電針委中穴對大鼠退變腰椎間盤組織中Bcl-xL、Bax表達(dá)的影響①

何挺超，陳少清，林建平，劉午龍，夏夢,3，王詩忠

電針委中穴對大鼠退變腰椎間盤組織中Bcl-xL、Bax表達(dá)的影響①

何挺超1，陳少清1，林建平2，劉午龍1，夏夢1,3，王詩忠1

目的 觀察電針委中穴對大鼠腰椎間盤退變組織中抗凋亡因子Bcl-xL、凋亡因子Bax蛋白表達(dá)的影響。方法 30只雄性Sprague-Daw ley大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=10)、模型組(n=10)和電針委中組(n=10)。模型組和電針委中組通過纖維環(huán)穿刺法建立大鼠腰椎間盤退變模型。造模成功1個月后，電針委中組予電針委中穴，連續(xù)4周。HE染色觀察組織形態(tài)，免疫組化法觀察退變腰椎間盤組織中Bax蛋白表達(dá)，Western blotting檢測Bcl-xL、Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果 HE染色顯示，腰椎間盤組織退變程度由輕至重依次是假手術(shù)組、電針委中組、模型組。模型組Bcl-xL蛋白表達(dá)量低于假手術(shù)組(P＜0.05)，Bax蛋白表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)；電針委中組Bcl-xL蛋白表達(dá)量顯著高于模型組(P＜0.001)，Bax蛋白表達(dá)量明顯低于模型組(P＜0.01)。結(jié)論 電針委中穴治療腰椎間盤退變，可能與上調(diào)Bcl-xL蛋白表達(dá)并抑制Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

腰椎間盤退變；電針；委中穴；凋亡因子；大鼠

[本文著錄格式] 何挺超，陳少清，林建平，等.電針委中穴對大鼠退變腰椎間盤組織中Bcl-xL、Bax表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2016,22(11):1264-1268.

CITED AS:He TC,Chen SQ,Lin JP,et al.Effects of electroacupuncture atWeizhong on expression of Bcl-xL and Bax in ratswith lumbar disc degeneration[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(11):1264-1268.

腰痛屬于中醫(yī)“腰痛”“腰腿痛”“痹癥”范疇，作為一類常見病癥，危害人們健康，對患者的生活和工作能力造成影響與限制[1]。引起腰痛的原因很多，1974年Steindler首次提出腰痛與椎間盤退變相關(guān)[2]，并且得到廣泛認(rèn)可與重視。對此有研究表明，凋亡和抗凋亡因子的表達(dá)以及兩者之間的動態(tài)平衡結(jié)果與椎間盤退行性改變密切相關(guān)[3]。本研究通過電針委中穴干預(yù)大鼠腰椎間盤退變，觀察抗凋亡因子Bcl-xL、凋亡因子Bax在退變腰椎間盤組織中的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級Sprague-Daw ley雄性大鼠30只，3月齡，體質(zhì)量250～300 g，由上海實驗動物中心提供，許可證號SCK(滬)2012-0002。按照隨機數(shù)字表法將飼養(yǎng)1周的大鼠進(jìn)行分籠分組：假手術(shù)組、模型組和電針委中組，每組10只。

1.2 主要實驗設(shè)備及試劑

低溫離心機：美國BECKMAN公司。金屬恒溫箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司。石蠟包埋機：湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司。華佗牌G6805電針儀：蘇州醫(yī)療用品廠。Motic Med 6.0顯微生物圖像分析系統(tǒng)：麥克奧迪公司。兔抗鼠多克隆抗體Bax：北京博奧森生物技術(shù)公司。兔多克隆抗體Bcl-xL、兔多克隆抗體Bax：Cell Signaling Technology。免疫組化試劑盒即用型：福州邁新生物技術(shù)有限公司。Sub-Cell GT電泳儀、Image Lab凝膠成像系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 造模

模型組和電針委中組大鼠術(shù)前禁食12 h，并予以稱重記錄。分別以10%水合氯醛3m l/kg腹腔注射麻醉，備皮。仰臥位固定，取右側(cè)旁正中切口，暴露腹后壁，剪開后腹膜，腸子轉(zhuǎn)移到左側(cè)，將腰大肌和深層肌肉的附著點從椎體附著處鈍性剝離，注意保護周圍神經(jīng)及血管，然后依次暴露L3/L4、L4/L5、L5/L6椎間盤。充分暴露操作視野后，采用21G腰椎穿刺針對上述節(jié)段腰椎間盤行纖維環(huán)穿刺術(shù)，穿刺角度與椎間盤矢狀面保持45°～60°，與椎間盤上下軟骨終板平行入針并停留10 s再退出，穿刺深度為3mm。術(shù)后順次縫合皮下筋膜及皮膚。

