豬溶菌酶在大腸桿菌中的表達(dá)及其復(fù)性

朱德偉，蔡國(guó)林，陸健

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

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豬溶菌酶在大腸桿菌中的表達(dá)及其復(fù)性

朱德偉，蔡國(guó)林，陸健*

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

作為C型溶菌酶的一種，豬溶菌酶(Susscrofalysozyme,SSL)是豬體內(nèi)抵抗外源性疾病的一道重要屏障。鑒于豬在畜牧行業(yè)中的重要地位，尤其是在飼用抗生素的使用嚴(yán)重受限的今天，SSL的生產(chǎn)顯得尤為迫切。化學(xué)合成得到了SSL的編碼基因，通過(guò)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切之后與載體pET-28a(+)連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。在25 ℃、200 r/min條件下，利用0.1 mmol/L的 IPTG誘導(dǎo)8 h，離心發(fā)酵液獲得菌體。對(duì)其進(jìn)行超聲破碎獲得重組蛋白包涵體，然后對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性，最終獲得了具有生物活性的目的蛋白，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)以及抗菌活性進(jìn)行了研究。超聲破碎后獲得了181. 05 mg/L的重組蛋白包涵體，對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性后，比酶活力可達(dá)8 032. 78 U/mg，其最適溫度為35 ℃，最適pH為6.0，與其理論值基本一致，而其抗菌活性與標(biāo)準(zhǔn)品溶菌酶的作用效果也比較類似，為其規(guī)?；a(chǎn)與進(jìn)一步應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

豬溶菌酶；大腸桿菌；包涵體；復(fù)性

隨著健康養(yǎng)殖理念的倡導(dǎo)以及人們對(duì)食品安全要求的日益提高，飼用抗生素的使用受到了越來(lái)越嚴(yán)格的限制，尋求安全高效的抗生素替代品已經(jīng)刻不容緩。作為一種天然鹽基堿性蛋白質(zhì)，溶菌酶被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生物工程以及飼料等領(lǐng)域[1]。作為C型溶菌酶的一種，豬溶菌酶(Susscrofalysozyme，SSL)是豬體內(nèi)抵抗外源性疾病的一道重要屏障[2-3]。而鑒于豬在畜牧行業(yè)中的重要地位，尤其是在飼用抗生素的使用嚴(yán)重受限的今天，SSL必然存在極為廣闊的市場(chǎng)前景。

然而由于來(lái)源受限，目前SSL應(yīng)用的報(bào)道還不多見(jiàn)。溶菌酶的生產(chǎn)可分為3類：直接從動(dòng)植物組織器官提取[4-5]，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物生產(chǎn)[6-7]以及微生物發(fā)酵[8-10]。天然提取雖然簡(jiǎn)便易行，但是效率較低，且不易規(guī)模化生產(chǎn)；轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物雖然可以把溶菌酶的提取與高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)有機(jī)結(jié)合，但是后續(xù)分離成本較高，且不能連續(xù)化生產(chǎn)；發(fā)酵生產(chǎn)不僅可以克服原材料限制的缺陷，且能夠規(guī)?；B續(xù)生產(chǎn)，將成為未來(lái)溶菌酶生產(chǎn)的主要方式。

本研究化學(xué)合成了SSL的編碼基因，通過(guò)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切之后與載體pET-28a(+)連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾能力較差，一般表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在。因此，本研究對(duì)得到的溶菌酶產(chǎn)品進(jìn)行了進(jìn)一步的復(fù)性，以獲得具有生物活性的SSL產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

