片仔癀抑制淋巴管新生的作用及其機制研究

馮健愉，靳祎祎，嚴兆坤，賴子君，彭軍，林久茂

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122）

片仔癀抑制淋巴管新生的作用及其機制研究

馮健愉1，2，靳祎祎1，2，嚴兆坤1，2，賴子君1，2，彭軍1，2，林久茂1，2

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122）

目的研究片仔癀（PZH）體外對淋巴管新生的抑制作用及其機制。方法體外培養(yǎng)人淋巴內(nèi)皮細胞（HLEC），分成對照組及PZH低、中、高劑量組，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化；流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡；Transwell觀察細胞遷移；Tube Formation觀察細胞管腔形成；W estern Blot檢測細胞促淋巴管新生相關(guān)因子蛋白表達。結(jié)果PZH低、中劑量組對HLEC的細胞形態(tài)、周期、凋亡無明顯影響，而PZH高劑量組具有降低細胞密度、誘導(dǎo)HLEC凋亡、增加G0／G1期細胞比例和降低S期細胞比例的顯著作用（P＜0.05）；PZH可顯著降低HLEC的遷移能力和管腔形成能力，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴；PZH明顯下調(diào)HLEC中VEGF-C、VEGFR-3、MMP-1和MMP-3／10的蛋白表達（P＜0.05）。結(jié)論PZH體外對HLEC的淋巴管新生有顯著抑制作用，通過抑制VEGFC、VEGFR-3、MMP-1和MMP-3／10等表達是其抑制淋巴管新生的重要作用機制。

片仔癀；淋巴內(nèi)皮細胞；淋巴管新生

淋巴管新生（lymphangiogenesis）是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機制［1］，受到多種因子的調(diào)控，其中血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）及其受體VEGFR-3和基質(zhì)金屬蛋白酶家族蛋白可抑制淋巴內(nèi)皮細胞凋亡，促進細胞增殖、遷移及其管腔形成，并最終導(dǎo)致淋巴管新生［2-3］。抑制淋巴管新生已成為一種極具潛能的腫瘤治療策略。片仔癀（Pien Tze Huang，PZH）對多種惡性腫瘤的臨床療效顯著，且無明顯毒副作用［4］。實驗研究顯示：PZH可誘導(dǎo)大腸癌細胞凋亡，抑制大腸癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥及腫瘤血管新生等［5-8］，但未見從淋巴管新生方面探討PZH抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的研究報道。本課題組開展了初步的研究，現(xiàn)報告如下。

1材料

1.1 藥物和細胞株P(guān)ZH由漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司提供（生產(chǎn)批號：1009039）；人淋巴內(nèi)皮細胞（HLEC）購自廣州吉尼歐生物科技有限公司。

1.2 試劑與耗材RPIM 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶、青霉素-鏈霉素混合液（雙抗，美國Thermo公司）；AnnexinⅤ-FITC／PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期即時檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；Transwell板（美國Corning公司）；管腔形成試劑盒（德國Merck Millipore公司）；抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板（無錫耐思生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica儀器有限公司）；流式細胞儀（FCM，美國BD公司）；Trans-Blot小型轉(zhuǎn)印槽轉(zhuǎn)膜儀、ChemiDocXRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）。

2方法

2.1 藥物及試劑的配置PZH在研缽中研成細粉末后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成20 mg／m L溶液，經(jīng)高壓滅菌后于-20℃貯存?zhèn)溆?。RPMI 1640完全基礎(chǔ)培養(yǎng)基含10%FBS和1%雙抗，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng)和分組給藥HLEC用RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2和飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分成對照組（0 mg／mL）、低劑量組（0.25 mg／mL）、中劑量組（0.5 mg／mL）及高劑量組（0.75 mg／m L）。每組設(shè)3個復(fù)孔，各組給予相應(yīng)劑量的PZH干預(yù)24 h。

2.3 HLEC生長狀態(tài)觀察取對數(shù)生長的HLEC接種于6孔板，經(jīng)不同濃度PZH干預(yù)后，用倒置顯微鏡觀察細胞的生長情況。

2.4 細胞周期檢測采用碘化丙啶（PI）染色，流式細胞儀檢測各組細胞周期分布情況，按細胞周期檢測試劑盒說明操作。

2.5 細胞凋亡檢測采用AnnexinⅤ／PI染色，流式細胞儀檢測HLEC凋亡。具體操作參照細胞凋亡檢測試劑盒說明。

2.6 細胞遷移分析采用Transwell實驗觀察PZH對HLEC遷移能力的影響，實驗操作參考Shen等［6］報道的方法，結(jié)果采用倒置顯微鏡觀察并成像處理。

2.7 管腔形成分析采用Tube Formation實驗觀察PZH對HLEC管腔形成的影響，實驗操作參考Shen等［7］報道的方法，結(jié)果采用倒置顯微鏡觀察并成像處理。

2.8 蛋白表達檢測采用Western Blot法檢測PZH對HLEC胞漿中VEGF-C、VEGFR-3、MMP-1和MMP-3／10等蛋白表達的影響，并用凝膠成像系統(tǒng)進行圖像數(shù)據(jù)分析。

2.9 統(tǒng)計學(xué)處理多組實驗數(shù)據(jù)間比較使用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以x±s表示。

