利用谷氨酸棒桿菌轉(zhuǎn)化法合成4-羥基異亮氨酸

溫 冰，張成林，麻 杰，陳鵬杰，謝希賢，徐慶陽(yáng)，陳 寧

（代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

利用谷氨酸棒桿菌轉(zhuǎn)化法合成4-羥基異亮氨酸

溫 冰，張成林，麻 杰，陳鵬杰，謝希賢，徐慶陽(yáng)，陳 寧

（代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

4-羥基異亮氨酸（4-hydroxyisoleucine，4-HIL）具有葡萄糖依賴的促進(jìn)胰島素分泌的活性，在 L-異亮氨酸（L-isoleucine，L-Ile）生產(chǎn)菌株谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）YILW 中過(guò)表達(dá)來(lái)源于蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）TCCC11826的L-異亮氨酸羥化酶（L-isoleucine dioxygenase，IDO）編碼基因ido，以期利用微生物轉(zhuǎn)化法合成 4-HIL，并研究α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）和 Fe2+添加量對(duì)菌株合成 4-HIL的影響.結(jié)果表明：構(gòu)建的C. glutamicum YILW-IDO菌株能夠表達(dá)出有活性的IDO，并能夠利用菌體自身合成的L-Ile以及培養(yǎng)基中的α-酮戊二酸合成4-HIL.此外，α-酮戊二酸和Fe2+均能影響4-HIL的合成，在其添加量分別為40，mmol/L和4，mmol/L條件下，培養(yǎng)50，h，4-HIL產(chǎn)量達(dá)（35.7±1.0）mmol/L.本研究可為4-HIL及氨基酸衍生物的生物制造提供理論依據(jù).

4-羥基異亮氨酸；L-異亮氨酸羥化酶；谷氨酸棒狀桿菌；微生物轉(zhuǎn)化

4-羥基異亮氨酸（4-hydroxyisoleucine，4-HIL）是一種自然界存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，主要存在于胡蘆巴屬植物種子中［1］.研究表明4-HIL具有葡萄糖依賴的促進(jìn)胰島素分泌的活性，當(dāng)葡萄糖濃度高于8.3，mmol/L時(shí)4-HIL能夠明顯促進(jìn)胰島素分泌，且該活性隨血糖濃度的升高而增強(qiáng)，但當(dāng)葡萄糖濃度低于該值時(shí)，4-HIL無(wú)此活性.此外，4-HIL還具有加速脂肪代謝、降血脂和保護(hù)肝功能的作用［2-6］，可見(jiàn)4-HIL具有廣泛的應(yīng)用前景和市場(chǎng)需求.

4-HIL的合成方法包括提取法、化學(xué)合成法和酶法，目前主要采用提取法工業(yè)化生產(chǎn) 4-HIL.此方法獲得的4-HIL構(gòu)型較多，但僅（2S，3R，4S）-4-HIL具有上述生物學(xué)活性，從而使得該方法存在提取率低（僅為 0.091%～0.60%，）、分離純化困難、原材料需求量大、成本高等不足［3，7］.因此利用 L-異亮氨酸羥化酶（L-isoleucine hydroxylase，IDO）特異性合成（2S，3R，4S）-4-HIL是較為理想的方法.

Haefelé等［8］在胡蘆巴種子中發(fā)現(xiàn)可將L-異亮氨酸（L-isoleucine，L-Ile）轉(zhuǎn)化為（2S，3R，4S）-4-HIL的活性成分，但未見(jiàn)將其分離純化的報(bào)道.Ogawa等［1］在蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）中發(fā)現(xiàn)了能特異性地催化 L-Ile生成（2S，3R，4S）-4-HIL的IDO，為4-HIL的生物法合成奠定了基礎(chǔ)［9］.

在前期研究中，本研究室從蘇云金芽胞桿菌（B.thuringiensis）TCCC11826基因組克隆了 IDO編碼基因ido，其表達(dá)產(chǎn)物能夠特異性地催化L-Ile生成（2S，3R，4S）-4-HIL，最適反應(yīng)溫度和 pH分別為35，℃和 7.0，可見(jiàn)該酶反應(yīng)條件溫合，比較適合用于生物法合成 4-HIL［9］.序列分析結(jié)果表明，該 IDO含有His1-X-Asp-Xn-His2基序，屬于Fe2+和α-KG依賴型羥化酶家族.因此前期在酶催化以及利用大腸桿菌（Escherichia coli）W3110進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化合成 4-HIL時(shí)需加入底物L(fēng)-Ile和α-KG以及FeSO4［9］.

