栽培膽木的品質(zhì)評價研究

王德立，馮錦東，賴 潛

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所，海南 ?？?571511；2.海南制藥廠有限公司，海南 五指山市 572200）

栽培膽木的品質(zhì)評價研究

王德立1，馮錦東1，賴 潛2

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所，海南 海口 571511；2.海南制藥廠有限公司，海南 五指山市 572200）

對栽培膽木藥材的性狀進(jìn)行鑒定，確立膽木最適種植環(huán)境和采收年限.采集海南省10個鄉(xiāng)鎮(zhèn)種植的膽木、五指山市水滿鄉(xiāng)不同株齡的膽木和野生膽木，利用顯微鑒別、顯色反應(yīng)和薄層鑒別鑒定藥材性狀，利用HPLC法測定異常春花苷內(nèi)酰胺含量，分析不同產(chǎn)地、不同株齡的膽木中異常春花苷內(nèi)酰胺的含量差異.結(jié)果顯示：栽培膽木的藥材性狀、顯微性狀、藥材粉末的顯色反應(yīng)、薄層顯色反應(yīng)等均與野生藥材相符；峰面積與異常春花苷內(nèi)酰胺濃度的回歸方程為Y=73843X+ 76394（R2=0.9999），來自10個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的膽木中異常春花苷內(nèi)酰胺的質(zhì)量百分比含量（%）為：南圣鎮(zhèn)1.355，水滿鄉(xiāng)1.97，番陽鎮(zhèn)1.03，毛感鎮(zhèn)2.052，什玲鎮(zhèn)2.097，響水鎮(zhèn)1.96，和平鎮(zhèn)2.453，烏什鎮(zhèn)1.86，長征鎮(zhèn)1.26，紅毛鎮(zhèn)2.015.種植于水滿鄉(xiāng)株齡2～6年的膽木中異常春花苷內(nèi)酰胺的含量分別為（%）：0.472、0.876、1.690、1.936、1.783，而野生膽木異常春花苷內(nèi)酰胺含量為1.679%.因此，環(huán)境對膽木中異長春花苷內(nèi)酰胺的積累有顯著影響，種植時應(yīng)選擇適宜環(huán)境；株齡4年及其以的膽木質(zhì)量達(dá)到海南省地方標(biāo)準(zhǔn)，方可入藥.

膽木；異長春花苷內(nèi)酰胺；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；藥材鑒定

膽木Nauclea officinalis Pierre ex Pitard為茜草科烏檀屬植物，又稱熊膽樹、烏檀、細(xì)葉黃棵木、黃羊木，以干燥樹干入藥，樹枝條、樹皮也可供藥用.膽木主產(chǎn)于海南、廣東和廣西，其中在海南主要分布于保亭、瓊中、五指山市等市縣.該植物是海南島珍貴而獨特的黎藥資源，為海南民間的常用藥，也是著名的南藥[1].

現(xiàn)代研究表明膽木為一味常用消炎類中藥，具有清熱解毒、消炎殺菌、消腫止痛等功效[2]，常用于治療急性黃疸、急性偏桃體炎、咽喉炎、泌尿系統(tǒng)感染、肺炎、中耳炎等病.膽木的消炎止痛作用與其所含的成分有關(guān)，膽木樹干中含多種生物堿，主要為吲哚生物堿類物質(zhì)[3]，如膽木堿甲（naucleficine I）、膽木堿乙（naucleficine II）、膽木堿丙（naucleficine III）、膽木堿?。↙-acetyl-β-carboline）、膽木堿戊（naucleidinal）、膽木堿已（naucLefiline IV）、膽木堿庚（nauclecoside V）、膽木堿辛（nauclecosidine VI）、膽木堿壬即喜果甙（vincoside lactam），在眾多生物堿類化合物中異常春花苷內(nèi)酰胺為重要活性成分，并成為品質(zhì)評價的指標(biāo)性成分[4]；還含有喹啉類生物堿，如pumiloside (66)和3-epi-pumiloside(67)[5].此外還有三萜及其苷類化合物.

