加速溶劑萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定沉積物中三苯甲烷類殺菌劑

張蓓蓓,趙永剛

(江蘇省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，國家環(huán)境保護(hù)地表水環(huán)境有機(jī)污染物監(jiān)測(cè)分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210036)

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加速溶劑萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定沉積物中三苯甲烷類殺菌劑

張蓓蓓*,趙永剛

(江蘇省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，國家環(huán)境保護(hù)地表水環(huán)境有機(jī)污染物監(jiān)測(cè)分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210036)

采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)，結(jié)合加速溶劑萃取(ASE)前處理技術(shù)，建立了同時(shí)測(cè)定沉積物中3種三苯甲烷類殘留(孔雀石綠、結(jié)晶紫、亮綠)的方法。干燥研磨后的底泥樣品用中性氧化鋁混合分散，以乙腈-McIlvaine緩沖溶液(體積比10∶2)為萃取液，經(jīng)ASE萃取富集后進(jìn)入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明：3種三苯甲烷類化合物的峰形對(duì)稱并完全分離，在0.5～50.0 μg/L范圍內(nèi)線性良好(r>0.998)；在1 500 psi壓力及60 ℃萃取溫度下，目標(biāo)物的回收率為65.8%～112%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)為5.1%～14.4%，方法檢出限為0.006～0.007 μg/kg，定量下限為0.024 ～0.028 μg/kg。該方法已用于滆湖沉積物中3種目標(biāo)化合物的檢測(cè)，為我國環(huán)境監(jiān)管提供了技術(shù)支撐和數(shù)據(jù)支持。

三苯甲烷類；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)；加速溶劑萃取(ASE)；沉積物

孔雀石綠(Malachite green，MG)、結(jié)晶紫(Crystal violet，CV)和亮綠(Brilliant green，BG)均為三苯甲烷類染料，最初用于紡織工藝中，后因其具有消毒性和殺菌性而廣泛地用于水產(chǎn)品的養(yǎng)殖過程，作為魚病防治的殺菌劑和抗寄生蟲藥，在運(yùn)輸過程中也用作消毒劑，延長魚的存活時(shí)間。該類物質(zhì)被魚類吸收后，大部分會(huì)快速地轉(zhuǎn)化為隱色孔雀石綠(Leucomalachite green，LMG)和隱色結(jié)晶紫(Latent crystal violet，LCV)。由于這些代謝物具有很好的親脂性，因而在魚類的脂肪組織中會(huì)形成穩(wěn)定的殘留，長期存在于生物體內(nèi)[1-2]。研究表明，70%以上的飼料中添加的漁業(yè)養(yǎng)殖用藥都沉積于底棲環(huán)境，從而半衰期延長，危害加大[3]。三苯甲烷類作為工業(yè)染料而產(chǎn)生的廢水可能進(jìn)入地表水。而這類染料吸附性強(qiáng)，更易吸附于沉積物中[4-6]。由于這類物質(zhì)具有致癌、致畸和致突變作用，因此，包括歐美、中國在內(nèi)的國家均將孔雀石綠和結(jié)晶紫列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物。但我國目前對(duì)水環(huán)境中這類殺菌劑并無相關(guān)控制限值，存在環(huán)境監(jiān)管盲點(diǎn)。

目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)三苯甲烷類物質(zhì)的測(cè)定多采用液相色譜法(紫外檢測(cè)、熒光檢測(cè))[7-10]或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[11-19]，且多集中于水產(chǎn)品及水體中MG和CV的檢測(cè)，對(duì)沉積物介質(zhì)的研究較少。文獻(xiàn)[12-14]均采用超聲萃取法對(duì)沉積物中的三苯甲烷類化合物進(jìn)行提取，且主要集中在孔雀石綠和結(jié)晶紫及其代謝產(chǎn)物上，對(duì)亮綠的研究很少。本文首次采用加速溶劑萃取技術(shù)，對(duì)3種目標(biāo)物的同時(shí)萃取進(jìn)行了細(xì)致優(yōu)化，獲得了較好的提取回收率。建立了加速溶劑萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定沉積物中MG,CV和BG的分析方法，并首次報(bào)道了滆湖沉積物中三苯甲烷類化合物的污染狀況，為環(huán)境監(jiān)管提供了一定的技術(shù)支撐和數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備