本文在前期研究基礎(chǔ)上以L-Ile生產(chǎn)菌株谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）YILW 為出發(fā)菌株，過(guò)表達(dá) ido基因，構(gòu)建 4-HIL生產(chǎn)菌株YILW-IDO，以期利用 YILW-IDO自身合成的 L-Ile及外源添加α-KG和 Fe2+實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化法合成 4-HIL.在此基礎(chǔ)上研究α-KG和 Fe2+添加量對(duì)重組菌株合成4-HIL的影響.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（E.coli）DH5α、L-Ile生產(chǎn)菌株谷氨酸棒狀桿菌（C. glutamicum）YILW（LeuL+AHVr+SGr+ Leu-MEr）以及質(zhì)粒 pXMJ19（Cmr）和 pMD-ido為模板（ido基因經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化）均由本實(shí)驗(yàn)室保藏.

1.1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母提取物5.0， NaCl 10.0，pH 7.0～7.2，121，℃高壓蒸汽滅菌20，min.

LBG培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，葡萄糖5.0，pH 7.0～7.2，115，℃高壓蒸汽滅菌15，min.

BHIS培養(yǎng)基（g/L）：腦心浸提物 37.0，山梨醇9.1，葡萄糖 0.5，pH 7.0～7.2，115，℃高壓蒸汽滅菌15，min.

發(fā)酵培養(yǎng)基［10］（g/L）：葡萄糖80.0，（NH4）2SO45.0，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.015，KH2PO4·3H2O 1.5，維生素 B10.015.玉米漿 35.0 mL/L，pH 7.0～7.2，115，℃高壓蒸汽滅菌15，min.

1.1.3主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4，DNA 連接酶、Ex Taq DNA聚合酶，寶生物工程（大連）有限公司；PCR產(chǎn)物回收及質(zhì)粒提取試劑盒，北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司；（2S，3R，4S）-4-HIL，美國(guó) Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒pXMJ-ido的構(gòu)建

以質(zhì)粒 pMD-ido為模板，利用引物 HIL-F（5′-GCGAAGCTT AGAAAGGTGTGTTTCACCC-3′）和HIL-R（5′-GCGGGATCCTTACTTGGTCTCCTTGTA GG-3′）以及 Ex Taq PCR試劑盒擴(kuò)增其 ido基因.PCR條件：94，℃ 5，min，1個(gè)循環(huán)；94，℃ 30，s、56，℃ 30，s、72，℃ 1，min，30個(gè)循環(huán)；72，℃ 10，min，1個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系為50，μL.PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%，瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收.

目的產(chǎn)物回收后經(jīng) Hind，Ⅲ和 BamHⅠ酶切、電泳、切膠回收后連接至經(jīng)相同酶切的表達(dá)載體pXMJ19上并轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中.經(jīng)LB液體培養(yǎng)基活化后涂布于含氯霉素（30，μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基.過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落，利用引物HIL-F和HIL-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性菌株接入含氯霉素（30，μg/mL）的 LB液體培養(yǎng)基.經(jīng) 37，℃、220，r/min振蕩培養(yǎng)24，h后提取質(zhì)粒，利用引物HILF和HIL-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并分別利用Hind，Ⅲ單酶切以及Hind，Ⅲ和BamHⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證.將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pXMJ-ido.

1.2.2YILW-IDO的構(gòu)建

取5，ng重組質(zhì)粒pXMJ-ido電轉(zhuǎn)化至YILW感受態(tài)細(xì)胞（2.5，kV，25，μF，200，?，2，mm電擊杯），經(jīng)BHIS培養(yǎng)基37，℃活化1，h后，取200，μL涂布于含氯霉素（10，μg/mL）的 BHIS固體培養(yǎng)基上，于 32，℃倒置培養(yǎng)36，h.挑取單菌落接種至裝有5，mL含氯霉素（10，μg/mL）BHIS液體培養(yǎng)基的搖管中，于 37，℃220，r/min振蕩培養(yǎng) 48，h.離心收集菌株提取其質(zhì)粒并利用Hind，Ⅲ單酶切及Hind，Ⅲ和BamHⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng) 1.5%，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證.將驗(yàn)證正確的重組菌株命名為YILW-IDO.

