71**13.56±6.23**0.255±0.030**0.405±0.029**四君子湯組12 2.00±0.75**△△23.37±4.69**△△0.357±0.028**△△0.284±0.023**△△尼莫地平組12 1.75±0.88**△△24.25±5.87**△△0.342±0.024**△△0.267±0.021**△△F值4.26 10.23 9.65 8.79 P值0.008 0.00 0.00 0.00

4　討論

缺血性腦血管病以其高發(fā)病率和高致殘率成為當前威脅人類健康的三大主要疾病之一,是威脅中老年人健康的常見疾病[7]。

腦缺血后神經元凋亡是腦損傷和神經功能缺損的重要原因，近年來研究發(fā)現(xiàn)，“失巢凋亡”是神經元凋亡的重要途徑，腦缺血損傷過程中，ECM在酶解作用下降解，同時，導致細胞間信號傳遞失調，從而造成神經元損傷、凋亡，即所謂“失巢凋亡”?！捌楹筇熘荆瑲庋础笔侵嗅t(yī)學的基本理論之一，“脾者土也……土者生萬物……”，土為坤元，“至哉坤元，萬物滋生，坤厚載物”。而ECM是神經元賴以生存的外環(huán)境和載體，如同神經元的“巢穴”，具有承載、營養(yǎng)、保護、促進神經元突觸生長、促進干細胞轉化為神經元的作用，從這一角度來看，ECM的功能當屬中醫(yī)學“脾土”功能的范疇，而“失巢凋亡”當屬脾虛承載功能不足的范疇。神經細胞外ECM的破壞和降解在FCIR損傷過程中發(fā)揮重要作用，LN為ECM的重要組成成分。李瑞梅等[8]研究發(fā)現(xiàn)FCIR后LN的表達先降低后回升，與血腦屏障的病理性改變有關，其可造成繼發(fā)性腦水腫損傷；與促使新生血管生成相關聯(lián)。TIMPs是MMPs的特異性抑制劑，特異性抑制MMPs的活性。當機體出現(xiàn)缺血缺氧性變化出現(xiàn)在腦組織中時，大量的MMP9將由組織中的血管內皮細胞以及中性粒細胞分泌并且釋放，同時，MMP9與炎癥的發(fā)生關系較為密切，ECM的降解與其釋放呈正相關，可能增加血腦屏障的通透性，進一步誘導血管腦源性水腫[9]。正常情況下，MMPs和TIMPs相互作用，使ECM處于動態(tài)平衡中。因此，如果MMP和TIMP之間的平衡被打破，有可能會影響到ECM的合成與降解。黃越等[10]研究發(fā)現(xiàn)TIMP1在新生鼠缺血腦組織表達明顯增加，可能與新生鼠缺血腦組織損傷有關。

四君子湯出自《太平惠民和劑局方·卷三》，是健脾補土的名方，該方以人參為君，甘溫益氣，補中健脾養(yǎng)胃；白術苦溫，健脾燥濕，濕去脾自健，合人參益氣助運之力為臣；茯苓甘淡為佐，健脾滲濕，苓術合用，則進一步增強健脾除濕以及運化之力；炙甘草甘溫，益氣和中，調和諸藥，共同發(fā)揮補氣健脾功效為使。四藥配伍，共奏益氣健脾之功。脾為后天之本，氣血生化之源，《靈樞·海論》記載“腦為髓之海腦”，《素問·脈要精微論》記載“頭者,精明之府”，其與人體的生命、精神以及感覺等方面密切相關?！端貑枴そ浢}別論》記載：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺。及脾主升清，運化水谷精微濡養(yǎng)腦髓。由此可見脾腦相關的橋梁可能通過脾胃的氣機升降功能實現(xiàn)，為其腦部病變的防治提供了理論依據(jù)[11]。

本實驗結果顯示，F(xiàn)ICR后可見明顯神經功能損害，ECM在酶解作用下降解，與文獻報道基本相符[8-10]，提示ECM在FCIR所致神經元損傷中發(fā)揮重要作用。而四君子湯組和尼莫地平組TIMP1陽性表達高于模型組，MMP9陽性表達明顯減少，LN陽性表達明顯多于模型組，提示四君子湯對神經功能具有保護作用，其機制可能與促進LN和TIMP1表達，抑制MMP9表達，從而維護細胞外基質完整性、保護神經元細胞有關。其具體機制有待研究?，F(xiàn)代研究表明[12]人參皂苷Rb1可能在腦缺血死后神經可塑性中起促進作用，與其促進大鼠局灶性腦缺血后腦白質重塑有關；研究發(fā)現(xiàn)[13]人參皂苷Rg2可通過減少缺血再灌注大鼠神經功能評分，減少腦梗死面積，提高膽堿能神經活性，對腦缺血再灌注損傷具有防護作用。這可能是四君子湯腦保護作用的物質基礎之一。

[1]劉旺華,李花,周小青.論神經細胞外基質與中醫(yī)脾土相關及其對腦缺血保護的啟示[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2010,17(3):5-6,56.

[2]付小金,劉旺華,李花,等.健脾補土方對腦缺血/再灌注損傷大鼠NF-κB和IκBα蛋白表達水平的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報, 2015,35(3):5-8+73.

