筋骨草總黃酮對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響

南麗紅，黃枚，賴文芳，賈銣，鄭燕芳，楊瀾，謝晴晴，彭衛(wèi)華

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院，福建福州350025）

筋骨草總黃酮對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響

南麗紅1，黃枚1，賴文芳1，賈銣1，鄭燕芳1，楊瀾1，謝晴晴1，彭衛(wèi)華2

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院，福建福州350025）

目的觀察筋骨草總黃酮對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響。方法LPS誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖，筋骨草總黃酮含藥血清干預(yù)24、48 h后，用MTT法檢測(cè)腎小球系膜細(xì)胞增殖情況，硝酸還原酶法、Elisa法分別檢測(cè)培養(yǎng)液上清中NO、iNOS、MCP-1的含量。結(jié)果LPS能明顯誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖，培養(yǎng)液上清中NO、iNOS、MCP-1的含量明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05或0.01）。10%、5%筋骨草總黃酮含藥血清干預(yù)后OD值及培養(yǎng)液上清中NO、iNOS、MCP-1的含量均明顯減少（P＜0.05或0.01）。結(jié)論筋骨草總黃酮能抑制LPS誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞異常增殖和炎癥介質(zhì)NO、iNOS、MCP-1的釋放。

腎小球系膜細(xì)胞；增殖；一氧化氮；一氧化氮合酶；單核細(xì)胞趨化蛋白-1；筋骨草總黃酮

腎小球系膜細(xì)胞（glomerularmesangialcell，GMC）是腎小球中功能最活躍的固有細(xì)胞，GMC異常增生以及由此而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（extracelluarmatrix，ECM）的過(guò)量生成和聚積，是許多腎小球疾病常見(jiàn)的病理改變，并可最終引起腎小球硬化，是使腎小球疾病發(fā)展至終末期腎病的中心環(huán)節(jié)之一［1］，因此抑制GMC增生是治療增生性腎臟病、防止病變惡化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）與一氧化氮（nitric oxide，NO）是GMC激活后產(chǎn)生的2種炎癥介質(zhì)，一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）是NO合成反應(yīng)的限速酶。其中誘導(dǎo)型NOS（inducible NOS，iNOS）在多種因素刺激下表達(dá)增加，導(dǎo)致NO過(guò)量生成，從而對(duì)系膜細(xì)胞產(chǎn)生病理性損傷。筋骨草（Ajuga decumbens Thunb）具有清熱抗炎、抑制I型變態(tài)反應(yīng)等作用，其有效成分為黃酮類化合物［2］。課題組前期研究［3-5］發(fā)現(xiàn)筋骨草總黃酮（total flavonoids of Ajuga，TFA）能明顯抑制系膜增生性腎小球腎炎模型大鼠GMC增殖、減少細(xì)胞外基質(zhì)積聚，具有促進(jìn)腎小球病理改變恢復(fù)的作用，其作用與抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷和抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB等表達(dá)有關(guān)。但TFA對(duì)GMC分泌NO、MCP-1的影響，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。故我們通過(guò)LPS誘導(dǎo)體外大鼠GMC增殖模型，觀察TFA含藥血清對(duì)GMC增殖及分泌NO、iNOS、MCP-1的影響，為T(mén)FA在慢性腎臟疾病治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和大鼠GMC清潔級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)：0054797。大鼠HBZY-1腎小球系膜細(xì)胞株（無(wú)錫博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2 藥物及試劑TFA（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥物制劑實(shí)驗(yàn)室）；PRMI 1640培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清（FBS，美國(guó)Hyclone公司）；胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司）；MTT（美國(guó)Amresco公司）；脂多糖（LPS，美國(guó)Biosharp公司）；DMSO（美國(guó)Amresco公司）；大鼠MCP-1 Elisa試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；NO、iNOS試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 儀器HERAcell 150型CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司）；ELX800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；TDL-5-A離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；IX70倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；BS210S分析電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；Costar TM 96孔、24孔培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)血清的制備SD大鼠隨機(jī)分為空白血清組、TFA血清組。TFA血清組按前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的有效劑量2.16 g／kg，根據(jù)中藥藥理研究方法學(xué)，TFA溶液分2次給予灌胃，連續(xù)給藥3 d，最后1 d 2次給藥的間隔時(shí)間為2 h。于末次給藥1 h后，腹主動(dòng)脈取血，室溫條件下靜置4 h，3 000 r／min離心15 min，無(wú)菌條件下分離血清，置56℃恒溫水浴箱中30 min作滅活處理，過(guò)濾除菌后，于-20℃冰箱

