微波輔助提取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定人體指甲中14種抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)

馮雪伊,陳 航,沈 敏*,向 平

(1.中國刑事警察學(xué)院 法化學(xué)系，遼寧 沈陽 110854;2.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200063)

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微波輔助提取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定人體指甲中14種抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)

馮雪伊1,2,陳 航2,沈 敏2*,向 平2

(1.中國刑事警察學(xué)院 法化學(xué)系，遼寧 沈陽 110854;2.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200063)

采用微波輔助提取(MAE)與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)，建立了同時(shí)測定人體指甲中14種抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)的分析方法。指甲經(jīng)冷凍研磨后加入內(nèi)標(biāo)溶液，用微波輔助提取。以Allure PFPP苯基柱分離，甲醇(含20 mmol/L乙酸銨)-乙酸銨(20 mmol/L)進(jìn)行梯度洗脫，采用二級(jí)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測14種抗精神失常和安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)及其代謝物。目標(biāo)物在對(duì)應(yīng)含量范圍內(nèi)均線性良好(r2≥0.990)；檢出限為0.1～50 pg/mg；大多數(shù)目標(biāo)物的定量下限為100 pg/mg；日內(nèi)精密度和日間精密度均不大于7.8%；準(zhǔn)確度在±10.16%范圍內(nèi)。對(duì)7例服用部分抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類藥物的患者指甲進(jìn)行分析，目標(biāo)物檢出情況與用藥情況相符。該方法樣品處理簡便、高效、快速且分析準(zhǔn)確、靈敏度高、選擇性好，可用于人體指甲中pg/mg級(jí)抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)的定性定量分析。

微波輔助提取(MAE)；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)；指甲；抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)

新型生物樣品(Alternative specimens)開發(fā)是目前國際法庭科學(xué)界的研究焦點(diǎn)[1]，其中指甲具有取材方便無創(chuàng)、樣品安全清潔、便于保存運(yùn)輸、檢測窗口時(shí)限長、待測目標(biāo)物穩(wěn)定、能反映較長攝藥史等優(yōu)點(diǎn)[2]，具有極高的證據(jù)價(jià)值。在臨床藥理研究等領(lǐng)域，指甲的分析潛力正逐步被挖掘(如體內(nèi)治療藥物監(jiān)測、宮內(nèi)藥物暴露分析等)，尤其在法庭科學(xué)領(lǐng)域中，指甲樣品是涉毒、涉藥案件的新興檢材和研究熱點(diǎn)[3]。本課題組借助豐富的生物樣品分析經(jīng)驗(yàn)和廣泛的案源基礎(chǔ)，在之前的研究中建立了指甲中單個(gè)抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)的多種分析方法[4-6]；并通過與其他傳統(tǒng)生物樣品的對(duì)比分析證明了指甲樣品的優(yōu)勢[5,7]，同時(shí)對(duì)藥物進(jìn)入指甲的機(jī)理進(jìn)行了初探[8]。上述研究成果引起了國際法庭科學(xué)界學(xué)者與專家的關(guān)注[4,9-11]。為進(jìn)一步確定藥物進(jìn)入指甲的機(jī)理、增強(qiáng)指甲的證據(jù)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值以及滿足實(shí)踐檢測的需求，建立指甲中同時(shí)檢測多種目標(biāo)物的系統(tǒng)分析方法具有重要的實(shí)際意義。

抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)能夠影響人的思維、情感和意志等心理過程，繼而改變個(gè)體的行為及活動(dòng)[12]，往往成為不法分子違法犯罪的主要輔助藥物，即藥物輔助犯罪(Drug-facilitated crimes)，如迷奸案件及麻醉搶劫案件[13-16]。同時(shí)，長期服用部分抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生耐藥性和依賴性，過量使用易引起中毒乃至死亡[17]。故此類藥物始終是法庭科學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)研究對(duì)象。然而，指甲中抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)的含量低(痕量級(jí))、極性范圍廣、不同物質(zhì)間存在化學(xué)異質(zhì)性[4]，從而對(duì)分析技術(shù)，尤其是樣品處理技術(shù)提出了挑戰(zhàn)。20世紀(jì)90年代末，本課題組首次將微波照射輔助(Microwave irradiation assisted)技術(shù)引入法醫(yī)學(xué)中的生物樣品分析，有效地提高了氣相色譜樣品預(yù)處理過程中衍生化反應(yīng)的反應(yīng)效能并縮短了反應(yīng)時(shí)間[18]。近年來，這一技術(shù)已成為生物樣品中血液[19]和尿液[20]中藥物分析的熱點(diǎn)技術(shù)，并被稱為微波輔助提取技術(shù)(Microwave-assisted extraction，MAE)。本實(shí)驗(yàn)室在豐富的指甲研究基礎(chǔ)上，首次將MAE運(yùn)用于指甲樣品的樣品處理過程，以期提升和改進(jìn)樣品處理方法，同時(shí)為指甲分析提供多樣化的樣品處理手段，并采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)建立了指甲中14種抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)的同時(shí)分析方法。文中對(duì)方法進(jìn)行了系統(tǒng)和完整的驗(yàn)證，并將方法應(yīng)用于7個(gè)服用抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類藥物的患者的指甲分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RA-E900微波爐(日本三菱集團(tuán))，MD200 樣品濃縮器(杭州奧盛科技公司)；API 4000 QTRAP 三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems公司)；AcquityTMUltra Performance LC超高壓液相色譜儀(美國Waters公司)；6700冷凍研磨機(jī)(美國SPEX CertiPrep公司)；Milli-Q去離子水制備系統(tǒng)(美國Cerilliant公司)。14種抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)：氯氮平、去甲氯氮平、氟哌啶醇、艾司唑侖、三唑侖、α-羥基三唑侖、阿普唑侖、羥基阿普唑侖、硝西泮、7-氨基硝西泮、唑吡坦、多慮平、阿米替林、卡馬西平、氯氮平-d4均購自美國Cerilliant公司；乙腈、甲醇(色譜純，美國Sigma-Aldrich公司)；乙酸銨(色譜純，瑞士Fluka化學(xué)公司)；其他化學(xué)試劑及藥品均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 溶液配制

14種抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)對(duì)照品分別用甲醇制成10 μg/mL的儲(chǔ)備液，氯氮平-d4對(duì)照品用20 mmol/L乙酸銨制成1.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。上?4種儲(chǔ)備液(10 μg/mL)臨用前以甲醇稀釋合并成不同質(zhì)量濃度的14種抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)混合對(duì)照品工作溶液；1.0 μg/mL同位素內(nèi)標(biāo)氯氮平-d4的儲(chǔ)備液用20 mmol/L乙酸銨稀釋成25 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作溶液，于4 ℃保存。

1.3 樣品收集與處理

7份含抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)的陽性指甲樣品來源于服用部分抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類藥物的患者，均為經(jīng)臨床診斷，確需使用該種抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類藥物進(jìn)行治療的患者。7例患者均自述每天口服相應(yīng)劑量藥物，至少6個(gè)月以上。詳細(xì)用藥信息見表1。所有指甲樣品均未經(jīng)過美容處理。在采樣過程中，全部患者均被口頭告知實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，并?jīng)其同意，由患者本人自行采集其已生長出指緣外的多余指甲，采集過程無損無痛。指甲樣品標(biāo)注后室溫保存。采集健康志愿者的空白指甲樣品，采用美容指甲鉗沿指甲邊緣剪下后，保存于潔凈干燥的牛皮紙包中，于室溫下避光保存。