膽木主要用于生產(chǎn)膽木注射液和膽木浸膏片[6]，膽木提取物是膽木注射液的主要成分，膽木注射液是海南制藥廠有限公司藥物研究所研發(fā)的新一代植物抗菌、抗病毒消炎藥物，素有中藥抗生素之稱，因此膽木注射液高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化改造具有長遠(yuǎn)的經(jīng)濟(jì)效益和深遠(yuǎn)的社會效益.隨著注射液銷量的迅速增加，對膽木原料的需求亦迅速增加.早期，膽木原料主要來自野生，但由于砍伐不斷加劇，加上植株需要生長多年方可入藥，種群更新較慢，因此野生資源逐漸枯竭.為解決資源短缺問題，海南制藥廠有限公司聯(lián)合海南省多個鄉(xiāng)鎮(zhèn)農(nóng)戶開展了膽木規(guī)范化種植.在種植膽木過程中，進(jìn)行了施肥、灌溉及其它基本的農(nóng)事操作，生長環(huán)境與野生條件相比差異顯著，栽培的膽木是否滿足入藥要求，其藥材結(jié)構(gòu)和品質(zhì)與野生資源差異性是否顯著，何種環(huán)境條件及選擇何種生長年限的膽木更利于提高藥材品質(zhì)，均需明確.基于上述原因，本研究通過采集海南省不同地點和種植不同生長年限的膽木，按照2010版中國藥典方法進(jìn)行藥材鑒定，利用HPLC法進(jìn)行品質(zhì)分析.

1 材料、儀器及試劑

1.1 材料

2014年11月采集種植于海南制藥廠有限公司膽木生存基地中株齡2、3、4、5、6年膽木樹干，并在五指山水滿鄉(xiāng)采集1份野生膽木材料；同月，在海南十個鄉(xiāng)鎮(zhèn)（五指山市：南圣鎮(zhèn)、番陽鎮(zhèn)、水滿鄉(xiāng)；瓊中縣紅毛鎮(zhèn)、和平鎮(zhèn)、烏石鎮(zhèn)及長征鎮(zhèn)；保亭縣毛感鄉(xiāng)、響水鎮(zhèn)及什玲鎮(zhèn)）膽木種植基地分別采集相似生長年限的膽木植株10株，并將材料按種植地不同混合后取2 kg，用于膽木質(zhì)量研究.野生材料來自2014年10月份海南制藥廠有限公司采購的野生膽木藥材.憑證標(biāo)本存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所，標(biāo)本憑證號：2014DM0010.

1.2 儀器

SHIMADZU SPD-10A高效液相色譜儀，包括UV-Vis檢測器，LC-10A輸液泵，SHIMADZU CR7Ae pLus積分儀；WondaSILTM-C18（4.6×150mm，5um）色譜柱；電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-905SA型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠）.

1.3 試劑

異常春花苷內(nèi)酰胺對照品（經(jīng)中國藥品生物制品檢定所提供）；乙腈（高效液相色譜專用，江蘇漢邦科技有限公司）；甲醇（高效液相色譜專用，廣東光華化學(xué)廠）；磷酸（分析純，廣東光華化學(xué)廠）；超純水（自制）；其他試劑均為分析純.

2 實驗方法

2.1 藥材性狀觀察及鑒別

2.1.1 根據(jù)中國藥典2005版中藥材性狀鑒別方法鑒定，包括顯微鑒別、熒光鑒別、顯色反應(yīng)和成分定性檢測.

2.1.1.1 顯微鑒別

在體視鏡和顯微鏡下觀察膽木橫切面，記錄木質(zhì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞排列等情況.