克隆宿主E.coliJM109，由本實(shí)驗(yàn)室保藏；克隆載體pPICZA和pMD19-T，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；表達(dá)載體pET-28a(+)，由本實(shí)驗(yàn)室保藏；表達(dá)宿主BL21(DE3)，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。測(cè)試菌種E.coli(ATCC 25922),Staphylococcusaureus(ATCC 25923),Klebsiellapneumoniae(CMCC(B) 46117),Pseudomonasaeruginosa(ATCC 15442) 以及Salmonellaenteritidis(CMCC(B) 50335)，購(gòu)自無(wú)錫賽維貿(mào)易有限公司；Micrococcusluteus，購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；Bacillussubtilis(Wild Strain, WS)，Bacillusamyloliquefaciens(Wild Strain, WS)由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；BamH Ⅰ和Hind Ⅲ內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，ExTaqDNA聚合酶，購(gòu)自大連寶生物公司(Takara)；PCR試劑，質(zhì)粒抽提試劑盒，膠回收試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；酵母提取物與胰蛋白胨，購(gòu)自O(shè)xiod公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)有限公司。LB培養(yǎng)基(g/L)，酵母提取物 5，胰蛋白胨 10， NaCl 10，瓊脂 20(固體培養(yǎng)基)，自然pH，121 ℃滅菌20 min。TSB培養(yǎng)基(g/L)，胰蛋白胨 15，大豆蛋白胨 5，NaCl 5，pH為7.2 ± 0.2，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器、設(shè)備

SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Mastercycler pro PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司；瓊脂糖凝膠電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司；H1850R離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JY 92-11超聲波細(xì)胞粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；XB70制冰機(jī)，寧波格蘭特制冷設(shè)備制造有限公司；BCD-265CMX 冰箱，合肥美的榮事達(dá)冰箱有限公司；小型垂直電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司；JD-801凝膠成像儀，江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司；XMTD-8222恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GI54DWS自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；FE20精密pH計(jì)，Mettler Toledo公司；EL204 電子分析天平，Mettler Toledo公司；UV-2100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，龍尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的合成

根據(jù)NCBI的報(bào)道，將SSL的原始編碼基因(NCBI-ID: 1174173)序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。在該片段兩端分別加有KpnⅠ&NotⅠ內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，經(jīng)雙酶切后與克隆載體pPICZA連接，重組質(zhì)粒標(biāo)記為pPICZA-SSL。

1.2.2 目的基因片段的擴(kuò)增與驗(yàn)證

根據(jù)pPICZA-SSL的基因序列設(shè)計(jì)并合成了擴(kuò)增引物(見(jiàn)表1)，用于目的基因的擴(kuò)增，在引物的兩端引入了BamHⅠ和HindⅢ內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。以重組質(zhì)粒為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)后72 ℃繼續(xù)延伸10 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物并割膠回收。膠回收具體操作參照試劑盒說(shuō)明。將回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，送樣至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

表1 引物序列

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

將含有質(zhì)粒pMD19-T-SSL的重組大腸桿菌液接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，用抽提試劑盒提取質(zhì)粒，具體操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。質(zhì)粒pET-28a(+)和質(zhì)粒pMD19-T-SSL用BamHⅠ和HindⅢ內(nèi)切酶處理之后于16 ℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，菌液涂布于含50 μg/mL Kan的LB固體培養(yǎng)基。陽(yáng)性克隆經(jīng)菌落PCR鑒定后，提取重組菌中的質(zhì)粒，熱激法轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞中，將細(xì)胞重懸后涂布于含50 μg/mL Kan的LB固體培養(yǎng)基。提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行PCR鑒定，之后將PCR產(chǎn)物送樣至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。并對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ的雙酶切鑒定。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

挑選陽(yáng)性克隆于LB(含50 μg/mL Kan)固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24 h，挑選單菌落接種至含3 mL LB培養(yǎng)基的小試管中37 ℃ 200 r/min中，培養(yǎng)過(guò)夜(約16 h)。取300 μL培養(yǎng)液(1%接種量)于30 mL含卡那霉素(加15 μL，終質(zhì)量濃度為50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，生長(zhǎng)過(guò)程中無(wú)菌條件下測(cè)OD600值至0.6(約2.5 h)。然后在培養(yǎng)物中添加IPTG(終濃度為0.1 mmol/L，即30 mL樣品中加入30 μL、100 mmol/L的IPTG)，25 ℃、200 r/min繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)8 h。

1.2.5 包涵體復(fù)性

將發(fā)酵液在10 000 r/min條件下離心5 min，棄上清，用50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)重懸洗滌菌體，之后進(jìn)行超聲波破碎(300 W工作20 min，2 s/2 s)。12 000 r/min離心10 min后棄上清，得到的沉淀即為重組蛋白的包涵體。