保存?zhèn)溆?。空白血清組大鼠灌服等體積蒸餾水，與TFA血清組同時(shí)采血，提取血清方法同前。

2.2 細(xì)胞株的處理購(gòu)買(mǎi)的大鼠HBZY-1腎小球系膜細(xì)胞株是以25 cm2／50 mL培養(yǎng)瓶運(yùn)送，瓶?jī)?nèi)裝滿10%FBS的PRMI 1640培養(yǎng)液。收到細(xì)胞株，倒置相差顯微鏡下觀察GMC貼壁生長(zhǎng)良好，體積較大，呈梭形、三角形或不規(guī)則星形。將培養(yǎng)瓶置于CO2培養(yǎng)箱中靜置24 h后，吸棄大部分培養(yǎng)液，繼續(xù)置CO2培養(yǎng)箱中至細(xì)胞達(dá)70%～80%融合時(shí)進(jìn)行傳代，傳代后的GMC常規(guī)培養(yǎng)。

2.3 分組與含藥血清干預(yù)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠GMC用0.25%胰酶消化后，用10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液制成濃度為3×104個(gè)／mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加細(xì)胞懸液100μL。CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，細(xì)胞完全貼壁之后，棄上清液，用1%FBS的PRMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使GMC同步生長(zhǎng)于G0期。將96孔培養(yǎng)板中的大鼠GMC分為5組：①正常對(duì)照組：加入10%正常大鼠血清；②LPS組：加入LPS和10%正常大鼠血清；③10%TFA含藥血清組：加入LPS和10% TFA含藥血清；④5%TFA含藥血清組：加入LPS和5%TFA含藥血清；⑤2.5%TFA含藥血清組：加入LPS和2.5%TFA含藥血清。加入LPS的終濃度均為10μg／mL，血清終濃度不足10%的加入正常大鼠血清補(bǔ)齊。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔培養(yǎng)液200 μL，CO2培養(yǎng)箱中孵育24、48 h后，用MTT法檢測(cè)各組大鼠GMC增殖情況。

2.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)含藥血清干預(yù)24、48 h后，于每孔中加入5 mg／mL MTT溶液20μL，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μL DMSO，震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的光吸收值（OD值）。

2.5 NO、iNOS、MCP-1含量檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠GMC以1×105個(gè)／mL接種于24孔板中，1 mL／孔，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁，用1%FBS的PRMI 1640培養(yǎng)液使GMC同步生長(zhǎng)于G0后。分組及藥物干預(yù)同2.3項(xiàng)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心，取上清液按試劑盒說(shuō)明書(shū)，用硝酸還原酶法檢測(cè)培養(yǎng)液上清中NO、iNOS含量，Elisa法檢測(cè)培養(yǎng)液上清中MCP-1含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)屬正態(tài)分布用x±s表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 TFA含藥血清組對(duì)大鼠GMC增殖影響見(jiàn)表1。

表1 TFA含藥血清組對(duì)大鼠GMC增殖影響（x±s）

3.2 TFA含藥血清組對(duì)培養(yǎng)液上清中NO、iNOS、MCP－1含量的影響見(jiàn)表2～表3。

表2 TFA含藥血清組對(duì)培養(yǎng)液上清中NO、iNOS含量的影響（±s）

表2 TFA含藥血清組對(duì)培養(yǎng)液上清中NO、iNOS含量的影響（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與LPS組比較，3）P＜0.05。

4討論

4.1 在正常生理情況下，GMC保持極低的增殖活性。在病理狀態(tài)下，多種損傷因子和有害物質(zhì)均可刺激GMC活化，活化的GMC可異常增殖，自分泌炎癥介質(zhì)（如IL-1、TNF-α、NO、MCP-1等），這些合成、釋放的炎癥介質(zhì)與GMC上特異受體結(jié)合，又促進(jìn)GMC增殖和活化，形成了增強(qiáng)GMC活動(dòng)的自我調(diào)節(jié)環(huán)。如此循環(huán)反復(fù)，使GMC持續(xù)受損，ECM聚積，最終導(dǎo)致終末期腎病。