2.1.1.2 熒光鑒別

本品粉末約3g，加水40 mL，煮沸10 min，放冷，濾過，濾液加醋酸乙酯10 mL振搖提取.取醋酸乙酯液，點于濾紙上，置紫外光燈（365 nm）下觀察，加堿液后熒光增強(qiáng).

2.1.1.3 顯色反應(yīng)

取鑒別2.1.1.2項下剩余的醋酸乙酯液，蒸干，殘渣加乙醇2 mL使溶解，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%亞硝酸鈉溶液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%硝酸鋁溶液各3滴及氫氧化鈉試液1 mL，觀察溶液顏色.

2.1.1.4 成分定性檢測

取本品粉末3g，加水40 mL，加稀鹽酸使成酸性后，煮沸10 min，濾過.取濾液分置三支試管中，每管2 mL，一管中加硅鎢酸試液3滴，即產(chǎn)生黃色沉淀；一管中加碘化汞鉀試液3滴，即產(chǎn)生橙黃色沉淀；另一管中加碘化鉍鉀試液3滴，觀察產(chǎn)生沉淀情況.

2.1.2 薄層鑒別

薄層色譜法：取膽木注射液2 mL，加水8 mL與濃氨試液0.5 mL，搖勻，用氯仿振搖提取3次，每次10 mL，合并氯仿液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液.另取膽木對照藥材6g，加水煎煮30 min，濾過，濾液濃縮至20 mL，加濃氨試液0.5 mL，搖勻，用氯仿振搖提取3次，每次20 mL，合并氯仿液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液.照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄ⅥB）實驗，吸取上述兩種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以v（氯仿）∶v（甲醇∶v（醋酸乙酯）=8∶1∶3為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視.

2.2 異常春花苷內(nèi)酰胺的含量測定

2.2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈與質(zhì)量濃度0.1%磷酸溶液的體積比為30∶70的溶液為流動相，檢測波長為226 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫室溫，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于2000.

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取異長春花苷內(nèi)酰胺對照品0.0088g于25 mL容量瓶中，加入流動性超聲溶解，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含異長春花苷內(nèi)酰胺0.352 mg.

2.2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取異長春花苷內(nèi)酰胺對照品溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.5 mL于10 mL容量瓶中，加流動相制成標(biāo)準(zhǔn)系列，上述各溶液20 uL注入液相色譜儀，分別以異長春花苷內(nèi)酰胺對照品溶液的濃度X（mg/L）與異長春花苷內(nèi)酰胺峰面積Y進(jìn)行線性回歸，以濃度X（mg/L）自變量，峰面積Y為因變量得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=73843x+76394（R2=0.9999）.

2.2.4 精密度試驗

取異長春花苷內(nèi)酰胺對照品溶液配制成35.2 mg/L的工作溶液，取上述溶液20 uL注入液相色譜儀中，連續(xù)5次，測定峰面積，其RSD為1.25%.

2.2.5 穩(wěn)定性試驗

精密稱取干燥粉碎的供試品0.5g，加入70%的乙醇溶液50 mL，回流提取40 min，放冷，用70%的乙醇補(bǔ)足減失重量，混勻，靜置，精密吸取上清液10 mL于50 mL容量瓶中用流動相定容至刻度，搖勻，即得.于0、2、4、6、8、24、48 h分別上述溶液20 uL注入液相色譜儀中，測定異長春花苷內(nèi)酰胺峰面積，供試品48 h的RSD值為0.89%.

2.2.6 重復(fù)性試驗

精密稱取供試品約0.5g六份，各加入70%的乙醇溶液50 mL，回流提取40 min，放冷，用70%的乙醇補(bǔ)足減失重量，混勻，靜置，精密吸取上清液10 mL于50 mL容量瓶中用流動相定容至刻度，搖勻，即得.分別上述溶液20 uL注入液相色譜儀中，測定異長春花苷內(nèi)酰胺峰面積，RSD值為2.1%.