假手術(shù)組僅切開皮膚后縫合，不做纖維環(huán)穿刺法造模處理。術(shù)后予青霉素5萬U/只肌肉注射，連續(xù)3 d，以預(yù)防術(shù)后感染死亡。

造模后同等條件下飼養(yǎng)1個月。每組隨機取1只大鼠，通過HE染色，驗證模型。假手術(shù)組大鼠的腰椎間盤可觀察到其四周的纖維環(huán)結(jié)構(gòu)完好，同時排列有序，位于中心的髓核網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)完整。另兩組纖維環(huán)細(xì)胞腫脹甚至斷裂，明顯紊亂，中心是退化的髓核網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，體積減小，呈纖維軟骨樣改變，驗證模型成功。

1.3.2 干預(yù)方法

假手術(shù)組和模型組正常喂養(yǎng)。電針委中組在造模1個月后予電針委中穴，取穴法參照李忠仁《實驗針灸學(xué)》[4]，其余同前。針灸針(直徑0.16mm，長10 mm)直刺大鼠雙側(cè)后肢委中穴和非穴點，深度0.5 cm，并予針柄接上電針儀(G-6805華佗牌)的正負(fù)極，疏密波波形，以下肢出現(xiàn)輕微顫抖為度(2 Hz,2 mA)，每次20m in，每天1次，連續(xù)治療4周[5]。

1.3.3 取材

干預(yù)結(jié)束后，所有大鼠以過量10%水合氯醛腹腔注射處死。大鼠取俯臥位，將其后背正中皮膚切開，并予逐層分離腰椎兩側(cè)的肌肉韌帶，剪取所需節(jié)段腰椎椎體置于冰面上(已包含椎間盤)，并依次快速取出L3/L4、L4/L5、L5/L6椎間盤組織，同時L3/L4、L4/L5椎間盤組織置于4%多聚甲醛中固定，待測；L5/L6椎間盤組織迅速放入-80℃超低溫冰箱中保存，待測。

1.3.4 HE染色

將L3/L4、L4/L5椎間盤組織放入4%多聚甲醛中固定24 h，10%乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)脫鈣8周，每周更換1次，而后水洗、常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，HE染色，顯微鏡下利用無偏體視學(xué)(unbiased stereology)技術(shù)，每張切片隨機取3個不同視野(400×)纖維環(huán)和髓核圖片。根據(jù)觀察結(jié)果并結(jié)合參照Masuda等[6]對椎間盤形態(tài)變化研究，判斷其退變程度。

1.3.5 免疫組化染色

組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟各15m in、酒精脫水各5 m in，再經(jīng)熱抗原修復(fù)10m in，此過程須浸泡于枸櫞酸鈉中(液體沒過組織)；適時滴加試劑一室溫孵育10 m in；試劑二封閉30m in(傾去，勿洗)；滴加現(xiàn)用現(xiàn)配的一抗于濕盒并于4℃過夜；第二天室溫復(fù)溫30 m in，滴加試劑三、試劑四室溫孵育10min；配制DAB，顯色90 s，自來水充分沖洗。上述步驟除滴加試劑二封閉外，其余每個步驟期間均以PBS浸洗3

次，每次5min。經(jīng)蘇木素染色，鹽酸分色1 s，自來水返藍(lán)，封片，顯微鏡下觀察，同時每張切片隨機選取高倍(400×)視野3張。采用Motic Med 6.0顯微生物圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，計算Bax蛋白表達(dá)陽性率，取均值。

1.3.6 Western blotting

于-80℃超低溫冰箱中取出各組腰椎間盤組織，稱重，約40～50mg，于冰塊上剪碎組織后加入配好的裂解液240～300μl，于冰塊中靜置約30m in，期間每10 m in快速振蕩1次，4℃、14,000 r/m in離心30 min，吸取上清液即為蛋白樣品，所取上清液經(jīng)BCA法測蛋白含量(詳細(xì)依照試劑盒)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在樣品中按1∶4加入4×上樣緩沖液，蛋白經(jīng)定量、變性后，進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳，至溴酚藍(lán)指示劑剛跑出膠板即可終止電泳。根據(jù)目標(biāo)蛋白Bax(20 kDa)和Bcl-xL(30 kDa)分子量，按Marker條帶分布切取需要電轉(zhuǎn)的膠。轉(zhuǎn)膜時，材料放置順序為黑膠板(-)—多孔海綿(濾紙2層)—凝膠—NC膜(濾紙2層)—多孔海綿—(+)白膠板，完成轉(zhuǎn)膜后，室溫封閉2 h，分別加入Anti-Bcl-xL(1∶1000)；Anti-Bax(1∶1000) 4℃過夜。第二天，1×TBST洗膜5m in，共5次，加入二抗(1∶5000)室溫孵育1 h，1×TBST液洗膜5 m in，重復(fù)5次，ECL法顯影，以β-actin作為內(nèi)參物，應(yīng)用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)采集所需圖像，收集整理數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