ACQUITY UPLC超高效液相色譜(美國Waters公司)；AB SCIEX QTRAP 5500 質(zhì)譜儀(美國 AB公司)；加速溶劑萃取儀(Dionex ASE200)；真空冷凍干燥機(jī)(美國Labconco公司)，氮吹濃縮儀(美國Zymark公司)；0.22 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜針頭式過濾器、Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；渦旋混合器(日本LMS公司)。

1.2 試劑與試劑配制

標(biāo)準(zhǔn)品:孔雀石綠(純度98.0%)、結(jié)晶紫(純度92.5%)、亮綠(純度96.0%)、氘代結(jié)晶紫(CV-D6，純度99.0%)均為德國Dr.Ehrenstorfer公司試劑；氘代孔雀石綠(MG-D5，純度99.7%)為德國Witega公司試劑。 乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨(色譜純，德國 Merck公司)；鹽酸羥胺、對(duì)甲苯磺酸(純度>99%，瑞士Adamas公司)；磷酸氫二鈉、檸檬酸(優(yōu)級(jí)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Millipore超純水(TOC<1 ppb)。

標(biāo)準(zhǔn)及內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液(1 000 mg/L)配制：準(zhǔn)確稱取(10±0.1) mg的MG，CV，BG標(biāo)準(zhǔn)品及MG-D5，CV-D6內(nèi)標(biāo)物，用乙腈溶解后定容于10 mL容量瓶中，配制1 000 mg/L的儲(chǔ)備液。以上標(biāo)準(zhǔn)溶液避光保存于4 ℃冰箱中，臨用前稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

McIlvaine緩沖溶液(pH 3.0)：由0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液18.9 mL和0.1 mol/L檸檬酸溶液81.1 mL混合配制。

1.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描方式。離子化電壓(IS)：5 000 V，離子源溫度(TEM)：600 ℃，氣簾氣(CUR)：40 psi，噴霧氣(GS1)：55 psi，輔助加熱氣(GS2)：60 psi，碰撞氣(CAD)：High，駐留時(shí)間20 ms。各物質(zhì)離子對(duì)優(yōu)化后的參數(shù)見表1。

表1 目標(biāo)化合物的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)

* quantitative ion

1.4 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國Waters公司)。流動(dòng)相：5 mmol/L乙酸銨水溶液(甲酸調(diào)至pH 4.5)(A)和乙腈(B)；采用梯度洗脫模式：0 min，20% B，保持0.5 min；0.5～2.9 min時(shí)，線性增至80%B，保持1 min；4 min后恢復(fù)為20% B，平衡1 min結(jié)束。流速0.5 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL；柱溫：50 ℃；內(nèi)標(biāo)法定量。

1.5 樣品處理

用不銹鋼抓斗式采泥器在滆湖采集13個(gè)表層沉積物樣品(0～20 cm)，每個(gè)樣點(diǎn)采集不低于1 kg的泥樣，樣品采集后放入干凈的250 mL棕色玻璃瓶中加蓋密封，立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室于-20 ℃下保存至分析。

沉積物樣品冷凍干燥磨細(xì)后過40目篩，準(zhǔn)確稱量(5.0±0.05) g，與25 g中性氧化鋁攪拌混勻置于ASE萃取池中，加入1 mL 10%鹽酸羥胺溶液、1 mL 1.0 mol/L對(duì)甲苯磺酸溶液，將萃取池置于加速溶劑萃取儀中。萃取溶劑：乙腈-McIlvaine緩沖溶液(10∶2)；壓力：1 500 psi；溫度：60 ℃；時(shí)間：5 min；循環(huán)次數(shù)：2次。萃取液經(jīng)無水硫酸鈉除水后，轉(zhuǎn)移至氮吹管中，用氮吹濃縮儀吹至近干，用乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液(甲酸調(diào)至pH 4.5)溶液(2∶8)定容至1.0 mL，加入10 μL內(nèi)標(biāo)混合溶液(1 000 μg/L)，渦旋振蕩混勻，過0.22 μm PVDF濾膜，置于進(jìn)樣瓶中，采用UPLC-MS/MS測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