2.3 供試品溶液的制備方法

2.3.1 藥材供試品溶液的制備方法考察

2.3.1.1 提取溶劑的考察

擬用回流法考察膽木藥材的提取溶劑.實驗方法：精密稱取膽木藥材粗粉5份，每份1.0g，分別用水及體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、100%的甲醇40 mL回流提取0.5 h，濾過，濾液置50 mL量瓶中，用少量相應(yīng)溶劑分次洗滌容器和殘渣，洗液濾入同一量瓶中，加相應(yīng)溶劑至刻度，搖勻，測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%的甲醇提取效果較好.

2.3.1.2 提取方法的考察

精密稱取膽木藥材粗粉2份，每份1.0g，分別用70%甲醇溶液40 mL超聲和回流0.5 h，濾過，濾液置50 mL量瓶中，用少量70%甲醇溶液分次洗滌容器和殘渣，洗液濾入同一量瓶中，加70%甲醇溶液至刻度，搖勻，測定，結(jié)果表明回流提取此超聲效果較好.

2.3.1.3 提取時間的考察

精密稱取膽木藥材粗粉3份，每份0.5g，用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液40 mL分別回流30、50、70 min，過濾，濾液置50mL量瓶中，用少量70%甲醇溶液分次洗滌容器和殘渣，洗液濾入同一量瓶中，加70%甲醇溶液至刻度，搖勻，測定，結(jié)果表明提取時間為70 min，效果較佳.

2.3.2 供試品溶液的制備

通過以上方法學(xué)考察得出供試品溶液的制備為：精密稱取干燥粉碎的供試品0.5g，加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液50 mL，精密稱定，回流提取70 min，放冷，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液補(bǔ)足減失重量，混勻，靜置，精密吸取上清液10 mL于50 mL容量瓶中用流動相定容至刻度，搖勻，即得.

3 結(jié)果

3.1 藥材性狀觀察與鑒別

3.1.1 膽木藥材性狀特征

本品為不規(guī)則的小塊或片，黃色或棕黃色.有的帶皮部，其外皮黃褐色，粗糙，易剝落.皮部斷面棕褐色或棕黃色，纖維性.質(zhì)堅硬，無臭，味苦.

3.1.2 膽木藥材鑒別

3.1.2.1 顯微鑒別

皮層較窄，由4～6列類長方形細(xì)胞構(gòu)成，排列緊密，細(xì)胞直徑14.2～33.5μm；韌皮部細(xì)胞皺縮成不規(guī)則形狀；形成層成環(huán)，木質(zhì)部發(fā)達(dá)，由導(dǎo)管、木纖維、木薄壁細(xì)胞組成，射線較密，放射狀，導(dǎo)管多單個散在，少數(shù)成群，直徑50～210μm.射線細(xì)胞1～2列，長方形，木化，具紋孔.木薄壁細(xì)胞為外層的基本組織，內(nèi)層的纖維群中亦有少數(shù)，壁木化，具紋孔.

粉末金黃色或淡黃色.導(dǎo)管形狀多樣，大小不一，長180～600μm，寬40～220μm，均為具緣紋孔導(dǎo)管；纖維眾多，有的兩端漸尖，有的一端稍鈍，長560～1240μm，寬25～44μm，壁厚薄不一，紋孔斜向裂隙狀，少數(shù)細(xì)胞孔溝較寬；木薄壁細(xì)胞形狀多樣，有窄長方形、類三角形、紡錘形等；石細(xì)胞呈多角形，長30～50μm，寬15～50μm.

3.1.2.2 熒光鑒別

顯藍(lán)紫色熒光，加堿液后熒光增強(qiáng).

3.1.2.3 顯色反應(yīng)

按2.1.2.3要求處理后溶液顯橙紅色.

3.1.2.4成分定性鑒定

按2.1.2.4要求處理后產(chǎn)生棕褐色沉淀.

3.1.3 薄層鑒別

供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點.