包涵體的洗滌、裂解與復(fù)性過(guò)程參照文獻(xiàn)的方法[11]。用洗滌液(50 mmol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，2 mol/L尿素，pH 8.0)洗滌，加入適量裂解液50 mmol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素，pH 8.0)裂解。用復(fù)性緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，1 mol/L尿素，0.5 mol/L L-Arg，2 mmol/L GSH，0.5 mmol/L GSSG，pH 8.0)復(fù)性后透析(50 mmol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0)。利用截留分子質(zhì)量為30 000 Da的超濾管對(duì)蛋白液進(jìn)行進(jìn)一步純化，然后對(duì)純化后的溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，利用捷達(dá)凝膠成像系統(tǒng)軟件對(duì)SDS-PAGE的條帶進(jìn)行分析；并用BRADFORD[12]法測(cè)定純化后的蛋白濃度。

1.2.6 SSL的酶活力的測(cè)定

SSL活力的測(cè)定參考MINAGAWAET[13]的方法，原理是溶菌酶降解細(xì)胞壁之后菌液的濁度會(huì)下降，根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)濁度的降低程度來(lái)表征酶活力的大小。1 mL的測(cè)試菌液M.lysodeikticus(0.2 mg/mL溶于50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，pH 6.2)與0.2 mL的酶液混勻，25 ℃條件下分別測(cè)定0.5 min和4.5 min時(shí)450 nm處的吸光度。酶活力定義為：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)(1 min)使得溶壁微球菌溶液的吸光度降低0.001所需要的酶量。測(cè)定進(jìn)行3次，結(jié)果以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

1.2.7 SSL的酶學(xué)性質(zhì)

根據(jù)1.2.6中的酶活力測(cè)定方法，SSL的最適作用溫度測(cè)定時(shí)其他條件不變，把測(cè)定溫度分別設(shè)為15、20、25、30、35、40、45、50、60、70和80 ℃，而熱穩(wěn)定性的測(cè)定則是分別將溶菌酶溶液在以上溫度條件下保溫30 min后測(cè)定其保留的酶活力占初始酶活力的百分比。而最適作用pH則是在最適作用溫度條件下，將磷酸鹽緩沖液換成同濃度下的不同pH緩沖液，而pH穩(wěn)定性則是將溶菌酶在不同的pH緩沖液中處理30 min后測(cè)定其保留的酶活力占初始酶活力的百分比。其中用到的緩沖液有：乙酸鈉緩沖液(pH 3.5～5.5)，磷酸鹽緩沖液(pH 6.0～8.0)，Tris-HCl緩沖液(pH 8.5～9.0)。

1.2.8 SSL的抑菌活性測(cè)定

重組SSL的抑菌活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行。測(cè)試菌經(jīng)過(guò)二級(jí)活化之后，以1%的接種量接種至含30 mL TSB培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)至OD600為0.6，取0.2 mL菌液與0.4 mL TSB培養(yǎng)基混合后加入0.2 mL含有SSL(溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照)的PBS(0.05 mol/L，pH 7.0)緩沖液混勻，使SSL(或標(biāo)準(zhǔn)品)的終濃度為8.3×10-7mol/L?；旌象w系于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)2 h后，稀釋涂布至TSB平板上，待長(zhǎng)出菌落后進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算抑菌系數(shù)lgN0/N1，其中N0是指空白組的菌落數(shù)，即只加PBS溶液；N1是實(shí)驗(yàn)組(或?qū)φ战M)的菌落數(shù)。測(cè)定時(shí)設(shè)3組平行，結(jié)果以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的結(jié)果進(jìn)行T檢驗(yàn)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSL目的基因與重組表達(dá)載體的雙酶切驗(yàn)證

