甘肅黃芪和紅芪總黃酮含量對(duì)比測(cè)定方法探索研究

葉迎 包強(qiáng) 王瑞海 柏冬 薛欣 張立石 劉麗梅

摘要：目的 探索建立甘肅黃芪和紅芪藥材中總黃酮含量對(duì)比的測(cè)定方法。方法 以毛蕊異黃酮苷等為對(duì)照品，采用紫外分光光度法和比色法（顯色劑：NaNO2-Al（NO3）3-NaOH、AlCl3、Mg（Ac）2、NaOH、磷鉬酸、鹽酸-鎂粉），考察樣品和對(duì)照品吸收曲線。結(jié)果 采用比色法，黃芪、紅芪樣品和對(duì)照品的最大吸收波長(zhǎng)不一致，峰形有差別或差別較大。采用紫外法測(cè)定，毛蕊異黃酮苷在Ⅱ帶260 nm處呈現(xiàn)特征肩峰吸收，黃芪和紅芪亦在Ⅱ帶呈現(xiàn)特征肩峰吸收，吸收波長(zhǎng)分別為263、265 nm，吸收波長(zhǎng)與對(duì)照品基本一致。結(jié)論 常用的顯色反應(yīng)不適合甘肅黃芪和紅芪中總黃酮含量的對(duì)比測(cè)定；異黃酮類化合物吸收Ⅱ帶作為特征吸收帶，適于黃芪和紅芪樣品中總黃酮含量的對(duì)比研究。

關(guān)鍵詞：黃芪；紅芪；總黃酮；紫外-可見(jiàn)分光光度法；比色法；含量測(cè)定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.024

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）09-0099-07

Study on Determination Method of Total Flavonoids in Gansu Astragali Radix and Hedysarum Polybotrys YE Ying1， BAO Qiang2， WANG Rui-hai1， BAI Dong1， XUE Xin1， ZHANG Li-shi1， LIU Li-mei1 （1. Institute of Basic Theory Research of TCM， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China； 2. Department of Pharmacy， Gansu Province Hospital of TCM， Lanzhou 730050， China）

Abstract： Objective To study the determination method of total flavonoids in Gansu Astragali Radix and Hedysarum Polybotrys. Methods Calycosin glycosides etc. was selected as reference substances， comparison on the difference of absorption curves was done by ultraviolet spectroscopy and colorimetric method （NaNO2-Al（NO3）3- NaOH， AlCl3， Mg（Ac）2， NaOH， phosphomolybdic acid， HCl-Mg power）. Results With colorimetric method， the maximum absorption wavelength of referrence and the test was inconsistent. The absorption peak shape was also different. With UV method， Calycosin glycosides in band Ⅱ （260 nm） showed a shoulder absorption. Astragali Radix and Hedysarum Polybotrys also showed characteristic shoulder absorptions in band Ⅱ with absorption wavelength at 263 nm and 265 nm. So the sample absorption wavelength is basically the same as that of the control sample. Conclusion Colorimetries usually used for determination of total flavonoids are not suitable for the comparison determination of Gansu Astragali Radix and Hedysarum Polybotrys. It is suitable for determining the contents of total flavonoids in samples by UV spectrophotometry at the band Ⅱ， which is the characteristic absorption band of isoflavone compound.

Key words： Astragali Radix； Hedysarum Polybotrys； total flavonoids； ultraviolet-visible spectrophotometry； colorimetric method； determination

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》；紅芪為豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的

基金項(xiàng)目：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)自主選題項(xiàng)目（YZ-1438）

