癲癇大鼠海馬組織中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白型前列腺素D合成酶的表達(dá)變化

徐祖才，羅忠，陳倩，唐世容，黃浩

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003 )

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·基礎(chǔ)研究·

癲癇大鼠海馬組織中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白型前列腺素D合成酶的表達(dá)變化

徐祖才，羅忠，陳倩，唐世容，黃浩

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003 )

目的 觀察癲癇大鼠海馬腦組織中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白型前列腺素D合成酶(L-PGDS)的表達(dá)變化。方法 取35只大鼠，隨機(jī)分為觀察組30只和對照組5只，觀察組采用氯化鋰-匹羅卡品建立癲癇持續(xù)狀態(tài)模型；對照組和觀察組建模后第1、3、7、14、30、60天各取5只，麻醉后斷頭取海馬組織，用Western bolt法檢測海馬組織L-PGDS蛋白，免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)對L-PGDS進(jìn)行海馬區(qū)細(xì)胞定位。結(jié)果 對照組大鼠海馬組織中L-PGDS蛋白相對表達(dá)量為0.172±0.007，觀察組建模后第1、3、7、14、30、60天大鼠海馬組織中L-PGDS蛋白相對表達(dá)量分別為0.190±0.004、0.195±0.003、0.231±0.010、0.322±0.010、0.417±0.006、0.454±0.009；觀察組隨著建模時間延長L-PGDS蛋白相對表達(dá)量增加(P均<0.05)，且各時點(diǎn)均高于對照組(P均<0.01)。免疫熒光雙標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)，L-PGDS主要表達(dá)于神經(jīng)元的樹突和星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中。結(jié)論 L-PGDS在癲癇大鼠海馬組織中表達(dá)增加，可能參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展過程，可作為癲癇診斷的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

癲癇；脂質(zhì)運(yùn)載蛋白型前列腺素D合成酶；海馬；匹羅卡品；氯化鋰；大鼠

癲癇是一種常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病與炎癥介質(zhì)有關(guān)，而前列腺素是重要的炎癥介質(zhì)之一[1]。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白型前列腺素D合成酶(L-PGDS)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，具有催化合成前列腺素D2(PGD2)和轉(zhuǎn)運(yùn)親脂性物質(zhì)等重要功能，其在體溫調(diào)節(jié)、睡眠周期建立、神經(jīng)傳遞及疼痛反應(yīng)[2]，以及神經(jīng)元凋亡發(fā)生、細(xì)胞毒性等方面具有重要作用[3]。有研究[4]表明，PGD2與癲癇發(fā)作及發(fā)作后睡眠密切相關(guān)。然而，癲癇發(fā)作后L-PGDS在腦內(nèi)表達(dá)是否有改變目前尚不清楚。2015年7月～2016年4月，我們擬用氯化鋰-匹羅卡品建立癲癇模型，通過Western blot法檢測大鼠海馬組織內(nèi)L-PGDS蛋白，同時使用免疫熒光技術(shù)明確L-PGDS在腦組織中的表達(dá)部位，觀察大鼠癲癇后L-PGDS的表達(dá)變化過程，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 SD雄性大鼠,體質(zhì)量200～230 g,購于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,清潔級,許可證號：SCXK(渝)2012-0005。常規(guī)室溫分籠飼養(yǎng),給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料及純凈飲水。動物處理方法符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》。氯化鋰和匹羅卡品購于Sigma-Aldrich公司，兔抗鼠L-PGDS、β-actin單克隆抗體、小鼠抗兔GFAP及MAP2單克隆抗體購于Abcan公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記及TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光二抗購于Santa Cruz公司，RIPA和DAPI購于杭州碧云天生物技術(shù)有限公司，水合氯醛、羊抗兔(二抗)、Triton X-100、PBS均由武漢博士德生物工程有限公司提供，蛋白垂直電泳儀及轉(zhuǎn)移電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)，激光共聚焦顯微鏡為德國 Leica公司生產(chǎn)。

1.2 分組與造模 取35只大鼠，隨機(jī)分為觀察組30只和對照組5只，觀察組采用氯化鋰-匹羅卡品建立癲癇癲癇狀態(tài)模型；先腹腔注射氯化鋰127 mg/kg,18～20 h后腹腔注射匹羅卡品 20 mg/kg。按照Racine分級法分級，當(dāng)發(fā)作達(dá)到4級以上且持續(xù)1 h為癲癇持續(xù)狀態(tài)，發(fā)作15 min后腹腔注射阿托品10 mg/kg拮抗其M膽堿能樣作用，發(fā)作1 h后給予安定10 mg/kg停止發(fā)作。觀察組分別于建模后第1、3、7、14、30、60天各取5只，以3.5%水合氯醛1 mL/100 g腹腔注射麻醉后迅速斷頭取海馬組織，放入-80 ℃冰箱備用。

1.3 大鼠海馬組織L-PGDS蛋白表達(dá)檢測 采用Western bolt法。將腦組織加入RIPA溶解后離心，取上清液進(jìn)行蛋白定量。各上樣孔加入20 μL對應(yīng)樣品，然后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗(抗L-PGDS，1∶1 000)置于4 ℃冰箱過夜。洗滌后加入二抗，常溫1 h后再次洗滌。使用發(fā)光劑后在暗室內(nèi)用X線膠片曝光，掃描器掃描膠片后用IPP軟件統(tǒng)計(jì)灰度值。以目的條帶與β-actin條帶灰度比值表示L-PGDS蛋白相對表達(dá)量。