圖1 膽木注射液薄層色譜圖Fig.1 The chromatography TLC of injection and standard material of Nauclea officinalis Pierre ex Pitard

3.2 異常春花苷內(nèi)酰胺的含量測定結(jié)果

3.2.1 不同產(chǎn)地膽木中異常春花苷內(nèi)酰胺的含量測定結(jié)果

不同產(chǎn)地相似株齡的膽木中異常春花苷內(nèi)酰胺的含量見表1，五指山市水滿鄉(xiāng)所產(chǎn)膽木中異常春花苷內(nèi)酯含量為1.97%，顯著高于本市其他鄉(xiāng)鎮(zhèn)材料.保亭縣什玲鎮(zhèn)膽木中該成分含量最高為2.11%，其次為毛感鄉(xiāng)，2.056%.瓊中縣和平鎮(zhèn)膽木中該成分含量2.45%，顯著高于本縣其它鄉(xiāng)鎮(zhèn)材料.

表1 10批膽木藥材中異常春花苷內(nèi)酰胺含量測定結(jié)果Tab.1 The contents of isovincoside lactone in 10 samples of nauclea officinalis

3.2.2 不同株齡栽培膽木與野生膽木中異常春花苷內(nèi)酰胺的含量比較

種植2年至5年的膽木中異常春花苷內(nèi)酯酰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐年升高，由0.463%升高至1.936%，第6年和第5年該成分含量差異不顯著，且顯著高于野生膽木（見表2）.

表2 不同株齡栽培膽木與野生膽木中異長春花苷內(nèi)酰胺含量比較Tab.2 A comparative study of the Isovinciside lactone of cultivated and wild nauclea officinalis in different growth age

圖2 異常春花苷內(nèi)酰胺標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜Fig.2HPLC chromatography of Isovinciside lactone standard substance

圖3 膽木藥材HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatography of Nauclea officinalis

4 討論

膽木為特色南藥，海南當(dāng)?shù)鼐用褚愿稍飿涓珊蜆渲樵现委熀粑姥装Y.但由于膽木野生資源逐漸枯竭，目前生產(chǎn)膽木注射液的原料主要來自栽培膽木.據(jù)初步統(tǒng)計在海南膽木種植面積約666.67 hm2，種植年限1～6年不等.為確保栽培膽木和野生膽木在藥材性狀和品質(zhì)方面具有一致性，有必要開展性狀鑒定.本研究通過利用《中國藥典》中實驗方法進(jìn)行性狀描述、顯微鑒別、顯色反應(yīng)及薄層鑒別（見圖1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)栽培膽木和野生膽木在性狀方面無顯著差異.由此可見在種植時只要選擇指定品種，按照常規(guī)的種植方式，生產(chǎn)出原料在性狀方面均符合要求.

膽木中含有多種化學(xué)成分，只分析其生物堿含量不夠嚴(yán)密，選擇正確的活性成分對膽木品質(zhì)評價至關(guān)重要.有關(guān)膽木化學(xué)成分的研究已較多，陳家全等[8]從膽木中分離出6個化學(xué)成分，朱粉霞等[9]從膽木中分離出9個化合物，但并未指出可以用于質(zhì)量評價的指標(biāo)性成分.李海龍等[10]研究了膽木藥材的指紋圖譜，為膽木質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了參考.有研究指出膽木中芬酸和生物堿類物質(zhì)，如中原兒茶酸、短小舌根草苷、3-表短小舌根草苷及異長春花苷內(nèi)酰胺的可用于質(zhì)量評價[11].張俊清[12]等也以異長春花苷內(nèi)酰胺為指標(biāo)成分比較膽木植株莖、皮和葉的品質(zhì)差異.本研究總結(jié)前人研究經(jīng)驗，以異長春花苷內(nèi)酰胺為指標(biāo)成分進(jìn)行品質(zhì)比較和評價.且通過HPLC方法學(xué)考察，該成分可以被準(zhǔn)確測定，可以用于膽木品質(zhì)評價.在確定評價指標(biāo)和測定方法的基礎(chǔ)上，研究了不同產(chǎn)地和不同生長年限對膽木品質(zhì)的影響.

