人cyclin B1對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

高海濱，周劍云，王利清，王宇，孫煒

(中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院 首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京100068)

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人cyclin B1對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

高海濱，周劍云，王利清，王宇，孫煒

(中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院 首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京100068)

目的 探討人細(xì)胞周期素B1(cyclin B1)對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。方法 將體外培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG隨機分為high cyclin B1組、control cyclin B1組、cyclin B1 siRNA組、control siRNA組，high cyclin B1組、control cyclin B1組瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 cyclin B1及空載體，cyclin B1 siRNA組、control siRNA組瞬時轉(zhuǎn)染pGCsi-U6/Neo/GFP/sh cyclin B1及空載體。轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h時采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各組光密度(OD)值，轉(zhuǎn)染48 h時采用Transwell小室檢測侵襲及轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 培養(yǎng)24、48、72 h時high cyclin B1組OD值均高于control cyclin B1組(P均<0.05)，cyclin B1 siRNA組均低于control siRNA組(P均<0.05)。培養(yǎng)48、72 h時high cyclin B1組OD值均高于cyclin B1 siRNA組(P均<0.05)。high cyclin B1組培養(yǎng)48 h時侵襲及轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)均高于control cyclin B1組及cyclin B1 siRNA組(P均<0.05)，cyclin B1 siRNA組侵襲及轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)均低于control siRNA組(P均<0.05)。結(jié)論 cyclin B1可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤；細(xì)胞周期素B1；細(xì)胞增殖；侵襲；轉(zhuǎn)移

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，約占所有顱內(nèi)腫瘤的45%，其發(fā)病機制尚未明確[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期改變在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用[3～5]。生理狀態(tài)下，細(xì)胞周期素可調(diào)節(jié)正常的細(xì)胞周期進(jìn)程，但在惡性腫瘤患者或動物體內(nèi)其表達(dá)異常升高[6]。人細(xì)胞周期素B1(cyclin B1)是經(jīng)典的細(xì)胞分裂期周期蛋白，在細(xì)胞由G2期向M期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮重要作用[4]。Song等[4]研究發(fā)現(xiàn)，cyclin B1高表達(dá)與食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。但其與神經(jīng)膠質(zhì)瘤關(guān)系的報道較少。2014年12月～2015年6月，本研究觀察了cyclin B1對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫；cyclin B1購自美國Santa Cruz公司；LipfectimineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒及載體pcDNA3.1 cyclin B1、pGCsi-U6/Neo/GFP/sh cyclin B1均購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自北京樂博生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG置于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞融合90%～95%時，隨機分為high cyclin B1組、control cyclin B1組和cyclin B1 siRNA組、control siRNA組。high cyclin B1組、control cyclin B1組瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 cyclin B1及空載體，cyclin B1 siRNA組、control siRNA組瞬時轉(zhuǎn)染pGCsi-U6/Neo/GFP/sh cyclin B1及空載體。

1.3 細(xì)胞增殖檢測 將轉(zhuǎn)染24 h的各組細(xì)胞均按2 000個/孔接種于96孔板，每孔體積為200 μL，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)0、24、48、72 h時采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各組光密度(OD)值，以O(shè)D值反映細(xì)胞增殖情況。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲能力檢測 將轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞按1×105個/孔接種至Transwell小室，上室終體積為200 μL、下室終體積為800 μL，具體步驟參照試劑盒說明書。各組侵襲5 h，轉(zhuǎn)移4 h，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色5 min，正置顯微鏡下拍照，計數(shù)侵襲及轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖情況比較 見表1。

2.2 各組細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力比較 見表2。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度高、轉(zhuǎn)移速度快，患者預(yù)后本研究通過構(gòu)建cyclin B1高、低表達(dá)細(xì)胞株和空載對照細(xì)胞株，觀察了不同cyclin B1表達(dá)對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果表明，高表達(dá)cyclin B1的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力均強于低表達(dá)cyclin B1細(xì)胞，表明cyclin B1具有促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。細(xì)胞遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[14]。Song等[4]報道，cyclin B1可增加食管內(nèi)皮細(xì)胞和肺內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。Kang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，cyclin B1/CDC2復(fù)合物激活可導(dǎo)致細(xì)胞核Lamins和Vimentin磷酸化，參與重組細(xì)胞核骨架與細(xì)胞骨架之間的纖維網(wǎng)，促進(jìn)微細(xì)絲重組。由此推測，cyclin B1高表達(dá)可能通過改變神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞骨架，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞外滲，增加細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

表1 各組細(xì)胞增殖情況比較±s)

注：與control cyclin B1組同時間點比較，*P<0.05；與control siRNA組同時間點比較，△P<0.05；與cyclin B1 siRNA組比較，#P<0.05。

表2 各組培養(yǎng)48 h侵襲及轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)比較(個，±s)

注：與control cyclin B1組比較，*P<0.05；與control siRNA組比較，△P<0.05；與cyclin B1 siRNA組比較，#P<0.05。較差。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移與基因突變、細(xì)胞周期失調(diào)等密切相關(guān)。cyclin B1是細(xì)胞周期素cyclin B家族的一員，其基因由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成。在細(xì)胞周期S期、G2期cyclin B1表達(dá)逐漸升高，在G2晚期表達(dá)量達(dá)到峰值，激活CDC2激酶，形成cyclin B1/CDC2復(fù)合物，通過裂解一系列底物蛋白，使細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期，促進(jìn)細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期。cyclin B1/CDC2復(fù)合物是推動細(xì)胞從DNA合成向有絲分裂轉(zhuǎn)換的動力[7]。有絲分裂促進(jìn)因子(MPF)是精確調(diào)控有絲分裂的關(guān)鍵點，cyclin B1通過調(diào)節(jié)MPF活性而調(diào)節(jié)有絲分裂的起始和終止。cyclin B1合成、降解及亞細(xì)胞定位異常等均可導(dǎo)致MPF活性異常，引起細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞增殖異常，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生[8～11]。cyclin B1高表達(dá)可激活與其相關(guān)的CDC2激酶活性，取消G2/M期阻滯[5]，激活細(xì)胞有絲分裂，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8]。多種惡性腫瘤組織中可檢測到cyclin B1異常表達(dá)。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，非諾貝特可誘導(dǎo)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌G2/M期阻滯和調(diào)亡，降低CDK1/cyclin B1激酶復(fù)合物活性可能是其作用機制。Calvisi等[13]發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中cyclin B1表達(dá)增加，其表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

總之，cyclin B1高表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，但其作用機制有待進(jìn)一步探討。

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孫煒(E-mail: sunwei7777@126.com)

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R739.4

A

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2016-04-12)