水稻抗稻瘟病基因分子檢測(cè)及抗性評(píng)價(jià)

周 鵬，涂詩(shī)航，董瑞霞，王洪飛，鄭 軼，王志賦，張水金，游晴如，董練飛，黃庭旭，鄭家團(tuán)

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，福建 福州 350018)

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水稻抗稻瘟病基因分子檢測(cè)及抗性評(píng)價(jià)

周 鵬，涂詩(shī)航，董瑞霞，王洪飛，鄭 軼，王志賦，張水金，游晴如，董練飛，黃庭旭，鄭家團(tuán)*

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，福建 福州 350018)

為預(yù)防單一稻瘟病基因抗性容易喪失，培育持久性抗稻瘟病水稻新品種，本研究利用4份保持系、6份恢復(fù)系和3份常規(guī)稻品種為受體親本，以75-1-127(含有稻瘟病基因Pi9)和U19(含有抗稻瘟病基因Pi25)為供體親本，經(jīng)過多代選擇，獲得了48份田間高代材料。葉瘟抗性鑒定結(jié)果表明，48份高代株系材料中5份表現(xiàn)抗，25份表現(xiàn)為中抗，其余均表現(xiàn)為中感及以上。分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)果表明，19份高代株系含有抗稻瘟病基因Pi9，5份含有抗稻瘟病基因Pi25。

水稻；葉瘟；抗性；分子標(biāo)記

水稻是全球一半以上人口賴以生存的基本食糧，而中國(guó)是世界第一水稻生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)。21世紀(jì)以來，中國(guó)水稻種植面積無增長(zhǎng)，單產(chǎn)提高慢，總產(chǎn)量增長(zhǎng)少，近15年來僅增長(zhǎng)7.1%。目前，影響水稻生產(chǎn)的病害主要有3種，稻瘟病是其中之一，每年可造成10%～30%的損失，同時(shí)對(duì)稻米品質(zhì)也造成不良影響，對(duì)我國(guó)糧食安全生產(chǎn)造成了巨大的危害[1]。因此選育抗稻瘟病的雜交水稻新品種長(zhǎng)期以來是育種家的主要目標(biāo)之一。某一品種或抗病基因的大面積單一化應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致病稻瘟病菌某一特定優(yōu)勢(shì)小種群的形成和發(fā)展，最終導(dǎo)致稻瘟病的大面積暴發(fā)和流行[2]。福建省是稻瘟病發(fā)病較嚴(yán)重的地區(qū)，近年來，在參加福建省或全國(guó)南方水稻區(qū)試的品種中，抗性品種的比例很低，抗性差嚴(yán)重地影響了雜交稻組合的推廣應(yīng)用。鑒于稻瘟病的危害性，目前，福建省水稻品種審定對(duì)新育成品種的抗稻瘟病性實(shí)行一票否決，很多高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)雜交稻新品種因抗瘟性不達(dá)標(biāo)而不能通過品種審定[3]。

水稻抗稻瘟病基因Pi9來源于小粒野生稻，位于水稻6號(hào)染色體上[4]，對(duì)來自13個(gè)國(guó)家43個(gè)稻瘟病小種表現(xiàn)出很高的抗性[5]，是目前利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)改良稻瘟病抗性使用最廣泛的主效抗性基因之一。源自秈稻品種“谷梅2號(hào)”的抗稻瘟病主效基因Pi25[6]，位于水稻6號(hào)染色體上，對(duì)中國(guó)稻瘟病菌系92-183有較強(qiáng)的葉瘟和穗頸瘟抗性，近年來相繼報(bào)道了采用分子標(biāo)記技術(shù)將Pi25基因轉(zhuǎn)育到栽培稻中[7-10]。

本研究同時(shí)以含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻材料75-1-127和含有抗稻瘟病基因Pi25的中間材料U19為抗源選育雜交水稻恢復(fù)系和保持系，獲得了48份水稻高代新株系，通過在福建省上杭縣茶地鄉(xiāng)稻瘟病重發(fā)區(qū)進(jìn)行稻瘟病自然誘發(fā)鑒定，評(píng)價(jià)其稻瘟病抗性水平，同時(shí)通過分子標(biāo)記檢測(cè)探明其抗性基因來源，為以后配制抗病雜交水稻新品種及抗病新材料的創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)，也預(yù)防了單一抗性基因的抗性易喪失的風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以三系雜交水稻的4份保持系福稻B、福農(nóng)B、14B和元豐B，6份恢復(fù)系X5、X9、蜀恢527、明恢86、閩恢3301和內(nèi)恢9802，以及3份常規(guī)稻華航絲苗、繁9和勝巴絲苗為受體親本，以抗瘟材料75-1-127(含有稻瘟病抗性基因Pi9)和U19(由中國(guó)水稻研究所莊杰云提供，含有稻瘟病抗性基因Pi25)為抗源育成的48份水稻新品系為抗性鑒定材料；以2個(gè)供體親本為抗性對(duì)照，以廣陸矮4號(hào)為感病對(duì)照。

