分子印跡固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定動(dòng)物源性食品中11種β-受體阻斷劑殘留

郝 杰，姜 潔，邵瑞婷，丁學(xué)妍，史 娜，路 勇

(北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評估中心，北京 100041)

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分子印跡固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定動(dòng)物源性食品中11種β-受體阻斷劑殘留

郝 杰，姜 潔*，邵瑞婷，丁學(xué)妍，史 娜，路 勇

(北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評估中心，北京 100041)

建立了一種分子印跡固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法同時(shí)測定動(dòng)物源性食品中11種β-受體阻斷劑殘留量的方法。樣品經(jīng)β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解后，上清液調(diào)節(jié)pH值，以異丙醇-乙酸乙酯(5∶5，體積比)萃取，有機(jī)相吹干后復(fù)溶過分子印跡固相萃取柱凈化。樣品經(jīng)BEH C18色譜柱分離，以甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)進(jìn)行梯度洗脫，電噴霧電離正離子模式下采用多反應(yīng)監(jiān)測，基質(zhì)加標(biāo)曲線定量。11種β-受體阻斷劑在0.05～10 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.991，方法檢出限和定量下限分別為0.02～0.1 μg/kg和0.05～0.25 μg/kg。在豬肉、豬肝基質(zhì)中3個(gè)添加水平下，平均回收率分別為73.2%～108.3%及70.2%～98.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.3%～9.5%及3.7%～9.8%。該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，適用于β-受體阻斷劑多組分殘留的測定。

分子印跡固相萃??；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；β-受體阻斷劑；殘留檢測

β-受體阻斷劑是作用于β-受體，能選擇性地與β-腎上腺素受體結(jié)合，從而拮抗神經(jīng)傳遞質(zhì)和兒茶酚胺對β-受體激動(dòng)作用的一類物質(zhì)[1]。在臨床上，針對冠心病、高血壓、心律失常等心血管系統(tǒng)疾病的治療發(fā)揮著極其重要的作用，是目前應(yīng)用最廣泛的降低心率的藥物之一[2]。但β-受體阻斷劑會(huì)造成對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多方面的副作用，過量使用甚至?xí)鹬卸痉磻?yīng)[3]。

產(chǎn)肉動(dòng)物，特別是畜類動(dòng)物，自身肌體沒有足夠的防御機(jī)制以應(yīng)對運(yùn)往屠宰場途中受到的外界刺激，在運(yùn)輸過程途中可能會(huì)因心力衰竭而死亡[4]。這類現(xiàn)象會(huì)導(dǎo)致肌肉組織中某些代謝通路的改變，另外，在后續(xù)加工當(dāng)中也存在溫度或其他因素的刺激，最終會(huì)導(dǎo)致PSE肉(Pale soft exudative)的產(chǎn)生，俗稱水豬肉、熱霉肉。PSE肉是一種劣質(zhì)豬肉，可帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[5]。為了避免PSE肉的產(chǎn)生，在屠宰前的運(yùn)輸過程中，鎮(zhèn)靜類藥物和β-受體阻斷劑類藥物會(huì)被非法注射到動(dòng)物體內(nèi)，以減少應(yīng)激現(xiàn)象的發(fā)生，而這些藥物往往在屠宰前數(shù)小時(shí)內(nèi)被大劑量直接用藥，因而相對其他獸藥會(huì)造成更高的殘留量和更大的風(fēng)險(xiǎn)危害[6]。另外β-受體阻斷劑也是國際奧林匹克委員會(huì)禁止使用的興奮劑[7]，從食源性興奮劑控制的角度，也需要加大動(dòng)物源性食品中β-受體阻斷劑的嚴(yán)格監(jiān)控。目前國際上針對β-受體阻斷劑卡拉洛爾(Carazolol)在動(dòng)物組織中的殘留限量已有明確要求[8]。