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）

將YILW-IDO種子培養(yǎng)物以10%，的接種量接種至 LB液體培養(yǎng)基中，32，℃、200，r/min振蕩培養(yǎng)至A600=0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為 0.2，mmol/L 異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）繼續(xù)培養(yǎng) 4，h.根據(jù)ido及C.glutamicum ATCC13032 16S rDNA（內(nèi)參）基因序列利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)用于Real-time PCR 引物IDO-1（5′-GGTAAAGTTAGACAGTTC CATAGCA-3′）和 IDO-2（5′-CAAATAGGTGAACTA AAAGATGGTC-3′）以及16S-F（5′-AGAACCACCGC CTGCTCACC-3′）和 16S-R（5′-CCGTCGTCGTAGTT GTACTCCTTG-3′）分別采用 Trizol和 Prime Script TMRT試劑盒提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA.然后采用SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ熒光定量PCR 試劑盒及Real-time PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè).PCR反應(yīng)程序：95，℃預(yù)變性30，s，1 個(gè)循環(huán)；95，℃變性5，s，60，℃退火和延伸共34，s，40 個(gè)循環(huán).采用2-ΔΔCT相對(duì)定量法［11］分析 ido的轉(zhuǎn)錄水平，以未經(jīng) IPTG誘導(dǎo)的YILW-IDO為對(duì)照.

1.2.4IDO活性檢測(cè)

收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體用PBS緩沖液重懸浮，經(jīng)超聲破碎儀超聲破碎（功率 350，W，工作時(shí)間 5，s，間隔時(shí)間 10，s，5 個(gè)循環(huán)，于冰上操作）后 5，000，g離心5，min.取上清液20，μL至PBS緩沖液（含終濃度為 30，mmol/L α-KG、30，mmol/L L-Ile、1，mmol/L FeSO4、1，mmol/L 維生素 C）中，反應(yīng)體系為 1，mL，于30，℃反應(yīng)1，h后加入10，μL乙酸終止反應(yīng)［12］.采用高效液相色譜測(cè)定4-HIL含量，酶活性以每毫克總蛋白每分鐘內(nèi)催化生成 4-HIL的量計(jì)算，單位為nmol/（min·mg）.

1.2.5YILW-IDO搖瓶發(fā)酵

分別將含質(zhì)粒pXMJ19的 C. glutamicum YILW（YILW-pXMJ19，對(duì)照組）及重組菌株YILW-IDO（實(shí)驗(yàn)組）經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后接種至 LB液體培養(yǎng)基中，于32，℃、200，r/min振蕩培養(yǎng)15，h，使A600=1.2～1.6.將種子培養(yǎng)物以 10%，的接種量接種至含有30，mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的 500，mL擋板瓶中，于 32，℃、200，r/min振蕩培養(yǎng)至 A600=0.6～0.8時(shí)，加入IPTG（終濃度為 0.2，mmol/L），同時(shí)加入α-KG 和FeSO4（終濃度分別為 30，mmol/L和 2，mmol/L）繼續(xù)發(fā)酵至50，h，檢測(cè)發(fā)酵液中4-HIL的濃度.發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加10%，的尿素，維持發(fā)酵液pH 6.7～7.0.

在 FeSO4終濃度為 2，mmol/L條件下，考察 0、30、35、40、45、50，mmol/L α-KG 對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響.在α-KG 終濃度為 30，mmol/L條件下，考察 0、1、2、3、4、5、6，mmol/L Fe2+對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響.在α-KG 終濃度分別為0、30、35、40、45、50，mmol/L條件下，考察1、2、3、4、5、6，mmol/L Fe2+對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響，以研究α-KG與Fe2+的交互作用.