1.2 葉瘟田間自然誘發(fā)鑒定

2014-2015年，田間葉瘟自然誘發(fā)鑒定圃設(shè)在福建省上杭縣茶地鑒定圃進(jìn)行。每個(gè)品種播種1條，3個(gè)重復(fù)，5月26日播種，每條播種100粒，四周設(shè)誘發(fā)行，以廣陸矮4號(hào)為誘發(fā)品種。不噴施農(nóng)藥，施氮肥，施用量高于普通大田20%。

1.3 葉瘟的調(diào)查方法

出苗后30 d人工噴施菌液使充分發(fā)病。葉瘟的調(diào)查在開始出現(xiàn)病斑后10 ～15 d進(jìn)行，按0～9級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查病情，調(diào)查方法參照鄭軼等[11]的方法。在供試材料的2 a抗性水平中，以級(jí)數(shù)最高的為該材料的稻瘟病綜合抗性水平。

1.4 水稻基因組DNA的提取

采取出苗后20 d的鮮嫩葉片5 g，采用孫川等[12]的方法制備水稻基因組DNA。

1.5 抗病基因PCR檢測(cè)

抗性基因Pi9的檢測(cè)選用分子標(biāo)記pB8，抗性基因Pi25的檢測(cè)選用連鎖STS標(biāo)記Si13070D，由上海生物工程技術(shù)公司合成。抗性基因Pi9的檢測(cè)參照張薈等[13]的方法?？剐曰騊i25的檢測(cè)PCR反應(yīng)體系為10 μL，其中2×TaqPCR Master Mix混合酶5 μL，模板DNA 1 μL，10 μmol·L-1的引物各0.5 μL，加ddH20補(bǔ)足10 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃保存，產(chǎn)物通過6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔點(diǎn)樣1.6 μL，用GetRed核酸染料染色，用BIO-RAD Imaging System成像系統(tǒng)成像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 48份水稻新品系葉瘟抗性水平

對(duì)48份水稻新品系在田間自然誘發(fā)鑒定圃的葉瘟抗性鑒定結(jié)果表1，其中5份水稻新品系葉瘟抗性表現(xiàn)為2級(jí)，占10.42%；14份抗性表現(xiàn)為3級(jí)，占29.17%；11份抗性表現(xiàn)為4級(jí)，占22.92%；7份抗性表現(xiàn)為5級(jí)，占15.58%；5份抗性表現(xiàn)為6級(jí)，占10.42%；5份抗性表現(xiàn)為7級(jí)，占10.42%；1份抗性表現(xiàn)為9級(jí)，占2.08%。圖1顯示了部分材料和抗感對(duì)照田間發(fā)病情況，抗感株系在病區(qū)的抗感界限分明。

表1 48份水稻新品系葉瘟抗性水平

2.2 不同抗源來源的水稻新品系的抗性比較

2個(gè)不同抗源育成的后代株系的抗性比較結(jié)果見表2。以75-1-127為抗源育成了30個(gè)株系，其中抗性達(dá)到抗水平的3個(gè)，中抗水平的株系17個(gè)，中感及以上水平的株系10個(gè)，達(dá)到中抗以上水平的株系約占66.67%；以U19為抗源育成了10個(gè)株系，其中抗性達(dá)到中抗水平的6個(gè)，中感及以上水平的株系5個(gè)，達(dá)到中抗以上水平的株系約占54.55%；以雙抗源育成了7個(gè)株系，其中抗性達(dá)到抗水平的4個(gè)，中感水平的株系3個(gè)，達(dá)到中抗以上水平的株系約占57.14%。

表2 不同抗源來源的水稻新品系抗性比較

Table 2 Blast-resistance of new rice lines derived from different resistance donors

抗源不同抗性水平新品系數(shù)量/個(gè)抗(R)中抗(MR)中感(MS)感(S)高感(HS)合計(jì)/個(gè)中抗以上新品系所占比例/%75?1?127317271306667U1906230115455雙抗源4030075714

2.3 48份新品系的抗性基因的檢測(cè)分析

利用與Pi9基因緊密連鎖的分子標(biāo)記pB8對(duì)37份以75-1-127為抗源選育的高代株系材料進(jìn)行分子檢測(cè)，獲得19份含有抗性基因Pi9的株系(圖2)，其中保持系12份，恢復(fù)系7份。19份株系材料的田間編號(hào)是BC177、BC203、BC309、BC311、BC617、BC901、EB511、EB557、EB558、EB559、EB560、EB561、EDF66、EDF69、EDF75、EDF77、EDF78、EDF79、EDF82。

利用與Pi25基因緊密連鎖的分子標(biāo)記Si13070D進(jìn)行親本間的多態(tài)性分析，結(jié)果表明，抗性對(duì)照谷梅2號(hào)、抗源U19能擴(kuò)增出相同大小的單一條帶，與其他親本材料的擴(kuò)增條帶存在多態(tài)性(圖3)，結(jié)果清晰，因此可以選擇Si13070D標(biāo)記對(duì)高代材料進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)。對(duì)18份以U19為抗源選育的高代株系材料進(jìn)行分子檢測(cè)，獲得5份含有抗性基因Pi25的株系(圖4)，其中保持系材料3份，恢復(fù)系材料2份。5份株系的田間編號(hào)分別是BC153、BC623、BC801、EDF80、EDF81。