目前，動(dòng)物源性食品中β-受體阻斷劑的相關(guān)研究較少，由于其化合物結(jié)構(gòu)多為堿性中等極性化合物，因此分析手段上常采用離子交換機(jī)理的固相萃取結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)[9-13]。新型的分子印跡固相萃取技術(shù)，結(jié)合了固相萃取的易操作和實(shí)用性以及免疫親和色譜的高選擇性和穩(wěn)定性等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)同一類化合物高效、同步的前處理凈化，特別適用于食品復(fù)雜基質(zhì)中多殘留組分的分析[14-15]。本文建立了分子印跡固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測動(dòng)物源性食品中11種β-受體阻斷劑的分析方法。該方法靈敏，回收率高，穩(wěn)定性好，相比于傳統(tǒng)方法可以達(dá)到更低的檢出限，且更適用于肝臟等復(fù)雜基質(zhì)，可滿足殘留檢測的需要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Acuqity UPLC/Xevo TQ-S，美國Waters公司)；純水儀(Milli-Q，美國Millipore公司)；高速冷凍離心機(jī)(3K18，美國Sigma公司)；分子印跡固相萃取柱(Supelco Supel MIP beta-receptors 25 mg/10 mL，美國Sigma-Aldrich公司)。

拉貝洛爾、倍他洛爾、噴布洛爾、阿替洛爾、比索洛爾、阿羅洛爾、索他洛爾、納多洛爾(CAS:42200-33-9)、奈必洛爾、卡維地洛、美托洛爾(純度≥98%，德國Dr.Ehrenstofer GmbH)；甲醇、乙腈、異丙醇、乙酸乙酯、甲酸(色譜純，美國Thermo Fisher公司)；β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(100 000 Unit/mL，德國Merck公司)；乙酸銨(質(zhì)譜純，美國Sigma-Aldrich公司)；乙酸鈉(色譜純，北京化學(xué)試劑廠)。

所有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用甲醇溶解成1 000 μg/mL的儲備液，保存于-20 ℃冰箱內(nèi)，每半年對其含量進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.2 樣品制備

豬肉及豬肝樣品去除脂肪進(jìn)行均質(zhì)，精確稱取均質(zhì)后的樣品2.00 g于50 mL聚四氟乙烯離心管內(nèi)，加入10 mL 0.2 mol/L的乙酸鈉-乙酸緩沖液(pH 5.2)，充分渦旋均質(zhì)后，加入50 μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，于37 ℃下200 r/min振蕩酶解6 h以上。取出后冷卻至室溫，渦旋后以10 000 r/min離心10 min，取出全部上清液至另一干凈離心管中，用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 11.0，加入10 mL飽和氯化鈉及10 mL異丙醇-乙酸乙酯(體積比5∶5)溶液，充分渦旋提取10 min，于10 000 r/min下離心，取上層有機(jī)相清液在40 ℃下氮?dú)獯蹈?。加? mL 酶解用乙酸鈉-乙酸緩沖液，充分溶解殘?jiān)笊现?/p>

取規(guī)格為25 mg/10 mL的分子印跡柱用3 mL甲醇和3 mL水活化，溶解液全部上柱，控制流速在1滴/s，依次用3 mL水、3 mL 60%的甲醇水溶液和1 mL甲醇淋洗MIP柱，真空負(fù)壓抽干后，用2 mL含1%甲酸的甲醇溶液洗脫，控制流速在1滴/s，收集洗脫液于40 ℃下用微弱氮?dú)饬鞔蹈桑? mL初始比例流動(dòng)相復(fù)溶，過0.2 μm親水性聚丙烯膜，供上機(jī)測定。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件 液相色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：A為甲醇，B為5 mmol/L 乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)；流速：0.45 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。梯度洗脫條件：0～0.5 min，95%～80%B；0.5～1.0 min，80%～60%B；1.0～2.5 min，60%～40%B；2.5～3.0 min，40%B；3.0～3.5 min，40%～1%B；3.5～4.5 min，1%B；4.5～5.0 min，1%～95%B；5.0～6.0 min，95%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正離子模式，毛細(xì)管電壓2.8 kV，離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流量800 L/h，錐孔氣流量150 L/h，霧化氣壓力7.0 bar，碰撞氣流量0.17 mL/min。11種化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 11種β-受體阻斷劑的色譜-質(zhì)譜參數(shù)

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選用BEH C18超高效液相色譜柱作為分離介質(zhì)，對比了甲醇、乙腈與水、0.1%甲酸水溶液、5 mmol/L乙酸銨水溶液及5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)作為流動(dòng)相時(shí)的分離情況。結(jié)果表明，由于11種β-受體阻斷劑均使用正離子模式檢測，在流動(dòng)相中加入酸可有效增強(qiáng)信號響應(yīng)，同時(shí)加入緩沖鹽可以改善峰形。因此，最終選擇甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)作為流動(dòng)相。