通訊作者：劉麗梅，E-mail：liulimeihrb@sina.com

干燥根，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》黃芪項(xiàng)下，并列為上品。二者均具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、脫毒排膿、斂瘡生肌的功效[1]。黃芪和紅芪為同科異屬植物，傳統(tǒng)用藥時(shí)二者常混用并相互替代，以西北地區(qū)尤甚[2-3]。在歷代本草文獻(xiàn)中，黃芪項(xiàng)下的“赤水耆”“赤色者”即為西北地區(qū)應(yīng)用歷史悠久的紅芪，在我國(guó)西北、西南、港澳臺(tái)地區(qū)及東南亞一些地區(qū)至今仍有以紅芪用作黃芪替代品的習(xí)慣，認(rèn)為紅芪是黃芪的優(yōu)良品種[4]。《中華人民共和國(guó)藥典》1977年版將紅芪列為正品黃芪之一，1985年版開(kāi)始將兩者分開(kāi)，1995年版又將紅芪與膜莢黃芪、蒙古黃芪同列在黃芪項(xiàng)下[3，5]，而2005、2010、2015年版又將其分開(kāi)。張氏等[6]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同居群的黃芪和紅芪進(jìn)行相關(guān)分析表明紅芪和黃芪親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。“黃芪和紅芪不分”和“黃芪、紅芪為2種中藥”，以及“紅芪的品質(zhì)優(yōu)于黃芪”這些說(shuō)法的科學(xué)依據(jù)是什么？甘肅是黃芪和紅芪的道地產(chǎn)區(qū)，我們對(duì)甘肅黃芪和紅芪從化學(xué)成分表征、成分含量測(cè)定、體內(nèi)成分等多方面開(kāi)展對(duì)比研究。本研究探索建立進(jìn)行二者總黃酮含量對(duì)比的測(cè)定方法，從總黃酮含量分析討論該問(wèn)題。

黃酮類成分為黃芪和紅芪共有的有效成分，主要包括異黃酮、黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、查耳酮等，其中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素、芒柄花素苷4種成分均為異黃酮類，且含量較高[7-8]。目前，中藥總黃酮的含量測(cè)定方法主要有紫外-可見(jiàn)分光光度法、薄層色譜法等，前者廣泛用于中藥總黃酮成分的含量測(cè)定[9]。黃芪總黃酮含量測(cè)定多以蘆丁為對(duì)照品，采用鋁鹽比色法（NaNO2-Al（NO3）3-NaOH、AlCl3）在可見(jiàn)區(qū)進(jìn)行測(cè)定[10]，近幾年出現(xiàn)了采用毛蕊異黃酮苷為對(duì)照品在紫外區(qū)進(jìn)行測(cè)定的方法[11]。紅芪總黃酮含量測(cè)定報(bào)道較少，也是采用鋁鹽比色方法[12]。但是我們研究發(fā)現(xiàn)，采用鋁鹽進(jìn)行反應(yīng)，樣品在可見(jiàn)光區(qū)域未呈現(xiàn)吸收或者吸收值很弱，難以定量。鑒于黃芪和紅芪所含黃酮類成分不完全相同，采用何種對(duì)照品、何種方法測(cè)定含量更適宜，本試驗(yàn)對(duì)此開(kāi)展了探索研究，以期建立適合甘肅黃芪和紅芪總黃酮含量對(duì)比的測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

BT25S型電子天平（德國(guó)，賽多利斯），8453型紫外可見(jiàn)分光光度儀（美國(guó)，Agilent公司），DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），KQ-250型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

對(duì)照品毛蕊異黃酮苷（批號(hào)111920-201304）、芒柄花素（批號(hào)111703- 200603），中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品毛蕊異黃酮（批號(hào)PS13081501）、芒柄花苷（批號(hào)PS12051101），成都普思生物科技有限公司；對(duì)照品蘆?。ㄅ?hào)20141125），北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；黃芪、紅芪飲片，甘肅省宕昌縣六合中藥材合作社，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所胡世林教授鑒定，分別為蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao和多序巖黃芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的根；Al（NO3）3、NaNO2、AlCl3、Mg（Ac）2、磷鉬酸、鎂粉、甲醇、無(wú)水乙醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素和蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成含毛蕊異黃酮苷217 ?g/mL、毛蕊異黃酮212 ?g/mL、芒柄花苷231 ?g/mL、芒柄花素187 ?g/mL、蘆丁221 ?g/mL的對(duì)照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液的制備

稱取黃芪和紅芪粉末（過(guò)50目）各1.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密吸取70%乙醇45 mL，水浴回流3 h，趁熱過(guò)濾，濾液回收乙醇至干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，用水飽和正丁醇萃取4次，每次10 mL，合并正丁醇液，減壓回收溶劑，殘?jiān)眉状既芙獠⒁浦?0 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得含生藥濃度為150 mg/mL的黃芪、紅芪供試品溶液。