表1 7例服用部分抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類藥物患者的用藥信息

*:unrecorded

指甲樣品置于5 mL具塞玻璃試管中，用水洗滌3次，每次3 min；再用丙酮溶液清洗兩次，每次2 min。取出指甲晾干后冷凍研磨。稱取指甲粉末20 mg于2 mL的Eppendor管中，加入100 μL氯氮平-d4的內(nèi)標(biāo)工作溶液，置于微波爐，700 W加熱處理兩次，每次3 min，中間間隔5 min以使體系冷卻。取出后靜置恢復(fù)至室溫，加入400 μL甲醇，渦旋，12 000 r/min離心30 s。取上層清液于潔凈Eppendor管中，待分析。

1.4 LC-MS/MS條件

1.4.1 液相色譜 液相柱為Resteck Allure PFPP五氟苯基柱(100 mm× 2.1 mm,5 μm)，前接Zorbax Extend-C18Narrow-bore 保護(hù)柱(2.1 mm×12.5 mm,5 μm)；流動(dòng)相為20 mmol/L乙酸銨水溶液(A)與含20 mmol/L乙酸銨的甲醇溶液(B)，梯度洗脫：0～1.0 min，40% A；1.0～1.5 min，40% ～15% A；1.5～4.5 min，15% A；4.5～5.0 min，15%～5% A；5.0～7.5 min，5% A；7.5～9.0 min，5%～40% A，流速0.4 mL/min，柱溫為室溫，進(jìn)樣量10 μL?？偛蓸訒r(shí)間為9 min。

1.4.2 串聯(lián)質(zhì)譜 采用電噴霧電離-正離子模式(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測。操作參數(shù)為：離子噴霧電壓(IS)：5 kV；離子源溫度(TEM)：500 ℃；碰撞氣氮?dú)?CAD)：5 psi(1 psi ≈ 6.9 kPa)；氣簾氣(CUR)：30 psi；霧化氣(GS1)：40 psi；輔助氣(GS2)：60 psi。

1.5 方法評(píng)價(jià)

采用行業(yè)公認(rèn)的方法有效性驗(yàn)證體系[21]，包括選擇性、檢出限、線性方程、準(zhǔn)確度(或偏倚)和精密度?；|(zhì)效應(yīng)參考國際上通行的Matuszewski等[22]提出的方法。

1.5.1 選擇性 分別采用10個(gè)不同來源的空白指甲樣品，按“1.3”方法操作，進(jìn)行LC-MS/MS分析，檢測指甲中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)14種目標(biāo)物是否有干擾。另采用2個(gè)添加內(nèi)標(biāo)的空白指甲樣品，按“1.3”方法操作，進(jìn)行LC-MS/MS分析，檢測內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)內(nèi)標(biāo)是否有干擾。

1.5.2 線性關(guān)系與檢出限 取空白指甲粉末20 mg，加入14種目標(biāo)物的混合對(duì)照品工作溶液，配制成質(zhì)量濃度為0.1～10 000 pg/mg的指甲樣品2份，以氯氮平-d4為內(nèi)標(biāo)，按“1.3”方法處理、分析。以指甲中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，pg/mg)，目標(biāo)物和同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積比(Y)為縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得線性方程。以信噪比值大于3的濃度為檢出限(LOD)，以線性曲線的濃度最低點(diǎn)(RSD≤ 20%)為定量下限(LOQ)。

1.5.3 準(zhǔn)確度與精密度 稱取空白指甲粉末20 mg，添加不同量的混合對(duì)照品溶液，分別配制成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的指甲樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)6份樣品，按照“1.3”方法處理、分析，連續(xù)4 d。準(zhǔn)確度用偏倚度(bias%)表示，日內(nèi)精密度(RSD)和日間RSD計(jì)算公式如下：bias(% )=(X-μ)/μ×100%；日內(nèi)RSD(% )=(Sw/X)×100%；日間RSD(%)=(Sb/X)×100%。其中X為平均濃度，μ為標(biāo)準(zhǔn)添加濃度，Sw和Sb分別為日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差和日間標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5.4 基質(zhì)效應(yīng) 測定14種目標(biāo)物的低、中、高質(zhì)量濃度的指甲樣品各8份，比較其峰面積的平均值。其中目標(biāo)物直接進(jìn)樣分析所得峰面積設(shè)為A，20 mg空白指甲樣品提取后添加對(duì)應(yīng)量的混合對(duì)照品溶液后分析所得峰面積設(shè)為B，基質(zhì)效應(yīng)(ME)按照以下方程計(jì)算[22]：ME(%) =(B/A) ×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法優(yōu)化