圖1 11種β-受體阻斷劑的色譜分離圖(0.5 ng/mL)Fig.1 Chromatogram separation of 11 β-blockers at concentration of 0.5 ng/mL1.sotalol；2.atenolol；3.nadolol；4.arotinolol；5.metoprolol；6.labetalol；7.bisoprolol；8.carvedilol；9.betaxolol；10.nebivolol；11.penbutolol

使用電噴霧質(zhì)譜在正離子掃描模式下，用質(zhì)譜直接進(jìn)樣的方式，分別確定11種β-受體阻斷劑的質(zhì)譜參數(shù)。通過優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓和碰撞能量等參數(shù)，選取響應(yīng)豐度較高的幾個(gè)碎片離子作為子離子。再通過配制空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，排除易受基質(zhì)干擾的碎片，得到2對監(jiān)測離子對，選擇響應(yīng)豐度較高、干擾較少的作為定量離子對。圖1為優(yōu)化條件下11種β-受體阻斷劑的總離子流圖。

2.2 樣品前處理過程的優(yōu)化

β-受體阻斷劑的殘留監(jiān)測通常為痕量測定，前處理方法需達(dá)到濃縮、凈化的效果。吳永寧等[16]對酶解條件進(jìn)行了深入研究，具有較高的參考意義。本文主要對酶解后的提取過程與凈化條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 提取溶劑的選擇 在酶解之后，β-受體阻斷劑在酸性條件下以離子態(tài)游離于緩沖液中，將提取液調(diào)節(jié)至pH值呈堿性，使目標(biāo)化合物的電離平衡向分子方向移動(dòng)，目標(biāo)化合物以不解離的分子狀態(tài)被不互溶的有機(jī)溶劑提取，水相中留下pKa值不相同的其他可溶雜質(zhì)。從提取凈化的策略可知，用于提取的有機(jī)試劑的組成和配比是這一步驟中影響回收率的關(guān)鍵，因此對提取溶劑種類(乙酸乙酯、異丙醇、乙腈)進(jìn)行了優(yōu)化，并考察了其不同比例的提取效率。結(jié)果表明，使用乙腈導(dǎo)致兩相分配不佳。而乙酸乙酯和異丙醇對11種化合物的分配各異，采取不同配比時(shí)所得到的提取效率也不同。進(jìn)一步考察了不同異丙醇-乙酸乙酯比例對11種β-受體阻斷劑的萃取情況，在兼顧所有化合物的原則下，最終使用異丙醇-乙酸乙酯(5∶5)進(jìn)行提取。

2.2.2 凈化條件的選擇 對比了極性分配固相萃取柱(Waters Sep-pak C18，500 mg/6 mL)、親水親脂分配固相萃取柱(Waters Oasis HLB，150 mg/6 mL)、混合強(qiáng)陽離子固相萃取柱(Waters Oasis MCX，150 mg/6 mL)、混合強(qiáng)陽離子固相萃取柱(DikmaProElut PXC，150 mg/6 mL)、分子印跡固相萃取柱(SupelcoSupel MIP beta-receptors，25 mg/10 mL) 5種固相萃取柱的凈化效率。結(jié)果表明，在C18柱及HLB柱上，由于是共價(jià)鍵結(jié)合分配機(jī)理，故回收率不理想。MCX和PXC均基于苯磺酸型強(qiáng)陽離子交換機(jī)理，已有報(bào)道也多使用該類型的固相萃取柱，且大部分化合物能夠達(dá)到凈化效果，但個(gè)別化合物(如索他洛爾)回收率不佳，僅有45.6%。MIP柱具備特異性的β-受體結(jié)構(gòu)，能夠特異性地結(jié)合β-受體阻斷劑中的苯乙醇胺母核，使得MIP柱凈化具有高度專一性和較好的回收率。對比MCX柱及PXC柱，多數(shù)化合物在MIP柱上能夠達(dá)到更好的回收率，11種化合物的回收率均大于75%，同時(shí)在前處理過程中使用低溫和pH值調(diào)節(jié)等步驟也能有效除去脂肪和蛋白質(zhì)的干擾。因此實(shí)驗(yàn)選擇分子印跡固相萃取柱進(jìn)行凈化。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限 在空白樣品中分別添加0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2，5，10 μg/kg的β-受體阻斷劑混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行前處理和測定。以11種β-受體阻斷劑的響應(yīng)峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對應(yīng)濃度(X，μg/kg)為橫坐標(biāo)繪制工作曲線。以3倍信噪比計(jì)算方法檢出限(LOD)，10倍信噪比確定方法定量下限(LOQ)。11種β-受體阻斷劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限、定量下限結(jié)果見表2。各化合物在0.05～10 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)(r2)為0.991 2～0.999 1。各化合物的檢出限和定量下限分別為0.02～0.1 μg/kg和0.05～0.25 μg/kg。