2.3 總黃酮含量測(cè)定

2.3.1 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法 分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液毛蕊異黃酮苷1.5 mL、毛蕊異黃酮3.0 mL、芒柄花素苷1.0 mL、芒柄花素1.0 mL、蘆丁1.0 mL和“2.2”項(xiàng)下黃芪和紅芪供試品溶液各1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，精密加入蒸餾水使至6 mL，然后精密加入5%NaNO2 1.0 mL，搖勻，放置6 min，再精密加入10%Al（NO3）3 1.0 mL，搖勻，放置6 min，再精密加入4%NaOH 10 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻（其中毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、蘆丁濃度分別為13.02、25.44、9.24、7.48、8.84 ?g/mL，黃芪、紅芪原藥材濃度均為6.0 mg/mL），放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，在200～900 nm進(jìn)行掃描[10]，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色后，黃芪和紅芪的λmax分別為398 nm和394 nm，與蘆丁λmax（510 nm）及其他4個(gè)對(duì)照品溶液吸收光譜λmax不同，且光譜峰形相差較大。

2.3.2 AlCl3比色法 分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液毛蕊異黃酮苷0.25 mL、蘆丁0.5 mL和“2.2”項(xiàng)下黃芪和紅芪供試品溶液各0.5 mL，置于10 mL容量瓶中，以甲醇補(bǔ)足至5.0 mL，搖勻，再精密加入1%AlCl3溶液4 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻（其中毛蕊異黃酮苷、蘆丁濃度分別為5.43、11.05 ?g/mL，黃芪、紅芪原藥材濃度均為7.5 mg/mL）放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，在波長(zhǎng)200～900 nm進(jìn)行掃描[13]，結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)，AlCl3顯色后供試品溶液在400 nm左右未見(jiàn)吸收，毛蕊異黃酮苷在相應(yīng)波長(zhǎng)處也沒(méi)有吸收峰出現(xiàn)，蘆丁的λmax在369 nm，但是峰形與毛蕊異黃酮苷對(duì)照品峰形不一致。

圖2 AlCl3比色法吸收曲線

2.4 總異黃酮含量測(cè)定

2.4.1 NaOH比色法 分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液毛蕊異黃酮苷1.0 mL、毛蕊異黃酮1.0 mL、芒柄花苷1.0 mL、芒柄花素1.0 mL、蘆丁1.5 mL，置于25 mL量瓶中，精密加入0.01 moL/L NaOH溶液20.0 mL；精密吸取“2.2”項(xiàng)下黃芪和紅芪供試品溶液0.8 mL，置于10 mL容量瓶中。均用0.01 moL/L NaOH溶液定容至刻度，搖勻（其中毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、蘆丁濃度分別為8.68、8.48、9.24、7.48、13.26 ?g/mL，黃芪、紅芪原藥材濃度均為12.0 mg/mL），70 ℃水浴加熱 15 min，冷卻至室溫，以相應(yīng)試劑為空白，在200～900 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[14]，結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)，NaOH作用后毛蕊異黃酮苷和蘆丁的λmax分別為291 nm和360 nm，黃芪和紅芪的λmax分別為277 nm和271 nm，供試品和其他對(duì)照品峰形相差較大， λmax也不一致。

2.4.2 磷鉬酸比色法 分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下毛蕊異黃酮苷對(duì)照品0.5 mL、“2.2”項(xiàng)下黃芪和紅芪供試品溶液各0.25 mL，置于25 mL容量瓶中，以70%乙醇補(bǔ)足至3.0 mL，搖勻，精密加入硼砂-碳酸鈉緩沖液10 mL，搖勻，再精密加入磷鉬酸溶液1.3 mL，搖勻，室溫放置5 min，精密加入NaOH試液0.2 mL，搖勻，于65 ℃水浴加熱5 min，取出，放冷至室溫，精密加入70%乙醇至刻度，搖勻（其中毛蕊異黃酮苷濃度為4.34 ?g/mL，黃芪、紅芪供試品原藥材濃度均為1.5 mg/mL），以相應(yīng)的試劑為空白，在波長(zhǎng)200～900 nm進(jìn)行掃描[15]，結(jié)果見(jiàn)圖4。可見(jiàn)，磷鉬酸作用后毛蕊異黃酮苷λmax為313 nm，黃芪和紅芪λmax分別為279 nm和280 nm，且存在較強(qiáng)的背景吸收干擾，對(duì)照品和樣品λmax不一致。