2.1.1 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化 國外學(xué)者Fernandez等[23]采用MAE技術(shù)對(duì)毛發(fā)樣本中的阿片類物質(zhì)、可卡因及其代謝物分析進(jìn)行了探索，對(duì)微波輔助提取過程的條件進(jìn)行了多準(zhǔn)則優(yōu)化，結(jié)果表明微波加熱溫度、加熱時(shí)間和釋放溶劑種類及體積對(duì)目標(biāo)物的釋放率、基質(zhì)效應(yīng)等均有影響。在前期研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)分別考察了不同釋放溶劑和微波加熱時(shí)間及溫度(微波功率)對(duì)指甲中各目標(biāo)物釋放率的影響。分別使用甲醇(有機(jī)相)和水(水相)作為釋放溶劑，結(jié)果表明，在微波加熱條件下，甲醇分子偶極矩快速變化，產(chǎn)生的熱效應(yīng)使得甲醇瞬間氣化從而造成一種高壓環(huán)境，故以甲醇為釋放溶劑的MAE處理需特制的耐壓裝置，同時(shí)為保證非常壓環(huán)境下的氣液平衡，釋放溶劑用量也較大；由于水的介電常數(shù)大，作為微波加熱的媒介，具有安全、便捷、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，因此選擇水為釋放溶劑。

進(jìn)一步比較了不同微波能量(500，700，950 W)與不同微波處理時(shí)間(1，2，3，4 min)對(duì)釋放能力的影響。結(jié)果顯示，提高微波能量可有效增強(qiáng)目標(biāo)物的釋放率，延長微波處理時(shí)間也可顯著提升目標(biāo)物的釋放，但部分熱不穩(wěn)定目標(biāo)物在過強(qiáng)的微波能量(950 W)或過長的微波處理時(shí)間下釋放量反而下降，認(rèn)為與熱降解有關(guān)。故選用700 W處理3 min×2次作為本方法的樣品處理?xiàng)l件。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 在Manual Tuning模式下，使用11 plus針式進(jìn)樣泵對(duì)濃度約為100 ng/mL的14種目標(biāo)物的混標(biāo)對(duì)照品甲醇溶液進(jìn)樣，進(jìn)樣速度為10 μL/min，在11 plus針式進(jìn)樣泵流速恒定時(shí)，使用Q1scan掃描模式確定待測目標(biāo)物的母離子碎片，并利用edit ramp功能優(yōu)化DP。利用Product Ion掃描模式得到待測目標(biāo)物的二級(jí)質(zhì)譜圖；根據(jù)其二級(jí)質(zhì)譜圖，選擇3～4個(gè)子離子碎片。使用Mass Frontier 7.0(HighChem,Thermo Fisher,USA)軟件對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行理論裂解，裂解方式遵守分子在質(zhì)譜中的基本裂解規(guī)則和Fragmentation library(2008,HighChem,Thermo Fisher,USA)提供的特殊裂解規(guī)則。優(yōu)化母離子和子離子對(duì)的CE。使用空白添加樣品及空白樣品，按照“1.4.1”的液相色譜條件進(jìn)行模擬分析，剔除可能會(huì)對(duì)實(shí)際樣品分析產(chǎn)生干擾的子離子碎片，最終選定LC-MS/MS行為最優(yōu)的兩個(gè)子離子碎片，與母離子組成供分析使用的特征離子對(duì)。優(yōu)化后的結(jié)果見表2。

表2 14種抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)

