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    白及種子液體懸浮培養(yǎng)原球莖的研究

    2016-12-01 10:58:52湯興利李林華周義峰陳藝芳
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年29期
    關(guān)鍵詞:原球莖白及白芨

    湯興利, 李林華, 周義峰, 陳藝芳

    (1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),江蘇南京 210095;2.中國科學(xué)院南京分院東臺灘涂研究院,江蘇鹽城 224200;3.安徽中醫(yī)藥高等??茖W(xué)校,安徽蕪湖 241003;4.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所,江蘇南京 210014)

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    白及種子液體懸浮培養(yǎng)原球莖的研究

    湯興利1,2, 李林華3, 周義峰2,4, 陳藝芳1

    (1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),江蘇南京 210095;2.中國科學(xué)院南京分院東臺灘涂研究院,江蘇鹽城 224200;3.安徽中醫(yī)藥高等??茖W(xué)校,安徽蕪湖 241003;4.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所,江蘇南京 210014)

    [目的]研究白及種子在液體懸浮培養(yǎng)條件下萌發(fā)的最佳條件,為快速繁殖白及幼苗提供技術(shù)支撐。[方法]研究不同光照條件、不同培養(yǎng)基和不同激素及濃度對白及種子萌發(fā)的影響。[結(jié)果]黑暗有利于白及種子萌發(fā),1/2 MS適宜作為白及種子萌發(fā)基本培養(yǎng)基。植物激素對白及種子無菌萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用,其中,添加1.0 mg/L NAA對白及萌發(fā)促進(jìn)效果最明顯。[結(jié)論]在黑暗條件下,以1/2 MS+1.0 mg/L NAA為萌發(fā)培養(yǎng)基,白及種子萌發(fā)率高,萌發(fā)整齊一致,且原球莖生長速度一致。

    白及;懸浮培養(yǎng);原球莖

    白及[Bletillastriata(Thunb.) Reichb. f.]為蘭科白及屬多年生宿根草本植物[1],形態(tài)優(yōu)美,具有很高的藥用價值和觀賞價值。白及在自然狀態(tài)下主要采用分株繁殖,繁殖系數(shù)較低;雖然能產(chǎn)生大量種子,但白及是無胚乳種子,在自然條件下不易發(fā)芽。由于白及繁殖率低,無法適應(yīng)規(guī)?;N植的需求[2-5]。目前針對白及繁殖的研究主要集中于種子無菌輔助育苗和組織培養(yǎng),該技術(shù)可以在短時間內(nèi)得到大量的實生苗,是白及生產(chǎn)上快速有效的途徑[6-10]。

    目前白及組織培養(yǎng)大多選用固體培養(yǎng)基,即將白及種子輕輕抖落在培養(yǎng)基表面,但由于白及種子呈粉末狀,非常細(xì)小,操作時難以保證每個種子都能充分接觸培養(yǎng)基,造成不同種子生長條件差異較大。同時由于白及種子細(xì)小,在固體培養(yǎng)基上播種時易將種子撒到一起導(dǎo)致種子萌發(fā)后過于密集,而幼苗在轉(zhuǎn)接過程需要進(jìn)行單株分離,過于密集會增加分離轉(zhuǎn)接的難度,轉(zhuǎn)接時易對幼苗造成二次傷害。筆者利用液體培養(yǎng)的方式對白及種子進(jìn)行懸浮培養(yǎng)得到原球莖的方法進(jìn)行研究,該方法可以讓白及種子充分和液體培養(yǎng)基接觸,并通過振蕩培養(yǎng)的方式使白及種子充分分開,不會結(jié)成團(tuán)塊,后期轉(zhuǎn)接時容易分離,不會對白及幼苗造成二次傷害。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料 白及蒴果由安徽省蕪湖市安徽中醫(yī)藥??茖W(xué)校李林華老師提供,果實采集于安徽蕪湖市南陵縣丫山,經(jīng)鑒定為蘭科植物白及[Bletillastriata(Thunb.)Reichb. f.]的干燥成熟蒴果。試驗于2014年9月至2016年6月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院組培中心進(jìn)行。

    1.2 主要儀器 FA1104分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司),HS-1300-U超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),HV85全自動高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司),HY-8(A) 大容量振蕩器(江蘇盛藍(lán)儀器有限公司),奧林巴斯光學(xué)顯微鏡CX23(北京瑞科中儀科技有限公司)。

    1.3 試驗方法 白及蒴果采集后,于4 ℃冰箱貯藏,接種前從冰箱取出后用洗滌劑漂洗蒴果表面10~20 min,再用流水沖洗30 min。在超凈工作臺上用75%乙醇浸30 s,無菌水沖洗后經(jīng)5%NaClO溶液消毒10 min,期間不停搖動,無菌水沖洗3~4遍,無菌濾紙吸干白及蒴果表面水分。用剪刀將蒴果頂端剪開,將種子抖落在不同處理液體培養(yǎng)基中。