在ESI+/-及APCI+/-4種方式下，對(duì)濃度為200 μg/L的3種三苯甲烷類化合物單標(biāo)溶液進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜母離子掃描，結(jié)果表明在ESI正離子模式下3種目標(biāo)物均有較好的響應(yīng)，基峰為[M+H]+，這與3種目標(biāo)物的分子極性較大且均具有銨離子基團(tuán)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)相符。選定[M+H]+為母離子，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，尋找子離子碎片并優(yōu)化相應(yīng)的碰撞能量，三苯甲烷類物質(zhì)的二級(jí)碎片質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 3種三苯甲烷類物質(zhì)的二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖

2.2 加速溶劑萃取條件的優(yōu)化

針對(duì)本實(shí)驗(yàn)，由于空白底泥樣品不易得到，因此在條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中最終選擇中性氧化鋁粉末作為模擬空白底泥樣品，中性氧化鋁粉末中均不含3種目標(biāo)物。配制3種目標(biāo)物加標(biāo)濃度為5.0 μg/kg的模擬加標(biāo)樣，用于以下實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。

2.2.1 分散劑的選擇 加速溶劑萃取時(shí)，需在萃取池中填充分散劑，以使樣品分散，并與萃取溶劑更好地接觸，且分散劑應(yīng)盡量避免對(duì)所測(cè)目標(biāo)化合物產(chǎn)生吸附。本實(shí)驗(yàn)分別選擇硅藻土、石英砂、中性氧化鋁作分散劑，在萃取壓力1 500 psi、萃取溫度60 ℃條件下，以乙腈-McIlvaine緩沖溶液(10∶2)作為萃取劑，考察了分散劑對(duì)目標(biāo)物的吸附情況。結(jié)果表明，選用中性氧化鋁作為分散劑時(shí)，對(duì)沉積物中3種目標(biāo)物的吸附最少，萃取回收率最高。

2.2.2 萃取溶劑的選擇 在萃取壓力1 500 psi、萃取溫度60 ℃條件下，以中性氧化鋁為分散劑，比較了丙酮-甲醇(1∶1)、丙酮-乙腈(1∶1)、二氯甲烷-乙腈(1∶1)和乙腈-McIlvaine緩沖溶液(10∶2)對(duì)底泥樣品中目標(biāo)物的萃取情況。結(jié)果表明，以乙腈-McIlvaine緩沖溶液(10∶2)為萃取溶劑時(shí)，MG，CV和BG的萃取效率最高，其回收率分別為98.0%，74.9%和82.6%。

2.2.3 萃取溫度及萃取壓力的優(yōu)化 在加速溶劑萃取過程中，萃取溫度對(duì)目標(biāo)物的回收率也會(huì)產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)選定萃取溶劑及分散劑后，在萃取壓力為1 000 psi的條件下，選擇不同的萃取溫度(40，50，60，70 ℃)進(jìn)行比較，結(jié)果表明萃取溫度在60 ℃時(shí)3種目標(biāo)物的回收率最好。

進(jìn)一步對(duì)不同萃取壓力(500，1 000，1 500，2 000 psi)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明在1 500 psi壓力條件下，3種目標(biāo)物的萃取效率略優(yōu)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量下限

在上述優(yōu)化條件下，配制濃度分別為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列使用液1.0 mL，分別加入10 μL混合內(nèi)標(biāo)液(1 000 μg/L)，混勻。以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物定量離子的峰面積比(Y)對(duì)待測(cè)物的質(zhì)量濃度(X，μg/L)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，3種目標(biāo)物在0.5～50.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與相應(yīng)峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.998。