以SSL-F和SSL-R為引物，質(zhì)粒pPICZA-SSL為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。得到的PCR產(chǎn)物條帶大小約為400 bp，與實(shí)際基因片段大小(414 bp)相符。割膠回收后，與pMD19-T載體連接，送樣測(cè)序(生工生物工程(上海)股份有限公司)后證明目的基因正確合成，且酶切位點(diǎn)引入正確。質(zhì)粒pET-28a(+)和質(zhì)粒pMD19-T-SSL用BamHⅠ和HindⅢ內(nèi)切酶處理之后進(jìn)行連接，對(duì)含有Kan的培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。提取陽(yáng)性克隆菌株的質(zhì)粒DNA，進(jìn)行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖1所示。pET-28a(+)和目的基因的大小與理論值一致，且經(jīng)過(guò)測(cè)序后確認(rèn)，重組表達(dá)載體pET-28a(+)-SSL構(gòu)建成功。將表達(dá)載體pET-28a(+)-SSL熱激法轉(zhuǎn)化至宿主BL21(DE3)中，經(jīng)PCR鑒定及測(cè)序驗(yàn)證，表達(dá)宿主構(gòu)建成功，命名為BL21(DE3)-pET28a(+)-SSL。

M-Marker；1，2，3-陽(yáng)性重組子的菌落PCR結(jié)果；4，5，6-重組表達(dá)載體pET-28a(+)-SSL的雙酶切圖譜圖1 目的基因SSL的PCR鑒定及表達(dá)載體pET-28a(+)-SSL的雙酶切(BamHⅠ和HindⅢ)驗(yàn)證Fig.1 The PCR identification of target gene SSL and the double enzyme (BamHⅠ and HindⅢ) digestion of expression vector pET-28a(+)-SSL

2.2 重組宿主BL21(DE3)-pET28a(+)-SSL的誘導(dǎo)表達(dá)

對(duì)得到的宿主BL21(DE3)-pET28a(+)-SSL進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)時(shí)得到的表達(dá)產(chǎn)物濃度與高濃度的IPTG誘導(dǎo)時(shí)差別不大，而明顯高于更低濃度的IPTG獲得的產(chǎn)物濃度。在25 ℃條件下誘導(dǎo)較30 ℃或37 ℃條件下可以獲得更高的表達(dá)量，低溫條件下(20 ℃)盡管可以獲得同樣濃度的表達(dá)產(chǎn)物(181. 05 mg/L)，但是耗時(shí)更長(zhǎng)(16 h)，而且破碎液的上清中也存在部分的蛋白，但是沒(méi)有酶活力，同樣需要復(fù)性(數(shù)據(jù)未顯示)。為了簡(jiǎn)化復(fù)性的過(guò)程，最終選擇的誘導(dǎo)條件是在0.1 mmol/L的IPTG條件下25 ℃誘導(dǎo)8 h。

從圖2中可以看到，細(xì)胞破碎后的上清中基本都是雜蛋白，沒(méi)有目的蛋白的條帶。而在破碎后的沉淀中大部分的蛋白都是目的蛋白，只有少量的雜質(zhì)。目的蛋白是以包涵體的形式存在，這是因?yàn)槟康牡鞍缀铣伤俣忍?，而由于宿主?xì)胞缺乏必要的酶系，來(lái)不及也沒(méi)有辦法對(duì)重組蛋白進(jìn)行正確折疊，才會(huì)造成在細(xì)胞中大量的積累[15]。本研究中得到的重組表達(dá)蛋白包涵體的質(zhì)量濃度為181. 05 mg/L(如圖2泳道2所示)。圖2中得到的目的蛋白分子量在18 kDa左右，較理論值14.7 kDa高了約3 kDa，主要原因是在HindⅢ酶切位點(diǎn)之后還有NotⅠ、XhoⅠ以及His-tag的組氨酸標(biāo)簽。His-tag的存在會(huì)增加重組蛋白的大小，此外它還會(huì)對(duì)天然蛋白在SDS-PAGE中的遷移造成阻礙，從而影響最終呈現(xiàn)的條帶位置[16]。

Marker-Marker；1-0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)8 h后的菌體破碎液上清；2-0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)8 h后的菌體破碎后的沉淀；3-復(fù)性后的蛋白液；4-超濾純化后的復(fù)性蛋白液圖2 BL21(DE3)-pET28a(+)-SSL誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物及其復(fù)性后的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of the expression product of BL21(DE3)-pET28a(+)-SSL and its renatured protein