2.4.3 紫外分光光度法 精密吸取“2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品和“2.2”項(xiàng)下供試品適量，甲醇稀釋后，在波長(zhǎng)200～900 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果見(jiàn)圖5?？梢?jiàn)，毛蕊異黃酮苷在紫外區(qū)λmax為260 nm，毛蕊異黃酮λmax為248 nm，芒柄花苷λmax為260 nm，芒柄花素λmax為249 nm，供試品黃芪和紅芪的λmax分別為263 nm和265 nm，呈肩峰吸收。毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷與供試品峰形基本一致，并且結(jié)果顯示樣品中毛蕊異黃酮苷的含量高于芒柄花苷。

2.5 黃酮、黃酮醇、異黃酮含量測(cè)定通用方法

2.5.1 醋酸鎂甲醇比色法 精密吸取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品毛蕊異黃酮苷0.25 mL、毛蕊異黃酮0.25 mL、芒柄花素苷0.25 mL、芒柄花素0.25 mL、蘆丁0.5 mL，“2.2”項(xiàng)下紅芪、黃芪供試品溶液各0.10 mL，置10 mL具塞刻度試管中，水浴揮干溶劑，精密加入1% Mg（Ac）2甲醇溶液至刻度，搖勻（其中毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、蘆丁分別為5.43、5.30、5.78、4.68、11.05 ?g/mL，黃芪、紅芪原藥材濃度均為1.5 mg/mL），放置15 min，在波長(zhǎng)200～900 nm進(jìn)行掃描[16]，結(jié)果見(jiàn)圖6?？梢?jiàn)，黃芪和紅芪的吸收?qǐng)D譜未見(jiàn)明顯吸收，各個(gè)對(duì)照品與供試品的λmax不一致，峰形相差很大。

2.5.2 鹽酸-鎂粉比色法 精密吸取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品毛蕊異黃酮苷0.10 mL，“2.2”項(xiàng)下供試品溶液經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋后黃芪和紅芪樣品溶液分別各取0.10 mL和0.05 mL，置含有300 mg鎂粉的具塞刻度試管中，將試管置于15～16 ℃水浴，緩慢滴加鹽酸4 mL，不時(shí)振搖試管，滴畢，搖勻，再精密加入70%乙醇至體積為10 mL，搖勻，置沸水浴中60 min，取出，冰浴迅速冷卻，搖勻，在波長(zhǎng)200～900 nm進(jìn)行掃描[17]，結(jié)果見(jiàn)圖7?？梢?jiàn)，鹽酸-鎂粉作用后毛蕊異黃酮苷λmax為328 nm，黃芪和紅芪的λmax分別為339 nm和341 nm，吸收波長(zhǎng)接近，但黃芪、紅芪樣品的峰形和對(duì)照品不一致。

3 討論

3.1 采用比色法開(kāi)展黃芪、紅芪總黃酮含量對(duì)比的探討

黃芪和紅芪中所含的黃酮化合物類型主要包括黃酮、異黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、查耳酮等[7]，進(jìn)行含有多種類型結(jié)構(gòu)的總黃酮含量的對(duì)比，除了要求2個(gè)供試品采用的顯色劑、測(cè)定波長(zhǎng)統(tǒng)一外，還要和對(duì)照品的測(cè)定條件一致。為此，本試驗(yàn)根據(jù)各種類型黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征的不同，選擇多種試劑與黃芪和紅芪供試品作用顯色，篩選適于二者總黃酮含量測(cè)定的方法。