表2 11種β-受體阻斷劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量下限

2.3.2 方法的回收率與精密度 分別取動(dòng)物肌肉、肝臟空白樣品，添加低、中、高3個(gè)不同濃度水平的11種β-受體阻斷劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，優(yōu)化條件下測定目標(biāo)化合物。每個(gè)濃度水平平行測定6次，結(jié)果見表3。11種化合物在豬肉中的平均回收率為73.2%～108.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.3%～9.5%；在豬肝中的平均回收率為70.6%～98.2%，RSD為3.7%～9.8%。其準(zhǔn)確度與精密度能滿足殘留檢測的要求。

表3 11種β-受體阻斷劑的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖2 陽性質(zhì)控樣品的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of positive QC sample

2.4 實(shí)際樣品的測定

隨機(jī)選取市售豬肉、豬肝共10份，同時(shí)做陽性質(zhì)控樣品。應(yīng)用建立的方法對樣品進(jìn)行11種β-受體阻斷劑的測定。結(jié)果在陽性質(zhì)控樣品中檢出卡維他洛0.497 μg/kg(圖2)，其余樣品均未檢出。

3 結(jié) 論

本研究采用分子印跡固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜技術(shù)，建立了豬肉及豬肝中11種β-受體阻斷劑殘留的同時(shí)檢測方法。經(jīng)方法驗(yàn)證，該方法檢出限低、回收率高、精密度好，可用于動(dòng)物源性食品中β-受體阻斷劑的殘留檢測。

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Determination of Eleven β-Blocker Residues in Animal Derived Foods by Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction

HAO Jie，JIANG Jie*，SHAO Rui-ting，DING Xue-yan，SHI Na，LU Yong

(Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring，Beijing 100041，China)

A molecularly imprinted solid phase extraction coupled with ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric (UPLC-MS/MS) method was developed for the determination of eleven beta blocker residues in animal derived foods.The sample was enzymed withβ-glucuronidase/aryl sulfatase.The supernatant fraction was adjusted to the optimal pH value，and then extracted with isopropanol-ethyl acetate (5∶5，by volume).The organic solvent was first evaporated to dryness, and then redissolved，finally purified by molecularly imprinted solid phase extraction.The analyte was separated with a BEH C18column by gradient elution using methanol-5 mmol/L ammonium acetate (containing 0.1% formic acid) as mobile phase，and detected by MS under ESI+ ionization and multiple reactions monitoring mode.The quantification of the analytes was performed by the matrix standard addition method.The limits of detection and limits of quantitation were in the ranges of 0.02-0.1 μg/kg and 0.05-0.25 μg/kg，respectively.The calibration curves of 11β-blockers were linear in the range of 0.05- 10 μg/kg，with correlation coefficients not less than 0.991.Under three spiked levels，the average recoveries of the analytes in pork and liver were 73.2%-108.3% and 70.2%-98.2%，respectively，with relative standard deviations of 1.3%-9.5% and 3.7%-9.8%，respectively.The method is rapid，sensitive and precise，and is suitable for the determination ofβ-blocker multi residues in animal derived foods.

molecularly imprinted solid phase extraction；liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)；β-blocker；residue determination

2016-03-24；

2016-04-18

北京市科技計(jì)劃(Z161100000616007)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.010

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2016)10-1278-05

*通訊作者：姜 潔，博士，高級工程師，研究方向：食品安全，Tel：010-50959673，E-mail：jybjj2004@126.com