    液體培養(yǎng)基高溫滅菌前調(diào)pH至5.6~5.8,121 ℃下滅菌30 min,每個處理接種5瓶,每瓶300~500粒種子。暗培養(yǎng)是將接種白及種子的液體培養(yǎng)瓶置于黑暗條件下培養(yǎng)并觀察試驗結(jié)果,其余處理的光照周期均為12 h/d,光照強(qiáng)度2 000~2 500 lx,培養(yǎng)溫度均為(25±1)℃。將接種白及種子的液體培養(yǎng)瓶置搖床上振蕩,防止白及種子在營養(yǎng)液中結(jié)塊,搖床振蕩頻率為100 r/min。

    1.4 觀測項目與方法 白及種子接種于液體培養(yǎng)基后觀察白及種子萌發(fā)情況和種子發(fā)芽率,根據(jù)發(fā)芽情況分為5級:+表示少數(shù)種子萌發(fā)且顏色淡黃綠色;++表示少于50%的種子萌發(fā),少數(shù)種子冒尖且顏色黃綠色;+++表示約50%的種子萌發(fā)冒尖轉(zhuǎn)綠;++++表示約75%的種子萌發(fā),芽顏色鮮綠,種子中部膨大成球狀;+++++表示約90%的種子萌發(fā)出芽,顏色翠綠且多數(shù)膨大成球狀。

    原球莖長度和粗度測定:將萌發(fā)的白及種子在無菌條件下隨機(jī)取樣置于光學(xué)顯微鏡下觀察并測量白及原球莖的莖粗和芽長度,按照傳統(tǒng)方法將物鏡測微尺和目鏡測微尺配合使用[11]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同激素條件對白及種子發(fā)芽的影響 由表1可知,白及種子接種后45 d,各液體培養(yǎng)基中白及種子均可達(dá)到4級以上。與1/2 MS培養(yǎng)基相比,添加1.0 mg/L NAA顯著提高白及種子發(fā)芽率,并能促進(jìn)白及組培苗生長。以1/2MS為基本培養(yǎng)基時,白及種子發(fā)芽速度快且一致,表明其生活力更旺盛;以MS為基本培養(yǎng)基有利于白及芽伸長,促進(jìn)其快速生長。懸浮培養(yǎng)30 d種子發(fā)芽情況見圖1。

    表1 不同處理對白及種子萌發(fā)的影響

    Table 1 Effects of different treatments on the seed germination ofB.striata

    培養(yǎng)基Culturemedium發(fā)芽情況Germinationsituation15d30d45d1/2MS++++++++1/2MS+0.5mg/LNAA+++++++++1/2MS+1.0mg/LNAA++++++++++++++1/2MS+1.5mg/LNAA+++++++++++MS++++++++MS+0.5mg/LNAA+++++++MS+1.0mg/LNAA++++++++++++MS+1.5mg/LNAA++++++++++

    圖1 白及種子懸浮培養(yǎng)30 d表現(xiàn)Fig. 1 Performance of B. striata seeds under suspension culture for 30 d

    2.2 不同光照條件對白及種子發(fā)芽的影響 將白及種子消毒后接種于1/2 MS+1.0 mg/L NAA培養(yǎng)基中,于黑暗和光照條件下培養(yǎng),30 d后取樣觀察,結(jié)果見表2和圖2。由表2和圖2可知,黑暗條件更有利于白及種子發(fā)芽,光照條件下白及發(fā)芽率約80%,比黑暗條件下的發(fā)芽率低20%左右。同時,光照對白及原球莖的形成和早期生長也有明顯的抑制作用。光照條件下,白及原球莖的長度、粗度僅為黑暗條件的30%和60%左右。因此,推測在外源激素和營養(yǎng)充足的條件下,光照條件雖然不是白及發(fā)芽及早期生長的決定性因子,但對其形成和生長性能產(chǎn)生重要影響,黑暗條件更有利于白及種子發(fā)芽、原球莖形成與生長。

    表2 不同光照條件下白及發(fā)芽情況

    注:a.黑暗條件下;b.光照條件下。Note: a. Dark condition; b. Light condition.圖2 白及種子發(fā)芽情況Fig. 2 Germination situation of B. striata seeds

    2.3_left不同激素及濃度對白及種子形成原球莖的影響 將白及種子消毒后接種于不同液體培養(yǎng)基中,于黑暗條件下培養(yǎng)30 d,結(jié)果見表3。由表3可知,不同培養(yǎng)基配方對白及種子萌發(fā)率和原球莖形成均有較大影響。6-BA明顯抑制白及芽的伸長生長,對白及原球莖的增粗生長也有較明顯的抑制作用。因此,在白及種子萌發(fā)過程中無須添加6-BA。最有利于白及種子萌發(fā)形成健康幼苗的最佳培養(yǎng)基是1/2MS +1.0 mg/L NAA。