1.2.64-HIL的檢測(cè)

將IDO反應(yīng)液或發(fā)酵液于8，000，g離心5，min后取上清液，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為0.8%，的2，4-二硝基氟苯衍生后采用高效液相色譜測(cè)定 4-HIL含量，檢測(cè)條件為：Agilent C18（150，mm×4.6，mm，5，μm），采用乙腈/醋酸鈉二元梯度洗脫，柱溫 33，℃，檢測(cè)波長(zhǎng)360，nm［13］.

1.3數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行并重復(fù)3次，利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理.采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析α-KG與Fe2+的交互作用.

2　結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒pXMJ-ido的構(gòu)建

經(jīng)篩選挑取陽(yáng)性菌落活化后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖 1所示.經(jīng) Hind，Ⅲ單酶切獲得約7，000，bp的片段，經(jīng) Hind，Ⅲ和 BamHⅠ雙酶切獲得約6，600，bp及750，bp的片段，與重組質(zhì)粒、pXMJ19以及ido分子質(zhì)量接近（分別為7，300，bp、6，574，bp和723，bp），證明 ido基因已成功連接到表達(dá)載體上.將重組質(zhì)粒命名為pXMJ-ido.

2.2YILW-IDO菌株的構(gòu)建

提取重組質(zhì)粒 pXMJ-ido并電轉(zhuǎn)化至 C. glutamicum YILW 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)篩選、活化后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖 2所示.經(jīng) Hind，Ⅲ單酶切獲得約7，000，bp的片段，經(jīng)Hind，Ⅲ和BamHⅠ雙酶切獲得約 6，600，bp及 750，bp的片段與重組質(zhì)粒、pXMJ19以及ido接近，表明重組菌株構(gòu)建成功，將其命名為YILW-IDO.

圖1　ido PCR擴(kuò)增及 E.，coli DH5α中質(zhì)粒 pXMJ-ido酶切驗(yàn)證Fig.1 ido PCR products and identification of recombined pXMJ-ido plasmids in E.，coli DH5α digested by restricted endonuclease

圖2　菌株YILW-IDO中質(zhì)粒pXMJ-ido酶切驗(yàn)證Fig.2 Identification of recombined pXMJ-ido plasmids in YILW-IDO strain digested by restricted endonuclease

2.3重組菌株 YILW-IDO中 ido轉(zhuǎn)錄水平及 IDO活性測(cè)定

分別提取未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)（對(duì)照組）及經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的 YILW-IDO（實(shí)驗(yàn)組）總 RNA并測(cè)定其轉(zhuǎn)錄水平.結(jié)果表明，經(jīng)誘導(dǎo)后YILW-IDO中ido的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量為（31.6±0.5），表明該基因能夠于谷氨酸棒桿菌C.glutamicum YILW中成功轉(zhuǎn)錄.收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的YILW-IDO細(xì)胞，超聲破碎并離心后取上清液，測(cè)定 IDO活性，以含質(zhì)粒 pXMJ19的 C.glutamicum YILW為對(duì)照.結(jié)果顯示，YILW-IDO破碎液IDO比活力達(dá)（1.1±0.3）nmol/（min·mg），表明該 ido基因可在YILW-IDO中表達(dá)出具有活性的酶.

2.4利用重組菌株YILW-IDO轉(zhuǎn)化法合成4-HIL

分別將 YILW-pXMJ19（對(duì)照組）及重組菌株YILW-IDO（實(shí)驗(yàn)組）于含有 30，mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的500，mL擋板瓶中發(fā)酵培養(yǎng) 50，h，測(cè)定其 L-Ile和 4-HIL濃度，結(jié)果如圖 3所示.YILW-IDO可積累 4-HIL達(dá)（13.7±0.4）mmol/L，同時(shí)生成 L-Ile（26.5± 0.5）mmol/L；而對(duì)照組僅積累L-Ile（39.1±1.2）mmol/L，未檢測(cè)到4-HIL.

圖3　YILW-IDO 4-HIL產(chǎn)量Fig.3 Production of 4-HIL with YILW-IDO

2.4.1α-KG的添加量對(duì)4-HIL合成的影響

IDO在催化過(guò)程中需底物α-KG.YILW-IDO在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，培養(yǎng)基中仍含（26.5±0.5）mmol/L L-Ile，但 4-HIL產(chǎn)量?jī)H（13.7±0.4）mmol/L，而 YILW-pXMJ19，L-Ile產(chǎn)量（39.1±1.2）mmol/L，推測(cè)可能因培養(yǎng)基中底物α-KG不足使得YILW-IDO合成的LIle未反應(yīng)完全而積累.