選用SPSS 18.0軟件對實驗所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。用(±s)表示計量資料，若符合正態(tài)分布和方差齊性則采用單因素方差分析；否則進(jìn)行非參數(shù)檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

假手術(shù)組椎間盤纖維環(huán)層次清晰，其纖維環(huán)細(xì)胞數(shù)量未見異常，同時呈同心圓排列，未曾出現(xiàn)破裂或皺縮的情況；髓核呈凝膠樣外觀，髓核細(xì)胞量多且均處于正常的形態(tài)排列狀態(tài)。

模型組椎間盤纖維環(huán)層次紊亂較為明顯，同時其纖維環(huán)細(xì)胞數(shù)量減少也較為明顯，并且纖維環(huán)嚴(yán)重撕裂，扭曲，輪廓模糊不清，呈破絮狀；髓核明顯皺縮，其髓核細(xì)胞數(shù)量減少明顯，并可見大范圍的細(xì)胞壞死。

電針委中組椎間盤纖維環(huán)層次雖有紊亂，但其程度輕于模型組，其纖維環(huán)細(xì)胞數(shù)量減少較少，僅可見局部出現(xiàn)輕度皺縮，扭曲；髓核皺縮較模型組輕微，仍可見其凝膠樣外觀，同時髓核細(xì)胞可見不同程度的變形，甚至小部分壞死。

三組大鼠的腰椎間盤組織退變程度不同，由輕至重依次是假手術(shù)組、電針委中組、模型組。見圖1～圖2。

2.2 免疫組化染色

假手術(shù)組中椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)不明顯，多呈弱陽性或陰性表達(dá)，細(xì)胞染色較淺；模型組明顯可見較深的棕褐色顆粒，其表達(dá)多呈強陽性；電針委中組呈陽性或弱陽性表達(dá)，其染色淺于模型組，數(shù)量也較模型組少。見圖3。

2.3 Western blotting

模型組Bcl-xL蛋白表達(dá)量低于假手術(shù)組(P＜0.05)，Bax蛋白表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)；電針委中組Bcl-xL蛋白表達(dá)量顯著高于模型組(P＜0.001)，Bax蛋白表達(dá)量明顯低于模型組(P＜0.01)。見表1、圖4。

圖1 各組纖維環(huán)形態(tài)改變(HE染色，400×)

圖2 各組髓核形態(tài)改變(HE染色，400×)

圖3 各組椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)(免疫組化染色，400×)

圖4 各組椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞Bcl-xL、Bax蛋白表達(dá)

表1 各組腰椎間盤組織中Bcl-xL、Bax蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

針灸在臨床上治療“腰痛”“腰腿痛”“痹癥”，是常用而行之有效的治療手段之一，并且經(jīng)過長期臨床實踐檢驗。委中穴位于膀胱經(jīng)，屬于該經(jīng)五腧穴中的合穴，同時也是其下合穴，在《針灸大全》更是記述了其作用，即“腰背委中求”；同時“經(jīng)脈所過，主治所及”是針灸治病重要的治療指導(dǎo)原則之一，突顯委中穴在治療腰背部疾病的重要地位。電針委中穴能夠疏經(jīng)通絡(luò)，致使“通則不痛”，并且能運行氣血津液，從而能濡養(yǎng)、治療經(jīng)脈所過的腰背部，使之“榮則不痛”。已有研究表明，腰背部脊髓段與支配委中穴的傳入神經(jīng)在脊髓段的投影對應(yīng)區(qū)有所重合[7-8]。因此可以通過刺激委中穴，刺激相應(yīng)部位的感受器及傳入神經(jīng)，提高其相對區(qū)域的痛閾和耐痛閾，從而提高治療效果，這也得到臨床實踐的肯定[9-12]。

本團隊長期研究證實，電針委中穴能夠治療或者延緩腰椎間盤退變，而細(xì)胞的凋亡與抗凋亡之間的關(guān)系失衡是造成腰椎間盤退變的原因之一。其機制可能是通過改變和平衡抗凋亡因子，降低凋亡因子的表達(dá)來發(fā)揮作用。Bcl-2家族作為能夠決定細(xì)胞凋亡與否的蛋白家族，其中Bcl-xL、Bax是Bcl-2家族蛋白的重要成員[13-14]。Bcl-xL作為抗凋亡的重要因子[15-16]，具有阻止細(xì)胞凋亡作用，是由于其本身具備BH1-4結(jié)構(gòu)，能夠通過抑制存在于線粒體上的通透性轉(zhuǎn)換孔(permeability transition pore,PTP)開放，從而阻止細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用[17-18]。此外，Bcl-xL抑制細(xì)胞凋亡的部分原因是阻斷了細(xì)胞色素C(Cytc)從線粒體釋放，這是與Bcl-xL可以通過抑制線粒體上的高電導(dǎo)通道蛋白(MTP)的開放的功能相關(guān)，而Cytc是凋亡蛋白酶激活的關(guān)鍵因素[19-20]。本實驗通過檢測Bcl-xL蛋白在各組