1.4 大鼠海馬組織內(nèi)L-PGDS細(xì)胞定位觀察 采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)。取對照組與觀察組建模第60天的冰凍切片，滴加0.3%的Triton X-100于37 ℃的水浴箱內(nèi)孵育15 min；PBS充分洗滌，用山羊血清封閉液進(jìn)行封閉。將兔抗L-PGDS(1∶100)、小鼠抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP，1∶1 000)及小鼠抗微管相關(guān)蛋白2(MAP-2，1∶10 000)抗體混合后滴于切片上，并置于4 ℃冰箱內(nèi)過夜；次日取出后用PBS充分洗滌，避光下滴入FITC標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗及TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光二抗；經(jīng)DAPI染色后使用甘油封片，在激光共聚焦掃描顯微鏡下采圖。L-PGDS呈紅色熒光，星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP和神經(jīng)元樹突特異性標(biāo)志物MAP-2均呈綠色熒光，細(xì)胞核標(biāo)志物DAPI呈藍(lán)色熒光。計(jì)數(shù)陽性表達(dá)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠海馬組織中L-PGDS蛋白表達(dá)比較 對照組大鼠海馬組織中L-PGDS蛋白相對表達(dá)量為0.172±0.007，觀察組建模后第1、3、7、14、30、60天大鼠海馬組織中L-PGDS蛋白相對表達(dá)量分別為0.190±0.004、0.195±0.003、0.231±0.010、0.322±0.010、0.417±0.006、0.454±0.009；觀察組隨著建模時間延長L-PGDS蛋白相對表達(dá)量增加(P均<0.05)，且各時點(diǎn)均高于對照組(P均<0.01)。

2.2 兩組大鼠海馬組織中L-PGDS的細(xì)胞定位情況比較 免疫熒光雙標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)，L-PGDS在對照組和模型組大鼠海馬組織的CA1區(qū)廣泛表達(dá)，并且與星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP和神經(jīng)元樹突特異性標(biāo)志物MAP-2均共表達(dá)，而與細(xì)胞核標(biāo)志物DAPI不共表達(dá)，提示L-PGDS主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元胞質(zhì)和突起處。進(jìn)一步用半定量分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，觀察組建模第60天大鼠海馬CA1區(qū)L-PGDS與GFAP和MAP2共表達(dá)陽性細(xì)胞百分比分別為28.9%±2.4%、75.1%±6.6%，明顯高于對照組的15.6%±0.7%、49.4%±4.8%(P均<0.01)。

3 討論

腦內(nèi)炎癥反應(yīng)是癲癇發(fā)生及發(fā)展的重要因素。前列腺素是刺激炎癥反應(yīng)發(fā)生的主要因素，而PGD2是前列腺素中主要炎癥介質(zhì)之一。研究表明，PGD2可以明顯增加癲癇發(fā)作和發(fā)生頻率，且可以顯著降低癲癇發(fā)作的閾值[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，L-PGDS在匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇大鼠海馬組織中表達(dá)升高，且隨時間延長其表達(dá)逐漸增加。進(jìn)一步使用免疫熒光技術(shù)檢測表明，L-PGDS在大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，并且在觀察組大鼠海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元表達(dá)L-PDGS較對照組明顯升高。以上結(jié)果均表明，L-PGDS與癲癇發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

到目前為止，通過對動物癲癇模型及癲癇患者的研究發(fā)現(xiàn)，癲癇的發(fā)生及發(fā)展與神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及血腦屏障功能變化相關(guān)[6,7]。目前，抗癲癇藥物(AEDs)的研究主要集中在離子通道、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、興奮/抑制性突觸傳遞等方面。然而，最近AEDs的抗炎作用備受關(guān)注。例如，卡馬西平和左乙拉西坦可減少培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)炎癥介質(zhì)，以提供神經(jīng)保護(hù)作用；通過對炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)，左乙拉西坦也可以使星形膠質(zhì)細(xì)胞的靜息膜電位升高，從而減弱其興奮性，同時左乙拉西坦通過抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生發(fā)揮抗驚厥作用[8,9]。

作為常見的炎性介質(zhì)，已知PGD2有L-PGDS和H-PGDS兩種合酶合成[10]。他們通過相關(guān)的受體而發(fā)揮作用[11]。有研究報導(dǎo)，前列腺素D1受體(DP1R)、DP2R有各自的cAMP產(chǎn)生，并各自與Gs和Gi蛋白結(jié)合[12]。啟動DP1R可減少鈣離子內(nèi)流，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。然而，啟動DP2R卻可以增加鈣離子內(nèi)流，產(chǎn)生鈣超載，加重細(xì)胞損害導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13,14]，而PGD2的總效應(yīng)則取決于細(xì)胞表達(dá)DP1和DP2的數(shù)量及細(xì)胞所處的病理狀態(tài)[15]。本實(shí)驗(yàn)中，L-PGDS在癲癇模型中表達(dá)異常升高，可能參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展過程；但L-PGDS是啟動DP1R還是DP2R目前尚不得而知，因此需進(jìn)一步的研究去證實(shí)L-PGDS在癲癇大鼠中的作用靶點(diǎn)，以明確其對癲癇是保護(hù)性作用還是損害作用。通過對L-PGDS的進(jìn)一步研究，使之有望成為臨床癲癇診斷的分子標(biāo)志物和新的AEDs的治療靶點(diǎn)。

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國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260201，81660227)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目[黔科合J字(2013)2327號]；省市合作項(xiàng)目-優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)項(xiàng)目[遵科合人(2014)10號]。

黃浩(E-mail: haohuang325@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.009

R742.1

A

1002-266X(2016)42-0032-03

2016-08-07)