根據(jù)HJ168-2010方法檢出限測(cè)定要求，配制濃度為0.05 μg/kg的5 g中性氧化鋁加標(biāo)樣7份。按照樣品分析過程進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算7次平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差S，以3S為方法檢出限(MDL)，4倍MDL為定量下限(LOQ)。結(jié)果表明，MG,CV,BG的MDL分別為0.007，0.006，0.007 μg/kg，LOQ分別為0.028，0.024，0.028 μg/kg。該方法具有較高的靈敏度，完全滿足底泥中三苯甲烷類物質(zhì)的分析測(cè)定要求。

2.4 精密度與回收率

配制低(0.5 μg/kg)、中(5.0 μg/kg)、高(10.0 μg/kg) 3個(gè)濃度水平的沉積物加標(biāo)樣各6份，按上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)。選取的沉積物樣品在加標(biāo)前進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)添加濃度平行測(cè)定6份樣品，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(表2)。結(jié)果表明：3種目標(biāo)物的回收率為65.8%～112%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.1%～14.4%。方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合痕量分析的要求。

表2 沉積物中3種目標(biāo)物的回收率及精密度(n=6)

2.5 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用建立的分析方法，對(duì)滆湖13個(gè)點(diǎn)位的沉積物樣品進(jìn)行分析，3種目標(biāo)物的檢出率均為100%，其中MG的檢出量為0.304～9.54 μg/kg，CV的檢出量為0.619～6.70 μg/kg，BG的檢出量為0.059～1.31 μg/kg。實(shí)際底泥樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見圖2。3種目標(biāo)物在滆湖沉積物中的普遍檢出，可能與滆湖發(fā)達(dá)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)相關(guān)。目前，國內(nèi)違規(guī)使用孔雀石綠和結(jié)晶紫的現(xiàn)象已得到較好控制，但由于其價(jià)格低和效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，仍有少數(shù)漁民在非法使用，再加上曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致部分養(yǎng)殖環(huán)境表層底泥已蓄積了此類殺菌劑，且不斷向水體緩慢釋放，成為其二次污染的主要來源，該現(xiàn)象應(yīng)當(dāng)引起環(huán)境監(jiān)管部門的重視。

3 結(jié) 論

本文建立了ASE/UPLC-ESI/MS/MS同時(shí)分析沉積物中三苯甲烷類殺菌劑的方法，實(shí)際樣品的測(cè)定表明，方法具有靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，完全滿足環(huán)境樣品的監(jiān)測(cè)要求。

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Simultaneous Determination of Three Triphenylmethane Bactericides in Sediment by Accelerated Solvent Extraction and Ultra-performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Bei-bei*,ZHAO Yong-gang

(State Environmental Protection Key Laboratory of Monitoring and Analysis for Organic Pollutants in Surface water,Environment Monitoring Center of Jiangsu Province,Nanjing 210036,China)

An ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method was developed for the analysis of three triphenylmethane bactericides in sediment by accelerated solvent extraction(ASE).The analytes were extracted from the dispersed samples with neutral alumina by ASE using acetonitrile-McIlvaine buffer(10∶2，by volume) as solution.The extract were analyzed by UPLC-MS/MS in multiple reaction monitoring(MRM) mode,quantified by the internal standardization.The calibration curves of three triphenylmethane dyes were linear in the range of 0.5-50.0 μg/L with correlation coefficients more than 0.998.Under the optimal extraction conditions of 60 ℃ temperature and 1 500 psi pressure,the recoveries of three compounds ranged from 65.8% to 112%,with RSDs(n=6) of 5.1%-14.4%.The limits of detection and quantitation were in the range of 0.006-0.007 μg/kg and 0.024-0.028 μg/kg,respectively.The method was successfully used to detect the sediment samples from Gehu Lake.

triphenylmethane;ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);accelerated solvent extraction(ASE);sediment

2016-04-06；

2016-05-05

江蘇省環(huán)境監(jiān)測(cè)基金項(xiàng)目(1305)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.019

O657.63;S482.2

A

1004-4957(2016)10-1328-05

*通訊作者：張蓓蓓，碩士，高級(jí)工程師，研究方向：環(huán)境中有毒有害污染物監(jiān)測(cè)，Tel：025-86575235，E-mail：oviliacpu2003@yahoo.com.cn