4.2 NO是一個(gè)具有廣泛生理活性的小分子，對(duì)腎

臟有明顯的雙重作用，在腎臟的生理和病理過(guò)程中起重要作用。在生理方面，對(duì)于腎血管的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、腎小管球間反饋、尿鈉排泄、交感神經(jīng)遞質(zhì)及腎素的釋放和溶質(zhì)及水在腎小管中的交換都發(fā)揮著重要作用［6］。若NO在短期內(nèi)大量合成，則可導(dǎo)致腎組織損傷引發(fā)急性炎癥反應(yīng)［7］。NO可由NOS催化L-精氨酸與氧分子經(jīng)多步氧化還原反應(yīng)生成，NOS可分為2大類，一類是構(gòu)成型NOS，包括內(nèi)皮型NOS和神經(jīng)元型NOS，是許多正常組織中基本存在的一種酶；另一類是iNOS，當(dāng)細(xì)胞受到微生物內(nèi)外毒素、炎癥介質(zhì)等刺激后才被激活表達(dá)，從而產(chǎn)生過(guò)量的NO，促進(jìn)GMC增生和細(xì)胞外基質(zhì)沉積［8-9］。MCP-1屬于趨化因子CC亞家族的一員，可由腎組織內(nèi)的系膜細(xì)胞合成和分泌，參與調(diào)節(jié)單核／巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，在正常人組織中有少量表達(dá)。當(dāng)GMC組織受損、缺氧、中毒、炎癥等刺激下，MCP-1的表達(dá)增強(qiáng)，可趨化和激活單核／巨噬細(xì)胞至腎小球系膜區(qū)引起廣泛的炎癥浸潤(rùn)，促進(jìn)GMC的活化和增生，使ECM聚集，加速腎小球硬化［10］。

表3 TFA含藥血清對(duì)培養(yǎng)液上清中MCP-1含量的影響（±s）

表3 TFA含藥血清對(duì)培養(yǎng)液上清中MCP-1含量的影響（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與LPS組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01。

4.3 根據(jù)藥理學(xué)原理，口服藥物必須經(jīng)由胃腸道吸收、體內(nèi)代謝為活性代謝產(chǎn)物后發(fā)揮藥理學(xué)作用。而血清藥理學(xué)能客觀地模擬了藥物與機(jī)體相互作用過(guò)程，其血清所含的藥物成分，也是經(jīng)過(guò)體內(nèi)一系列生物轉(zhuǎn)化后，真正發(fā)揮作用的有效成分及藥物作用下機(jī)體所產(chǎn)生的內(nèi)生性有效成分，并且血清的理化性質(zhì)與細(xì)胞所處的內(nèi)環(huán)境相似［11－12］。因此，若TFA直接用于體外細(xì)胞，缺乏TFA在體內(nèi)的代謝過(guò)程，并不能真實(shí)反映TFA在體內(nèi)的藥理作用。故本實(shí)驗(yàn)中采用了TFA含藥血清，有助于進(jìn)一步探討TFA對(duì)GMC增殖的影響。

4.4 本實(shí)驗(yàn)采用LPS作為刺激因子，作用于體外培養(yǎng)的GMC，結(jié)果顯示LPS能誘導(dǎo)GMC異常增殖，并可使NO、iNOS、MCP-1的釋放量明顯增加。TFA含藥血清干預(yù)24、48 h后能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的GMC增殖，培養(yǎng)液上清中NO、iNOS、MCP-1含量亦明顯減少，提示TFA可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的GMC異常增殖，并可明顯減少炎癥介質(zhì)NO、iNOS、MCP-1的釋放，從而有利于減輕GMC的持續(xù)受損，延緩腎小球疾病的慢性進(jìn)展。

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R285.5

A

1000-338X（2016）04-0034-03

2016－05－22

福建省科學(xué)技術(shù)廳自然科學(xué)基金資助課題（2014J05094）

南麗紅（1974—），女，副教授，主要從事中藥藥理研究。

彭衛(wèi)華（1970—），男，副主任醫(yī)師。E-mail：pwhua7011@ aliyun.com