在尚未實施膽木規(guī)?；N植之前，其原料來自全國各地的野生膽木，特別是海南生產(chǎn)的膽木注射液主要原料來自海南全省，以五指山、保亭、瓊中、白沙等市縣為主.這些地區(qū)環(huán)境差異明顯，在土質(zhì)、降雨量、光照強(qiáng)度、大氣溫濕度方面均有較大差異，這可能對藥材品種有影響，為了尋找較為合適的種植環(huán)境，本研究測定了海南主要分布種植的膽木藥材品質(zhì).結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同市縣種植的膽木品質(zhì)差異較大，即使同一市縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)種植的膽木品質(zhì)差異也極顯著（表1），以瓊中和平鎮(zhèn)膽木品質(zhì)最好，高達(dá)2.455%，其次是保亭縣什玲鎮(zhèn)和毛感鄉(xiāng)分別為2.11%和2.056%，因此瓊中縣和平鎮(zhèn)、保亭縣什玲鎮(zhèn)和毛感鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境更適宜種植膽木.

一般對野生藥材難以明確其株齡，對其藥物活性成分的積累動態(tài)難以弄清，這可能會造成原料浪費(fèi)和資源破壞.本研究通過測定種植于五指山市2～6年株齡的膽木莖干中異長春花苷內(nèi)酰胺含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)種植4年的膽木中該成分含量已達(dá)1.69%，已符合海南省地方標(biāo)準(zhǔn)1.0%[13]，即達(dá)到采收要求（表2），但是否具有最好的收益還需要結(jié)合膽木的生物量積累情況進(jìn)行綜合分析.

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責(zé)任編輯：劉 紅

Identification and Quality Evaluation of Nauclea officinalis Pierre ex Pitard Cultivated in Plantion

WANG Deli1，F(xiàn)eng Jindong1，Lai Qian2
（1.Institute of Medicinal Plant Hainan Branch，Chinese Academy of Medical Sciences，Haikou 571511，China；2.Hainan Pharmaceutical Factory，Ltd.，Wuzhishan 572200，China）

This research is to identify the Nauclea officinalis Pierre ex Pitard cultivated in plantion and make clear the optimum environment for planting and the suitable harvest period.The material of Nauclea officinalis Pierre ex Pitard is collected in plantation in ten towns of four counties of Hainan province,and the materials with different ages are from Wuzhishan county of Hainan province.The properties of medicine material are identified by the technologies of microholography,color reaction and thin-layer chromatography.The contents of isovincoside lactone in medicinal materials are detected by HPLC to differentiate between superior and inferior materials.The results of microholography,color reaction and thin-layer chromatography of materials from plantation are the same to those of the wild;the equation is figured out according to the results of peak area and the contents of isovincoside lactone.The isovincoside lactone mass concentrations in different materials from ten townships are as follows:Nan Sheng 1.355%,Shui Man 1.97%,Fan Yang 1.030%,Mao Gan 2.052%,Shen Ling 2.097%, Xiang Shui 1.96%,He Ping 2.453,Wu Shen 1.86%,Chang Zheng 1.26%,Hong Mao 2.015.The mass concentrations of isovincoside lactone in materials with 2～6 ages are respectively 0.472%,0.876%,1.690%,1.936%and 1.783%,and that in wild material is 1.679%.The content of isovincoside lactone is affected remarkably by the environment,so this species is cultivated in suitable plantation.The materials from the trees with 4 ages are up to the prescribed standard of Hai nan province.

Nauclea officinalis Pierre ex Pitard；isovincoside lactone；quality standard；identification of medicinal material

R 284

A

1674-4942（2016）03-0268-05

2016-05-08

海南省中藥現(xiàn)代化專項資金項目（2012ZY009，ZY201311）