2.1.3 色譜條件的優(yōu)化 本研究所涉目標(biāo)物數(shù)量多、目標(biāo)物之間化學(xué)異質(zhì)性明顯，為達(dá)到適宜的分析效果，對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。分別以Resteck Allure PFPP(100 mm× 2.1 mm,5 μm)、Zorbax SB-C18(150 mm× 2.1 mm,5 μm)和IBD(100 mm × 2.1 mm,5 μm) 3種不同色譜保留原理的液相色譜柱對(duì)指甲加標(biāo)樣品進(jìn)行分析。結(jié)果表明，大部分目標(biāo)物在C18和IBD柱上的保留行為集中，難以分離，易受到內(nèi)源性干擾，而PFPP柱上各目標(biāo)物在保證分離的前提下，峰形較好，拖尾現(xiàn)象少，從而提高了分析方法的分離效率和靈敏度。這是由于PFPP柱的鍵合相為丙基五氟苯，能對(duì)堿性化合物有很好的保留，其保留原理與C18及IBD柱有顯著差別，對(duì)待分析目標(biāo)物的pKa等屬性依賴性小，各目標(biāo)物在各自適宜條件下出峰，且響應(yīng)高、峰形好，綜合考慮選用PFPP色譜柱。

考察了甲醇-水體系流動(dòng)相和乙腈-水體系流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈為有機(jī)流動(dòng)相時(shí)，洗脫能力過強(qiáng)，絕大多數(shù)目標(biāo)物集中在1～2.5 min內(nèi)出峰，難以實(shí)現(xiàn)化合物的良好分離；而在甲醇-水體系的流動(dòng)相下，目標(biāo)物能夠較好分離，因此選擇甲醇-水為流動(dòng)相。此外，由于本實(shí)驗(yàn)大部分目標(biāo)物為弱堿性物質(zhì)，在甲醇和水中加入適量乙酸銨，能夠促進(jìn)弱堿性目標(biāo)物的電離，增強(qiáng)離子響應(yīng)，穩(wěn)定峰形，從而提高方法的靈敏度。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 選擇性 多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖表明，10個(gè)不同來源的空白指甲中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾14種目標(biāo)物的測定，2個(gè)不同來源的空白指甲中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾內(nèi)標(biāo)物的測定，具有很好的特異性。圖1為添加對(duì)照品和添加內(nèi)標(biāo)的指甲樣品的總離子流圖。

圖1 添加14種對(duì)照品(A)和添加內(nèi)標(biāo)(B)的指甲樣品的總離子流圖

2.2.2 基質(zhì)效應(yīng) 考察了指甲中14種目標(biāo)物在3種濃度水平下的基質(zhì)效應(yīng)(表3)。結(jié)果表明，大部分目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)在51.0%～124.5%范圍內(nèi)，其中阿米替林、氟哌啶醇、艾司唑侖、α-羥基三唑侖、硝西泮和多慮平的LC-MS/MS分析基本不受指甲基質(zhì)的影響(80%～120%)，氯氮平、三唑侖、阿普唑侖、唑吡坦和卡馬西平受到較弱的基質(zhì)抑制作用(51.0%～79.1%)，去甲氯氮平和α-羥基阿普唑侖受到較弱的基質(zhì)強(qiáng)化作用(122.3%～124.5%)；另外，7-氨基硝西泮的基質(zhì)抑制作用較強(qiáng)(5.0%～9.0%)，說明該方法對(duì)7-氨基硝西泮的基質(zhì)干擾較大。本課題組曾對(duì)毛發(fā)樣品中苯二氮卓類物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)[24]進(jìn)行了研究，與指甲相比，7-氨基硝西泮在毛發(fā)中受到相對(duì)較弱的基質(zhì)抑制作用(52.8%～71.4%)，故指甲基質(zhì)的離子抑制作用是影響7-氨基硝西泮檢出限的主要原因，但考慮到7-氨基硝西泮為硝西泮的主要代謝產(chǎn)物，因此仍將其放入分析物之列。同種基質(zhì)對(duì)不同目標(biāo)物產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)程度不同，因此應(yīng)采用內(nèi)標(biāo)法校正，且盡量采用更有效的樣品凈化方法。