[3]Chang JH,Huang YH,Cunningham CM,et al.Matrix metalloprotei nase 14 modulates signal transduction and angiogenesis in the cornea[J].Surv Ophthalmol,2015,61(4):478-97.

[4]李花,劉旺華,周小青,等.健脾補土法對腦缺血再灌注大鼠腦組織MMP-2的表達及血腦屏障通透性的影響[J].湖南中醫(yī)雜志, 2013,29(2):115-117.

[5]Gui YK,Su LL,Niu XL,et al.Effects of MK-801 concentration on cell proliferation in rats with focal cerebral ischemiareperfusion[J].Genet Mol Res,2015,14(4):12841-12847.

[6]陳斌,李鉆芳,林如輝,等.電針調控細胞周期相關蛋白對局灶性腦缺血大鼠皮質細胞增殖的影響[J].中國康復醫(yī)學雜志,2016,31 (07):729-733.

[7]雷麗萍,劉旺華,周鴻圖,等.中醫(yī)藥促進神經干細胞增殖與分化用于抗腦缺血損傷的研究進展[J].醫(yī)學綜述,2013,19(19):3466-3469.

[8]李瑞梅,楊迎春,任占川.大鼠腦缺血再灌注后層粘連蛋白表達的研究[J].中外醫(yī)療,2011,5(14):23-24.

[9]王思念,黃志梅.銀杏達莫注射液對急性腦梗死患者MMP-9、血管內皮功能及預后的影響[J].醫(yī)學綜述,2016,22(8):1597-1599.

[10]黃越,吳春,劉增榮,等.新生鼠缺血腦組織MMP-9、TIMP1表達及其意義[J].川北醫(yī)學院學報,2012,27(3):250-252.

[11]陳麗娟,馮珂.論脾與腦的相關性[J].山東中醫(yī)藥大學學報, 2016,40(1):11-13.

[12]胡光強,張慧,蕭洪文,等.人參皂苷Rbl對大鼠局灶性腦缺血白質重塑的影響[J].中國臨床解剖學雜志,2015,33(4):451-454.

[13]陳美華,吳月鵬,張顏波,等.人參皂苷Rg2對腦缺血再灌注大鼠神經保護作用的研究[J].中風與神經疾病雜志,2014,31(12): 1089-1092.

（本文編輯 楊瑛）

Neuroprotective Effect of Sijunzi Decoction on Cerebral Cortex in FCIR Rats

DENG Wenxiang,LI Liang,WU Huaying,PAN Jixing,CAI Xiong,ZENG Guang,HUANG Huiyong*
(Provincial Key Laboratory of TCM Diagnostics,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China）

Objective To explore the mechanism of neuroprotective effect of Sijunzi Decoction on cerebral cortex in focal cerebral ischemia-reperfusion (FCIR)rats.Methods 48 male Sprague Dawley(SD)rats were random ly divided into control group,model group,nimodipine group and Sijunzi Decoction group,with 12 rats in each group.The FCIR rat models were established by middle cerebral artery occlusion.The control and model groups were treated with normal saline for 14 d, while nimodipine and Sijunzi Decoction groups were treated with nimodipine(10.80 mg/kg)and Sijunzi Decoction(6 g/kg)for 14 d,respectively.The neural function of FCIR rats was assessed according to five grade scale proposed by Zea-Longa.The expressions of LN,TIMP1 and MMP9 protein were determined by immunohistochemistry.Results Compared with the control group,scores of neural function increased remarkably in model group(P＜0.01).Compared with the model group,the scores of nimodipine and Sijunzi decoction groups decreased remarkably(P＜0.01),but there was no difference between nimodipine and Sijunzi decoction groups(P＞0.05).The expression of LN in model group was lower than that in the control group(P＜0.01),while the LN expression in nimodipine and Sijunzi decoction groups was higher than that in the model group(P＜0.01).The expression of TIMP1 and MMP9 in the model group was obviously higher than that in the control group(P＜0.01).The TIMP1 postive expression of nimodipine and Sijunzi decoction groups was obviously higher than that in model group(P＜0.01),while the expressiom of MMP9 was lower than that in the model group(P＜0.01).ConclusionThe neuroprotective effect of Sijunzi Decoctioon on cortex in FCIR rats may be by promoting the expression of LN and TIMP1,inhibiting the expression of MMP9,improving the neural function.

Sijunzi Decoction;cerebral ischemia reperfusion;LN;TIMP1;MMP9

R285.5；R743.3

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2016.11.003

2016-05-21

湖南省教育廳科學研究項目重點項目（60010408）；湖南省科技廳社會發(fā)展支撐計劃重點項目（2014S2032）；湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（2014153）；中醫(yī)診斷學國家重點學科建設項目（2013ZYZD04）；湖南中醫(yī)藥大學研究生院華潤三九科研創(chuàng)新項目（2015SJ01）。

鄧文祥，男，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)辨證學與數(shù)字中醫(yī)藥。

*黃惠勇，男，教授，博士研究生導師，E-mail:tony427000@aliyun.com。