3 討論與結(jié)論

稻瘟病是世界性水稻最具毀滅性的病害之一。實(shí)踐證明，選育和種植抗病品種是控制該病害最經(jīng)濟(jì)有效的方法[14]。福建省是稻瘟病發(fā)生流行較嚴(yán)重的稻區(qū)之一，從1983年開展稻瘟病育種為中心的科技公關(guān)以來，育成了一大批水稻材料[15]。近10年以來，福建省共審定雜交水稻新品種168個(gè)，其中中抗以上品種24個(gè)，米質(zhì)達(dá)部頒三級(jí)及以上的品種5個(gè)(數(shù)據(jù)來源于國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心。http://www.ricedata.cn/variety/)。育種材料各世代的抗病性鑒定是抗性育種的重要環(huán)節(jié)，研究表明[16-17]，對(duì)大量品系采用病圃自然發(fā)病的方法，可從大量材料中篩選出抗源材料供育種使用。隨著育種技術(shù)綜合應(yīng)用的發(fā)展和育種水平的提高，超高產(chǎn)、強(qiáng)抗性雜交稻新品種的出世將為期不遠(yuǎn)。本課題組近幾年通過重病區(qū)抗性自然誘發(fā)鑒定、分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)篩選了近2萬份水稻育種材料及親本，獲得了一大批抗性優(yōu)異的材料，大大提高了育種效率，取得了良好的效果。相關(guān)分析結(jié)果表明[11,18]，頸瘟鑒定的平均級(jí)與葉瘟的最高級(jí)和平均級(jí)呈極顯著正相關(guān)，表明葉瘟與頸瘟相關(guān)非常密切，在苗期鑒定葉瘟發(fā)病重的組合，頸瘟發(fā)病也重。因此，為了減少工作量，本研究選擇在苗期對(duì)高代材料進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定，淘汰感病株系，重點(diǎn)選育抗病株系，達(dá)到事半功倍的效果。在本研究中，葉瘟抗性鑒定及分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果不相一致，含有Pi9抗性基因的BC311株系卻表現(xiàn)為感稻瘟病，其可能與遺傳背景及抗病基因的純合程度相關(guān)；表現(xiàn)為中抗的BC127、BC325、ERK42、ER537、ER538、ER558卻未檢測(cè)出抗稻瘟病基因，其可能遺傳了福農(nóng)B、華航絲苗的抗稻瘟病基因。探秘福農(nóng)B含有的稻瘟病基因是本課題組的下一步目標(biāo)。在以后的育種實(shí)踐中，應(yīng)該堅(jiān)持廣泛收集鑒定抗病資源，豐富品種的抗性遺傳背景，并長(zhǎng)期跟蹤抗性材料的抗性變化趨勢(shì)，通過抗源多元化來增加品種的抗病年限。

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(責(zé)任編輯：林海清)

Molecular Detection and Resistance Determination of Rice Blast-resistance Genes

ZHOU Peng,TU Shi-hang,DONG Rui-xia,WANG Hong-fei,ZHENG Yi,WANG Zhi-fu,ZHANG Shui-jin,YOU Qing-ru,DONG Lian-fei,HUANG Ting-xu,ZHENG Jia-tuan*

(InstituteofRice,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350018,China)

To avoid a possible loss of blast-resistance in rice when a single resistance gene was dependent upon for the disease prevention, new rice varieties with durable rice blast-resistance were cultivated. Forty-eight field materials of advanced-generation were obtained through a multiple-generation selection from the crosses using 4 maintainer lines, 6 restorer lines and 3 conventional rice varieties as receptor parents with 75-1-127 (harboring blast genePi9) and U19 (harboring blast resistance genePi25) as donor parents. Evaluated by their resistance to the leaf blast disease, 5 lines were classified as highly resistant, 25 moderately resistant, and the remainders moderately or highly susceptible varieties. A marker-assisted selection showed that, among them, 19 advanced-generation lines carried blast-resistance genePi9, and 5 had blast-resistance genePi25.

rice; leaf blast; blast-resistance; molecular marker

2016-03-11初稿；2016-05-18修改稿

周鵬(1988-)，男，碩士研究生，助理研究員，研究方向：水稻遺傳育種

*通訊作者：鄭家團(tuán)(1958-)，男，研究員，研究方向：水稻遺傳育種(E-mail:superrice63@163.com)

福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目——省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2015R1021-2)；國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA10A101)；福建省財(cái)政專項(xiàng)——福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(CXTD-2-1312)；福建省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)水稻產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(閩財(cái)指[2014]1032)；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年人才創(chuàng)新基金(2011QB-13)

Q 343

A

1008-0384(2016)09-962-04

周鵬，涂詩(shī)航，董瑞霞，等.水稻抗稻瘟病基因分子檢測(cè)及抗性評(píng)價(jià)[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31(9)：962-965.

ZHOU P，TU S-H，DONG R-X，et al.Molecular Detection and Resistance Determination of Rice Blast-resistance Genes[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(9)：962-965.