表3 14種抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)

2.2.3 線性關(guān)系與檢出限 指甲中14種目標(biāo)物的濃度線性范圍、回歸方程、回歸系數(shù)和檢出限(LOD)等見表4。結(jié)果表明，14種目標(biāo)物在100 ～10 000 pg/mg(氟哌定醇、唑吡坦和卡馬西平在500～10 000 pg/mg)含量范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r2≥0.990)，LOD為0.1～50 pg/mg。除氟哌定醇、唑吡坦和卡馬西平的定量下限(LOQ)為500 pg/mg以外，其他目標(biāo)物的LOQ均為100 pg/mg。方法具有較高靈敏度，適合指甲中多種抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)的高靈敏檢驗(yàn)。

表4 14種抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)的線性關(guān)系、檢出限及定量下限

2.2.4 準(zhǔn)確度與精密度 指甲中14種目標(biāo)物在3個(gè)添加濃度(500,4 000,8 000 pg/mg)的日內(nèi)精密度、日間精密度與準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)列于表5。所有目標(biāo)物的日內(nèi)精密度與日間精密度均不大于7.8%，準(zhǔn)確度均在±10.16%范圍內(nèi)。由于采用的同位素內(nèi)標(biāo)氯氮平-d4與目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)相近，理化性質(zhì)相似，內(nèi)標(biāo)色譜峰與目標(biāo)物色譜峰相互間無干擾，有效降低了樣品處理和質(zhì)譜電離等過程的隨機(jī)誤差，方法顯示了較好的日內(nèi)、日間精密度及準(zhǔn)確度，可用于對(duì)指甲樣品中14種抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)的定性、定量分析。

表5 14種抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)的精密度和準(zhǔn)確度(%)

(續(xù)表5)

AnalyteIntra?RSD(n=6)Inter?RSD(n=24)Accuracy(Bias，n=6)500pg/mg4000pg/mg8000pg/mg500pg/mg4000pg/mg8000pg/mg500pg/mg4000pg/mg8000pg/mg7?Aminonitrazepam203652585143-0675546Zolpidem4712155431186435-087Doxepin18211356272762-11018Carbamazepine37202147241910214-093

表6 陽性樣品中部分抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)的檢測結(jié)果

+:detected,but blow LOQ;-:not detected

2.3 實(shí)際應(yīng)用

使用本文建立的方法對(duì)7份服用部分抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類藥物患者的陽性指甲樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果列于表6。4例指甲樣品中檢出卡馬西平，含量為LOD(5 pg/mg)～11 750 pg/mg；6例檢出氯氮平，含量為LOD(25 pg/mg)～2 240 pg/mg，其中4例檢出其代謝物去甲氯氮平，含量為LOD(5 pg/mg)～1 705 pg/mg，去甲氯氮平與氯氮平的含量比分別為0.47和0.76；2例檢出阿普唑侖及其代謝物，含量高于檢出限低于定量下限；氟哌啶醇和唑吡坦各有1例檢出，含量均高于檢出限低于定量下限。