2.3 表達(dá)蛋白包涵體的復(fù)性

對(duì)蛋白包涵體進(jìn)行洗滌、溶解、透析和濃縮等復(fù)性步驟后，進(jìn)行SDS-PAGE(圖2)實(shí)驗(yàn)。利用捷達(dá)凝膠成像系統(tǒng)軟件分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)產(chǎn)物中雜蛋白基本得到全部去除，最終獲得的與發(fā)酵液相同體積的復(fù)性液蛋白濃度為61. 10 mg/L，回收率為33. 75%。復(fù)性液的酶活力為(490. 80 ± 12. 70) U/mL，在復(fù)性完成后進(jìn)行一步超濾管的分離即可達(dá)到目的蛋白90%以上純度的純化效果(泳道4所示)，比酶活力可達(dá)8 832.78 U/mg。

His-tag的組氨酸標(biāo)簽可用于重組蛋白的親和純化。然而本文復(fù)性后的蛋白中只有極少量的雜蛋白存在，復(fù)性完成后進(jìn)行一步超濾管的分離即可達(dá)到較好的純化效果，親和純化并沒(méi)有進(jìn)行的必要。盡管His-tag標(biāo)簽的存在并不影響本文中的SSL酶活性，但是在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以在Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)之前引入終止密碼子提前終止轉(zhuǎn)錄，以獲得沒(méi)有His-tag標(biāo)簽的SSL產(chǎn)品。

2.4 SSL的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 最適作用溫度與熱穩(wěn)定性

如圖3所示，重組SSL的最適作用溫度為35 ℃，這與天然SSL的最適作用溫度基本一致[17]。隨著溫度的升高或降低，SSL的酶活性均有不同程度的降低。在30～40 ℃范圍內(nèi)，SSL可保持80%以上的酶活力。溫度過(guò)低，SSL與反應(yīng)底物的接觸機(jī)率下降，導(dǎo)致其反應(yīng)活力下降；而溫度升高時(shí)，SSL分子結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生改變，從而逐漸失去酶活性。

■-最適作用溫度；△-溫度穩(wěn)定性圖3 溫度對(duì)SSL酶活力的影響Fig.3 Effects of temperature on the enzyme activities of SSL

而在熱穩(wěn)定性方面，SSL在10～50 ℃范圍內(nèi)酶活力相對(duì)穩(wěn)定，不同溫度下保溫30 min均能保持70%以上的酶活力；而在60 ℃和70 ℃條件下保溫30 min之后，SSL的相對(duì)酶活力只保留了初始值的50%和8.5%；當(dāng)SSL在80 ℃條件下保溫30 min之后，SSL將會(huì)徹底失活。

2.4.2 最適作用pH與pH穩(wěn)定性

如圖4所示，SSL的最適反應(yīng)pH為6.0，與天然SSL的特性基本一致[17]。在pH5.5～6.5的范圍內(nèi)，SSL的酶活力相對(duì)穩(wěn)定，都能保持其最適作用pH條件下酶活的80%以上。pH過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響其酶活力。SSL的pH穩(wěn)定性較好，在pH4.0～9.0范圍內(nèi)酶活力都相對(duì)穩(wěn)定，不同pH條件下處理30 min，均能保持其初始酶活力的90%以上。

■-最適作用pH；△-pH穩(wěn)定性圖4 pH對(duì)SSL酶活力的影響Fig.4 Effects of pH on the enzyme activities of SSL

2.5 SSL的抑菌效果測(cè)定

如表2所示，與標(biāo)準(zhǔn)品溶菌酶的抗菌活性類似，SSL的抗菌譜主要集中在革蘭氏陽(yáng)性菌，而對(duì)革蘭氏陰性菌的作用效果較差。而在殺菌效果方面，SSL除了對(duì)Bacillusamyloliquefaciens(+)和Pseudomonasaeruginosa(-)的作用效果與標(biāo)準(zhǔn)品有顯著性差異之外，對(duì)其他微生物的殺滅效果并無(wú)明顯差異。