3.1.1 金屬鹽類試劑 黃酮類化合物分子中一般具有3，5-酚羥基、4-羰基或3'，4'-鄰二酚羥基的結(jié)構(gòu)，可以和鋁鹽、鋯鹽、鍶鹽等離子反應(yīng)，多生成有色的金屬絡(luò)合物，可用于定性和定量分析，常用的試劑為1%AlCl3或Al（NO3）3[18]。Al（NO3）3比色法是藥典最常用的總黃酮含量測(cè)定的顯色劑，在堿性條件下，其與黃酮類化合物絡(luò)合形成紅色螯合物，使吸收峰帶Ⅱ紅移，以蘆丁為對(duì)照品，在510 nm左右呈現(xiàn)吸收[9]。AlCl3比色法與Al（NO3）3比色法類似，是在非堿性條件下絡(luò)合顯色，生成黃色絡(luò)合物進(jìn)行含量測(cè)定。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Al（NO3）3與黃芪和紅芪樣品進(jìn)行顯色后，吸收峰帶Ⅱ的確發(fā)生紅移，與蘆丁出現(xiàn)的吸收不同（510 nm），而是在390 nm左右出現(xiàn)吸收，且顯色后供試品溶液不穩(wěn)定，吸光度隨時(shí)間延長(zhǎng)呈降低的趨勢(shì)。其原因可能是供試品中所含的黃酮類成分較少，或雜質(zhì)干擾，和Al3+未能形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素對(duì)照品與Al3+顯色反應(yīng)，對(duì)照品與供試品峰形有差異或差異很大，最大吸收波長(zhǎng)不一致。文獻(xiàn)報(bào)道AlCl3顯色反應(yīng)發(fā)生在3-羥基、4-羰基和鄰二酚羥基上，只存在5-羥基、4-羰基的黃酮類物質(zhì)與AlCl3也不發(fā)生反應(yīng)[19-20]。黃芪和紅芪中的黃酮成分主要為異黃酮，沒(méi)有3-羥基、5-羥基的結(jié)構(gòu)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)不能滿足上述顯色反應(yīng)的要求，本試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

3.1.2 NaOH比色法 鮑氏等[14]以染料木素為對(duì)照品，采用0.01 moL/L NaOH進(jìn)行反應(yīng)，在266 nm處測(cè)定海南木蓮葉和枝總異黃酮含量。本試驗(yàn)中，對(duì)照品和供試品與NaOH作用后，吸收峰發(fā)生了紅移但不明顯，吸收?qǐng)D譜峰形不吻合，且二者最大吸收波長(zhǎng)也有差異。

3.1.3 磷鉬酸比色法 吳氏等[15]在硼砂-碳酸鈉緩沖液的堿性條件下，以磷鉬酸為顯色劑，在紫外區(qū)的268 nm處測(cè)定參芪潤(rùn)肺顆粒中總異黃酮。本試驗(yàn)采用該方法，對(duì)照品和供試品吸收?qǐng)D譜背景吸收強(qiáng)烈，吸收波長(zhǎng)不一致。

3.1.4 醋酸鎂甲醇比色法 醋酸鎂甲醇溶液是黃酮類成分金屬鹽類絡(luò)合反應(yīng)試劑之一[21]。參照李氏等[16]測(cè)定大黃配方顆粒中總蒽醌的含量的方法（以1.0%醋酸鎂甲醇溶液為顯色劑），本試驗(yàn)中樣品與醋酸鎂甲醇溶液作用后，峰形變化不大，未見(jiàn)明顯的吸收。

3.1.5 鹽酸-鎂粉比色法 黃酮、黃酮醇、二氫黃酮醇均易在鹽酸鎂粉作用下被還原，生成橙色到紅紫色物質(zhì)，在可見(jiàn)光區(qū)進(jìn)行含量測(cè)定。劉氏等[17]以鹽酸-鎂粉為顯色劑，進(jìn)行苦參湯有效部位總黃酮含量測(cè)定。本試驗(yàn)用該法測(cè)定的紅芪樣品中總黃酮含量為1.27%，為黃芪中總黃酮含量的5.5倍，原因可能是紅芪中含有如3-羥基-9-甲氧基香豆苯醚、3，9-二羥基香豆苯醚等香豆素類[22]成分與顯色劑反應(yīng)，導(dǎo)致其含量偏高。