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)指甲中氯氮平的檢測進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道[4]，其平均含量為138.3 pg/mg，與本實(shí)驗(yàn)中氯氮平的含量范圍相一致。另有文獻(xiàn)[25]報(bào)道指甲中阿普唑侖的含量為50～500 pg/mg，其中低于100 pg/mg的樣品數(shù)占75%，本文的檢測結(jié)果(阿普唑侖LOQ=100 pg/mg)與文獻(xiàn)基本相符。根據(jù)Pufal等[26]的報(bào)道，手指甲和腳趾甲中氟哌定醇的含量分別為67.3(±6.49) pg/mg和98.9(±9.14) pg/mg；Favretto等[27]測得毛發(fā)中氟哌啶醇的含量為0.37～0.73 ng/mg，其LOQ為0.1 ng/mg；其他樣品如尿和血液[27]中氟哌啶醇的濃度分別為2～21 ng/mL和≤4.9 ng/mL；本實(shí)驗(yàn)指甲樣品檢出氟哌啶醇，但由于氟哌定醇的LOQ(500 pg/mg)較高，無法定量。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已報(bào)道的人體手指甲及腳趾甲中的唑吡坦含量(<1.74 pg/mg和<3.29 pg/mg)[6],認(rèn)為本文研究結(jié)果與其相符；本實(shí)驗(yàn)的指甲樣品檢出唑吡坦，然而其LOQ(500 pg/mg)較高，無法定量。

3 結(jié) 論

本研究建立了微波輔助提取技術(shù)(MAE)以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法同時(shí)分離分析指甲中14種抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)的方法，方法快速簡便，靈敏可靠，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性高。7例抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)服用患者的指甲分析結(jié)果表明，應(yīng)用該法可在患者指甲中檢出卡馬西平、氯氮平、阿普唑侖、氟哌定醇、唑吡坦原藥以及去甲氯氮平、α-羥基阿普唑侖等代謝物成分。MAE技術(shù)在指甲樣品中的成功應(yīng)用說明了其在處理富角蛋白樣品時(shí)的可行性。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步進(jìn)行抗精神失常及安眠鎮(zhèn)靜類物質(zhì)進(jìn)入指甲機(jī)理等研究提供方法學(xué)基礎(chǔ)和技術(shù)平臺(tái)，也為深入研究指甲樣品中毒、藥物分析及其應(yīng)用價(jià)值提供了參考依據(jù)。

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Simultaneous Determination of 14 Antipsychotic and Sedative Substances in Human Nails Using Microwave-assisted Extraction Combined with Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

FENG Xue-yi1,2,CHEN Hang2,SHEN Min2*,XIANG Ping2

(1.Department of Forensic Chemistry,National Police University of China,Shenyang 110854,China;2.Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,Shanghai 200063,China)

A method based on microwave-assisted extraction combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry(MAE/LC-MS/MS) was established for the simultaneous determination of 14 antipsychotic and sedative substances in human nails.About 20 mg of decontaminated and pulverized nail samples was microwave-assistedly extracted for twice in the presence of clozapine-d4 used as the internal standard,and the supernatant was determined by LC-MS/MS using the Allure PFPP column with a mobile phase of methanol(containing 20 mmol/L ammonium acetate)-20 mmol/L ammonium acetate buffer.Multiple reaction monitoring(MRM) mode was used to analyze 14 antipsychotic and sedative substances.Good linearities(r2≥0.990) over the corresponding range were obtained for all the analytes.The limits of detection(LOD) were in the range of 0.1-50 pg/mg and the limits of quantitation(LOQ) were 100 pg/mg for most of the analytes.The deviations of intra- and inter-RSD were not more than 7.8%.Accuracies were within ±10.16%.Positive results were obtained from 7 authentic nail samples,which were in good accordance with the drug administration of the corresponding antipsychotic and sedative substances.The developed method presents a simplified,efficient and rapid procedure for sample preparation,and shows high sensitivity and selectivity,which is suitable for the simultaneous analysis of 14 antipsychotic and sedative substances at pg/mg levels in nail samples.

microwave-assisted extraction(MAE);liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS);nails;antipsychotic and sedative substances

2016-03-18；

2016-05-03

國家級(jí)科研院所公益項(xiàng)目(GY2016Z-1)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81273340)；上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(14DZ2270800)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.003

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2016)10-1233-08

*通訊作者：沈 敏，研究員，研究方向：法醫(yī)毒理學(xué)和法醫(yī)毒物分析，Tel:021-52369419，E-mail:shenm@ssfjd.cn