因此，研究了不同α-KG的添加量對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖 4所示.當(dāng)α-KG濃度為40，mmol/L時(shí)，4-HIL產(chǎn)量最高，但仍有少量L-Ile積累.隨著α-KG添加量的增加，盡管無(wú)L-Ile積累但4-HIL產(chǎn)量逐漸降低.前期研究表明，α-KG濃度為40～60，mmol/L時(shí)，重組IDO活性并未受到抑制.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，α-KG添加量為45，mmol/L和50，mmol/L時(shí) YILW-IDO生物量較α-KG添加量為 40，mmol/L時(shí)低 9.6%，和 14.2%，（結(jié)果未顯示），這可能是該條件下4-HIL合成量低的原因.

圖4　α-KG濃度對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響Fig.4　Effects of different concentration of α-KG on 4-HIL production

2.4.2FeSO4的添加量對(duì)4-HIL合成的影響

IDO屬于 Fe2+及α-KG依賴的羥化酶家族，因此，研究了不同F(xiàn)e2+添加量對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖 5所示.隨著 Fe2+添加量的增加 4-HIL產(chǎn)量逐漸升高，F(xiàn)e2+濃度為4，mmol/L時(shí)，4-HIL產(chǎn)量達(dá)到最高，隨后逐漸降低.前期研究表明，當(dāng) Fe2+高于4，mmol/L時(shí)，重組 IDO活性降低，因此 Fe2+添加量為5，mmol/L和6，mmol/L時(shí)，可能因IDO活性受到抑制而使得4-HIL產(chǎn)量降低.

圖5　Fe2+濃度對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of different concentration of Fe2+on 4-HIL production

2.4.3α-KG和FeSO4添加量對(duì)4-HIL合成的影響

α-KG和FeSO4添加量對(duì)4-HIL合成量的影響及其交互作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和表2.結(jié)果表明：α-KG和 FeSO4均能顯著影響 4-HIL的合成（P＜0.05），當(dāng)α-KG添加量一定時(shí)，F(xiàn)eSO4添加量為4，mmol/L條件下 4-HIL合成量最高；當(dāng) FeSO4添加量一定時(shí)，α-KG添加量為40，mmol/L條件下4-HIL合成量最高；α-KG和FeSO4添加量分別為40，mmol/L和4，mmol/L時(shí)4-HIL達(dá)到最高值，為（35.7±1.0），mmol/L.由表2可知，α-KG和 Fe2+對(duì)4-HIL合成的影響不具有交互作用（P＞0.05）.

表1　α-KG和FeSO4添加量對(duì)4-HIL合成的影響Tab.1 Effects of different concentration of FeSO4and α-KG on 4-HIL production

表2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab.2 Variance analysis of the results

3　討 論

目前工業(yè)化生產(chǎn) 4-HIL所采用的胡蘆巴種子提取法具有收率低、成本高等不足.IDO的發(fā)現(xiàn)使得具有生物學(xué)活性的（2S，3R，4S）-4-HIL高效合成成為可能［1］.

本文在前期研究［9］的基礎(chǔ)上，以 L-Ile生產(chǎn)菌株C.，glutamicum YILW 為出發(fā)菌株通過(guò)過(guò)表達(dá) ido基因能夠成功合成 4-HIL.Smirnov等［13］以 E.coli MG1655為出發(fā)菌株，通過(guò)敲除α-酮戊二酸脫氫酶編碼基因以及異檸檬酸裂解酶編碼基因以增加α-KG的積累量，在此基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)ido并在發(fā)酵過(guò)程中添加L-Ile，在優(yōu)化條件下其轉(zhuǎn)化率為 0.82，mol/mol.本文利用C.glutamicum YILW-IDO自身合成的L-Ile并向培養(yǎng)基中添加α-KG，在初步優(yōu)化條件下其轉(zhuǎn)化率為0.86，mol/mol.