3.2 黃芪和紅芪總黃酮含量測(cè)定方法、對(duì)照品、測(cè)定波長(zhǎng)的確定

黃酮類化合物因?yàn)榉肿又写嬖诠鹌；?、苯甲酰基組成的共軛體系，故其甲醇溶液在200～400 nm區(qū)域存在2個(gè)主要吸收帶，分別為峰帶Ⅰ（300～400 nm）及峰帶Ⅱ（220～280 nm），不同類型的黃酮在帶Ⅰ和帶Ⅱ的吸收強(qiáng)度不同[21，23]。異黃酮、二氫黃酮及二氫黃酮醇這3類化合物中，除有由A-苯甲酰系統(tǒng)引起的帶Ⅱ吸收（主峰）外，因B-環(huán)均不與吡喃環(huán)上的羥基共軛（或共軛很小），故帶Ⅰ很弱，常在主峰的長(zhǎng)波方向顯一肩峰[21]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪和紅芪中含量占總黃酮絕大部分的4種成分（毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素苷、芒柄花素）[8]的對(duì)照品及甘肅黃芪和紅芪中總黃酮的甲醇溶液紫外吸收光譜符合“在帶Ⅱ的260 nm左右呈現(xiàn)肩峰吸收”這一規(guī)律，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花葡萄糖苷、芒柄花素對(duì)照品λmax分別為260、248、260、249 nm，黃芪、紅芪樣品λmax分別為263、265 nm，樣品λmax與對(duì)照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花葡萄糖苷的λmax基本一致，考慮到濃度相近的情況下毛蕊異黃酮葡萄糖苷吸光度（0.615 18）明顯大于芒柄花葡萄糖苷吸光度（0.316 12），說(shuō)明毛蕊異黃酮葡萄糖苷在此波長(zhǎng)下吸收更強(qiáng)，故選擇其為含量測(cè)定對(duì)照品。因?yàn)辄S芪和紅芪樣品總黃酮中含有多種類型的黃酮成分，并且含有一定的雜質(zhì)，所以樣品最大吸收波長(zhǎng)與對(duì)照品略有偏差。由于對(duì)照品λmax（260 nm）和樣品λmax（263、265 nm）處吸光度值偏差小于0.009 AU和0.003 AU，所以確定260 nm為樣品測(cè)定波長(zhǎng)。該方法可為對(duì)比甘肅不同產(chǎn)地紅芪和黃芪中總黃酮含量奠定基礎(chǔ)。

3.3 黃芪和紅芪總黃酮含量測(cè)定前處理方法的確定

本試驗(yàn)中對(duì)樣品提取方法（回流、超聲）、純化方法（正丁醇、乙酸乙酯萃取）、提取溶劑（70%乙醇、甲醇）、提取時(shí)間（1、2、3 h）、溶劑用量（15、25、35 mL）進(jìn)行了篩選。結(jié)果顯示：黃芪、紅芪總黃酮含量采用回流提取優(yōu)于超聲提取，采用正丁醇萃取優(yōu)于乙酸乙酯萃取（見(jiàn)表1）；采用70%乙醇提取略優(yōu)于甲醇提?。ㄒ?jiàn)表2）；提取時(shí)間3 h和4 h含量相差不大，選擇提取3 h（見(jiàn)表3）；提取溶劑用量25、35 mL含量相當(dāng)，均高于15 mL，選擇25 mL溶劑提取（見(jiàn)表4）。

3.4 小結(jié)

本研究對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的總黃酮含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，比色法并不適用于黃芪和紅芪中總黃酮含量對(duì)比的測(cè)定。近年來(lái)有采用紫外分光光度法，以蘆丁或毛蕊異黃酮苷為對(duì)照品，在250～287 nm之間測(cè)定黃芪中總黃酮含量的報(bào)道[11，24-25]。本研究結(jié)果顯示，與比色法相比，采用紫外分光光度法更適合于紅芪和黃芪總黃酮含量的測(cè)定。

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