3結(jié)果

3.1 PZH對HLEC生長的影響與對照組比較，PZH低、中劑量組HLEC密度未見明顯降低，而PZH高劑量組細胞數(shù)量減少，見圖1。

3.2 PZH對HLEC增殖的影響與對照組比較，PZH低、中劑量組對細胞周期無影響，而PZH高劑量組顯著增加G0／G1期細胞的比例，降低S期細胞的比例，對G2／M期無影響，使細胞周期阻滯于G0／G1期。見圖2。

3.3 PZH對HLEC凋亡的影響與對照組比較，低、中劑量組對細胞凋亡無明顯影響，而高劑量組細胞凋亡增加。見圖3。

3.4 PZH對HLEC遷移能力的影響對照組有較多的細胞穿過小孔膜，而不同濃度PZH干預(yù)后穿過小孔的細胞數(shù)量逐漸減少，呈劑量依賴作用，說明PZH能顯著降低HLEC的遷移能力。見圖4。

3.5 PZH對HLEC管腔形成能力的影響對照組有較多的管腔形成，而不同濃度PZH干預(yù)后能減少HLEC的管腔形成，呈劑量依賴作用，提示PZH能顯著降低HLEC的管腔形成能力。見圖5。

3.6 PZH對HLEC的VEGF-C、VEGFR-3、MMP-1、MMP-3／10蛋白表達的影響見圖6。

4討論

據(jù)報道，PZH具有保肝［9］、改善心腦血管功能［10］等作用，臨床上對多種惡性腫瘤的臨床治療有著顯著的效果。前期體內(nèi)外實驗證實了PZH可誘導(dǎo)大腸癌細胞凋亡、抑制大腸癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥及腫瘤血管新生等，但其抗腫瘤轉(zhuǎn)移的機制仍需進一步闡明。近期研究表明：淋巴管新生是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要因素和重要機制之一，研究PZH抑制淋巴管新生，可進一步揭示其抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機制。

淋巴管新生指在某些病理狀態(tài)下，淋巴內(nèi)皮細胞受趨化因子作用而遷移至局部組織，然后在內(nèi)皮生長因子作用下增殖形成新的淋巴管，包括淋巴內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管腔形成的過程，且該過程相當(dāng)復(fù)雜，涉及許多黏附分子、蛋白溶酶、細胞因子和生長因子等的參與，其中，血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）是最重要的促淋巴管新生因子之一［11］。當(dāng)VEGF-C與淋巴內(nèi)皮細胞上的特異性受體VEGFR-3結(jié)合后，可通過選擇性地促進淋巴細胞增殖、瘤周及瘤內(nèi)新淋巴管的形成，使原有淋巴管增生、管徑增加，參與淋巴管新生與腫瘤轉(zhuǎn)移；也可通過激活下游多條促淋巴管新生相關(guān)通路，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）蛋白的表達水平，從而特異性地促進淋巴管生成，引起腫瘤轉(zhuǎn)移［12］。而基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）在細胞遷移過程中也發(fā)揮著重要作用［3］，其中，MMP-1可由HLEC產(chǎn)生，溶解相應(yīng)的膠原，有利于細胞的遷移；MMP-3和MMP-10屬于基質(zhì)溶解酶，能作用于PG（蛋白聚糖）、LN（層粘連蛋白）、FN（纖連蛋白）、Ⅲ型和Ⅳ型膠原及明膠，促進細胞遷移［13］。因此，VEGF-C、VEGFR-3、MMP-1、MMP-3／10的表達與腫瘤淋巴管新生、腫瘤轉(zhuǎn)移都密切相關(guān)，下調(diào)這些蛋白的表達可顯著抑制腫瘤淋巴管新生與轉(zhuǎn)移。

本研究以人淋巴內(nèi)皮細胞（HLEC）為研究對象，用PZH對其進行干預(yù)，觀察PZH對淋巴管新生的影響。結(jié)果顯示：PZH低、中劑量組對HLEC的細胞形態(tài)、細胞周期、細胞凋亡無明顯影響，而PZH高劑量組具有降低細胞密度、增加G0／G1期細胞比例和降低S期細胞比例、誘導(dǎo)HLEC凋亡的顯著作用，提示高劑量PZH對抑制HLEC增殖、促進HLEC凋亡具有一定作用。PZH各劑量均可顯著降低HLEC的遷移和管腔形成能力，該結(jié)果提示PZH抑制淋巴管新生并不是主要通過抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡，而是通過抑制HLEC的遷移和淋巴管形成能力。此外，PZH能顯著下調(diào)HLEC中VEGF-C、VEGFR-3、MMP-1和MMP-3／10的蛋白表達，提示通過下調(diào)上述蛋白的表達是PZH抑制淋巴新生的重要作用機制。

然而，作為中藥復(fù)方的PZH，其化學(xué)成分極為復(fù)雜，治療機制具有多途徑、多靶點的特點，而淋巴管新生和大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也是一個復(fù)雜的過程，因此后續(xù)可進一步通過多條促淋巴管新生信號通路，更系統(tǒng)地探討PZH抑制大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用機制。

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R285.6

A

1000-338X（2016）04-0043-03

2016-06-05

福建省自然科學(xué)基金（2015J01337）

馮健愉（1989—），女，碩士研究生，主要從事中藥抗腫瘤的機制研究。

林久茂（1975—），男，副研究員，醫(yī)學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師。E－mail：jiumaolin@hotmail.com