IDO屬于α-KG和 Fe2+依賴型羥化酶家族.由IDO的酶反應(yīng)式可知，1，mol α-KG和L-Ile可生成等物質(zhì)的量的 4-HIL.搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含質(zhì)粒pXMJ19的 YILW 可生成 L-Ile（39.1±1.2）mmol/L，因此在發(fā)酵過(guò)程中添加 40，mmol/L的α-KG使得 4-HIL產(chǎn)量達(dá)到最高值.值得注意的是，盡管發(fā)酵過(guò)程中不添加α-KG，仍可積累4-HIL（14.3±0.9）mmol/L（圖4），其原因可能是菌體可利用自身合成的α-KG與L-Ile反應(yīng)生成4-HIL.Yi等［14］在研究利用脯氨酸羥化酶（屬于α-KG和Fe2+依賴型羥化酶家族）合成羥脯氨酸時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌體可利用自身生成的α-KG合成羥脯氨酸.

α-KG 和 Fe2+依賴型羥化酶家族含 His1，XAsp/Glu-Xn-His2基序，該基序中的 His、Asp/Glu及His絡(luò)合Fe2+后形成活性中心.本文所利用的IDO亦含 His1，X-Asp-Xn-His2基序，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明適量增加Fe2+添加量可有效提高4-HIL產(chǎn)量.

研究［4］表明維生素 C對(duì) IDO活性亦有一定影響，但通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)添加不同量的維生素 C并未對(duì)4-HIL產(chǎn)量產(chǎn)生影響.

本文結(jié)果表明，來(lái)源于 B.，thuringiensis TCCC 11826的 ido能夠在 L-Ile生產(chǎn)菌株 C.，glutamicum YILW中成功表達(dá)出有活性的IDO并利用其生成的L-Ile催化生成 4-HIL，實(shí)現(xiàn) 4-HIL的生物合成.α-KG和Fe2+添加量均影響 4-HIL的合成，在α-KG和Fe2+添加量分別為40，mmol/L和4，mmol/L條件下，4-HIL產(chǎn)量達(dá)（35.7±1.0）mmol/L.本研究可為 4-HIL及其他氨基酸衍生物的生物制造提供理論依據(jù).

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責(zé)任編輯：郎婧

Synthesis of 4-hydroxyisoleucine with Corynebacterium glutamicum via Biotransformation

WEN Bing，ZHANG Chenglin，MA Jie，CHEN Pengjie，XIE Xixian，XU Qingyang，CHEN Ning
（National and Local United Engineering Laboratory of Metabolic Control Fermentation Technology，Tianjin Engineering Laboratory of Efficient and Green Amino Acid Manufacture，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

4-hydroxyisoleucine（4-HIL）possesses glucose-dependent insulinotropic activities.L-isoleucine dioxygenase encoded gene ido from Bacillus thuringiensis TCCC11826 was cloned and expressed in L-isoleucine produced strain Corynebacterium glutamicum YILW to synthesize 4-hydroxyisoleucine via biotransformation.The effect of α-ketoglutarate（α-KG）and Fe2+on 4-HIL synthesis was also studied.C.glutamicum YILW-IDO expressed active IDO was constructed，which could directly convert its endogenous L-isoleucine and α-ketoglutarate in the medium into 4-HIL.Moreover，4-HIL synthesis could be affected by α-KG and Fe2+.After 50，h fermentation，（35.7±1.0）mmol/L 4-HIL was produced by adding 40，mmol/L α-KG and 4，mmol/L Fe2+.This research can lay a theoretical foundation for the microbial manufacture technology of 4-HIL and amino acid derivatives.

4-hydroxyisoleucine；L-isoleucine dioxygenase；Corynebacterium glutamicum；biotransformation

Q815

A

1672-6510（2016）04-0009-06

10.13364/j.issn.1672-6510.20150182

2015-10-27；

2016-02-26

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31300069）；天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目（201510057063）

溫 冰（1977—），女，天津人，博士研究生，副研究員；通信作者：陳 寧，教授，ningch@tust.edu.cn.

數(shù)字出版日期：2016-05-19；數(shù)字出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1355.N.20160519.1030.006.html.