表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，電針委中組中Bcl-xL蛋白的表達(dá)較其余兩組升高(P＜0.05)。HE染色形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，電針委中穴能促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-xL表達(dá)，從而阻止細(xì)胞凋亡，以達(dá)到延緩腰椎間盤退變。

Bax在正常情況下位于細(xì)胞漿中，其作用是促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21-22]，作為促凋亡因子家族中的一員，主要是通過與Bcl-2相結(jié)合，期間通過造成兩者比例失衡，從而滅活Bcl-2抗凋亡作用，以達(dá)到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的目的；而在凋亡的整個過程中，既能造成抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)減少，又能促進(jìn)凋亡因子Bax蛋白表達(dá)，致使兩者比例下降[23-25]。本實驗檢測Bax蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，電針委中組與模型組中Bax蛋白表達(dá)較假手術(shù)組有所增高，同時前者促凋亡因子Bax蛋白表達(dá)低于后者且效果明顯(P＜0.05)，并結(jié)合HE染色表達(dá)情況，說明電針委中穴可以抑制腰椎間盤細(xì)胞凋亡，有助于延緩腰椎間盤退變。

綜上所述，電針委中穴可以抑制腰椎間盤退變，其機制可能是與電針委中穴抑制下游的凋亡因子Bax蛋白表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-xL蛋白表達(dá)，從而有效延緩椎間盤退變相關(guān)。

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Effectsof Electroacupuncture atWeizhong on Expression of Bcl-xL and Bax in Ratswith Lumbar Disc Degeneration

HETing-chao1,CHENShao-qing1,LIN Jian-ping2,LIUWu-long1,XIAMeng1,3,WANG Shi-zhong1
1.Fujian University of TraditionalChineseMedicine,Fuzhou,Fujian 350122,China;2.Fujian University of Traditional Chinese Medicine Subsidiary Rehabilitation Hospital,Fuzhou,Fujian 350003,China;3.Fujian Key Laboratory of Rehabilitation Technology,Fuzhou,Fujian 350122,China

Objective To explore the effectof electroacupuncture atWeizhong(BL40)acupointon the expression of Bcl-xL and Bax in ratswith lumbar disc degeneration.Methods Thirtymale adult Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into sham-operated group(n= 10),modelgroup(n=10),and electroacupuncture group(n=10).The lumbar disc degenerationmodelwas established by puncturing the annulus fibrosis in themodel group and electroacupuncture group.Onemonth aftermodeling,the electroacupuncture group was electroacupunctured atWeizhong acupoint for fourweeks.HE staining was used to observe the pathological changes.Immunohistochemical staining was used to observe the expression of Bax in the lumbar disc tissue.Western blotting was used to detect the expression of Bcl-xL and Bax protein.Results HE staining showed that the degrees of lumbar disc degeneration from light to severe was ranged as:the sham-operated group,the electroacupuncture group and themodel group.The expression of Bcl-xL was lower(P＜0.05),and the expression of Bax was higher(P＜0.01)in themodel group than in the sham-operated group,which was opposite(P＜0.01)in the electroacupuncture group than in themodelgroup.Conclusion Electroacuponcture atWeizhongmay upregulate the expression of Bcl-xL and downregulate the expression of Bax in ratswith lumbar disc degeneration.

lumbardisc degeneration;electroacupuncture;Weizhong;apoptosis factor;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.11.005

R681.5

A

1006-9771(2016)11-1264-05

2016-07-08

2016-09-30)

1.國家自然科學(xué)基金項目(No.81303017)；2.福建省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)創(chuàng)新項目(No.2014-CXB-20)。

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州市350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建福州市350003；3.福建省康復(fù)技術(shù)重點實驗室，福建福州市350122。作者簡介：何挺超(1990-)，男，漢族，福建福清市人，碩士研究生，主要研究方向：脊柱疾病康復(fù)的臨床與基礎(chǔ)研究。通訊作者：陳少清(1983-)，男，漢族，福建漳州市人，碩士，講師，主要研究方向：脊柱及骨關(guān)節(jié)病康復(fù)。E-mail:chenshaoqd@163.com。