    表3 不同濃度激素對白及幼苗生長的影響

    3 結(jié)論與討論

    蘭科植物種子細(xì)小,成熟時種皮細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器退化消失,成為死細(xì)胞[12]。白及胚發(fā)育不完全,缺乏供給營養(yǎng)成分的胚乳,在自然條件下難以萌發(fā)。而無菌培養(yǎng)白及種子,必須提供其萌發(fā)所需的各種物質(zhì)。該研究表明,1/2 MS作為種子萌發(fā)培養(yǎng)基可以提高其發(fā)芽勢,高濃度鹽離子影響細(xì)胞滲透勢導(dǎo)致白及胚在吸水時膨脹速度較慢,故建議白及種子在萌發(fā)初期采用1/2MS培養(yǎng)基,且節(jié)省培養(yǎng)基成本。白及在萌發(fā)過程中添加一定的生長素有利于啟動萌發(fā),而6-BA在白及種子萌發(fā)過程中會增加細(xì)胞的分裂作用,顯著增加白及數(shù)量,但明顯抑制原球莖的增大和芽的伸長,而白及種子數(shù)量很多,并不是限制白及育苗的關(guān)鍵因素。因此,在白及種子液體發(fā)芽體系中不建議添加6-BA。

    該研究發(fā)現(xiàn),黑暗條件有利于白及種子萌發(fā)。在黑暗條件下培養(yǎng)的白及種子萌發(fā)率相對較高,且芽生長速度明顯高于光照條件下。綜合考慮,在黑暗條件下,以1/2 MS+1.0 mg/L NAA為萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得白及原球莖。白及種子萌芽初期細(xì)小,不宜轉(zhuǎn)接,因此,可以在培養(yǎng)瓶中直接添加營養(yǎng)液的方式解決白及原球莖對營養(yǎng)消耗的補(bǔ)充。該試驗對白及種子在液體條件下無菌萌發(fā)進(jìn)行研究,能夠形成健壯一致的原球莖,為快速生產(chǎn)白及無菌苗提供有效的技術(shù)參數(shù),為推動白及種苗規(guī)?;a(chǎn)奠定堅實基礎(chǔ)。

    [1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志:第18卷[M].北京:科學(xué)出版社,1999.

    [2] 張亦誠.白芨的生物特性及栽培技術(shù)[J].農(nóng)業(yè)科技與信息,2007(11):45.

    [3] 韓學(xué)儉.白芨藥用及其栽培技術(shù)[J].農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與科技,2004(10):31-32.

    [4] 陸善旦.白及種植技術(shù)[J].農(nóng)村新技術(shù),2008(19):4-5.

    [5] 李偉平,何良艷,丁志山.白芨的應(yīng)用及資源現(xiàn)狀[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2012, 30(1):158.

    [6] 汪計珠,丁家宜,邊可庚.白及的組織培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊,1982(2):37.

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    Fluid Suspension Culture ofBletillastriata(Thunb.) Reichb. f. Protocorm

    TANG Xing-li1,2, LI Lin-hua3, ZHOU Yi-feng2,4et al

    (1. Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu 210095; 2. Dongtai Institute of Tidal Flats, Nanjing Branch of Chinese Academy of Sciences, Yancheng, Jiangsu 224200; 3. Anhui College of Traditional Chinese Medicine, Wuhu, Anhui 241003; 4. Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing, Jiangsu 210014)

    [Objective] To research the optimum germination condition for liquid suspension culture ofBletillastriata(Thunb.) Reichb. f. seeds, and to provide technological supports for the rapid propagation ofB.striataseedlings and saving its resources. [Method] The effects of different light conditions, culture mediums and the hormone types and concentrations on the germination ofB.striataseeds were investigated. [Result] Dark culture was beneficial to the germination ofB.striataseeds, and the medium of 1/2 MS was a proper basic medium for the seed germination. In addition, plant hormones could promote the seeds germination, among them, adding 1.0 mg/L NAA in the medium was the most effective. [Conclusion] Under dark culture, with 1/2 MS+1.0 mg/L NAA as a germination medium, theB.striataseeds have a high germination rate and orderly germination, and the protocorm has a consistent growth rate.

    Bletillastriata(Thunb.) Reichb. f.; Liquid suspension culture; Protocorm

    江蘇省產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新資金前瞻性研究項目(BY2014116)。

    湯興利(1974- ),女,湖北浠水人,講師,碩士,從事藥用植物資源開發(fā)利用研究。

    2016-08-29

    S 188

    A

    0517-6611(2016)29-0151-03

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