表2 SSL的抗菌活性

注：a:P<0.01; b:P<0.05。

SSL屬于C型溶菌酶的一種，其殺菌作用機(jī)制是作用于微生物細(xì)胞壁肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1,4-糖苷鍵。革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁組成比較簡(jiǎn)單，且肽聚糖直接暴露在最外層，有利于SSL的結(jié)合與作用；而革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量較少，且外層還有保護(hù)性的脂多糖，所以SSL對(duì)其作用效果較差。后續(xù)可以通過(guò)脂肪酸酯化脂多糖、插入疏水性多肽、部分變性以及分離抗菌肽等方式來(lái)提高其對(duì)革蘭氏陰性菌的作用效果[18]。

3 結(jié)論

根據(jù)NCBI網(wǎng)站的數(shù)據(jù)，化學(xué)合成了SSL的編碼基因，通過(guò)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切之后與載體pET-28a(+)連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中成功得到了誘導(dǎo)表達(dá)。在25 ℃、200 r/min條件下，利用0.1 mmol/L的 IPTG誘導(dǎo)8 h，離心發(fā)酵液獲得菌體，超聲破碎后，獲得了181.05 mg/L的重組蛋白包涵體。通過(guò)對(duì)包涵體的洗滌、溶解、透析以及濃縮，最終獲得了有生物活性的SSL產(chǎn)品，其復(fù)性液蛋白濃度為61.10 mg/L，比酶活力可達(dá)8 032.78 U/mg。

本研究中，目的蛋白的復(fù)性過(guò)程與其純化過(guò)程耦合程度較高，只需結(jié)合截留分子量為30 000 kDa超濾管的超濾步驟，不需要親和柱的純化即可達(dá)到90%以上的純度。因此，后續(xù)可以通過(guò)在HindⅢ酶切位點(diǎn)之前添加終止子，使目的基因的轉(zhuǎn)錄提前終止，從而獲得不含His-tag標(biāo)簽的重組蛋白。用大腸桿菌來(lái)表達(dá)SSL與利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，一方面產(chǎn)物以包涵體的形式存在，可以減少或降低宿主產(chǎn)生的蛋白酶對(duì)目的蛋白的降解，這是在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)的一個(gè)缺陷[19]；另一方面，可以獲得純度和活性更高的蛋白產(chǎn)品SSL(畢赤酵母X-33表達(dá)系統(tǒng)中經(jīng)過(guò)純化的SSL比酶活力最高只有2 845.38 U/mg[1])，有利于其后續(xù)的酶學(xué)性質(zhì)或抗菌活性的研究。

此外，對(duì)復(fù)性得到的SSL進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)和抗菌活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其最適作用溫度為35 ℃，最適作用pH為6.0，與理論值基本一致，且抗菌活性與標(biāo)準(zhǔn)品溶菌酶的作用效果基本一致，為SSL的規(guī)?；a(chǎn)及其應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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The expression of Sus scrofa lysozyme in E. coli and its refolding

ZHU De-wei, CAI Guo-lin, LU Jian*

(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

As a kind of C-type lysozyme,Susscrofalysozyme (SSL) plays an important role in anti-exterior microorganisms. Considering the important role of pig in stock farming, especially that the feed antibiotic is severely limited, the production of SSL is urgently demanded. The CDS of SSL gene was synthesized and inserted into vector pET-28a(+) after digestion withBamHⅠandHindⅢ. Then the recombinant plasmid was transformed into BL21 (DE3). Under the condition of 25 ℃, 200 r/min, 0.1 mmol/L IPTG was added for 8 h induction. With the process of refolding, SSL with natural activity was obtained. Furthermore, the characterization of the recombinant protein was carried out. After centrifugation and ultrasonic disruption, 181.05 mg/L inclusion body of recombinant protein was harvested. After refolding, SSL with the specific enzyme activity of 8032.78 U/mg was obtained. In the study of enzymatic property, the optimal temperature and pH was 35 ℃ and 6, respectively, which were the same as their theoretical values. In the antimicrobial activity analysis, recombinant SSL had a similar result to standard lysozyme. The results will lay the foundation for the industrial production of SSL and its further applications.

Susscrofalysozyme(SSL);E.coli; including body; refolding

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610004

博士研究生(陸健教授為通訊作者,E-mail：jlu@jiangnan.edu.cn)。

973項(xiàng)目(2013CB733602)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(JUSRP51302A)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

2016-03-10，改回日期：2016-04-05